Совершенствование биообъекта методами клеточной инженерии реферат
Обновлено: 05.07.2024
В течение многих лет мутагенез и селекция успешно применялись и будут широко применяться при совершенствовании биообъектов в дальнейшем.
Перспективы клеточной инженерии заключаются прежде всего в том, что с ее помощью возможно получение межвидовых и межродовых гибридных культур микроорганизмов, а также гибридных клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами. Далее необходимо сделать оговорку, что материал, относящийся к получению гибридов между лимфоцитами и опухолевыми клетками излагается в гл. 10. В данной главе техника клеточной инженерии рассматривается применительно к микроорганизмам и в соответствии с теми целями, которые ставятся перед ними как биообъектами. В качестве наиболее простою примера можно взять микроорганизмы прокариот (с одной хромосомой в клетке).
Таким образом, первый этап работы связан с удалением у микроорганизмов клеточной стенки. У прокариот — эубактерий и актиномицетов — многоклеточных бактерий клеточная стенка состоит из жесткого полимера пептидогликана, поддерживающего форму клетки и обеспечивающего защиту цитоплазматической мембраны от перепада осмотического давления между внешней средой и цитоплазмой.
Пептидогликан может быть расщеплен с помощью ферментов (гидролаз пептидогликана), из которых самым известным является лизоцим, расщепляющий полисахаридные нити пептидогликана. Источником лизоцима как лабораторного реагента является белок куриного яйца.
Рис. 2. Формирование протопластов у прокариот:
1 — ферментативная деградация клеточной стенки; 2 — слияние протопластов; 3 — ломка и рекомбинация хромосом, образование диплоидов; 4 — образование гаплоидов с рекомбинантной хромосомой; 5 — регенерация протопластов
Если биообъект принадлежит к микроскопическим (плесневым и дрожжевым) грибам, то для получения протопластов используют, как правило, не лизоцим, а комплексный ферментный препарат, выделенный из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia. Связано это с тем, что состав клеточной стенки у грибов более сложен, чем у бактерий. Она состоит из таких полимеров, как хитин, глюканы, маннопротеин, для каждого из которых необходим свой, деградирующий его фермент. Известно, что по набору ферментов и их каталитической активности наиболее эффективен желудочный сок виноградной улитки в ранний весенний сезон, когда улитки появляются на виноградных плантациях, но их желудок еще не заполнен перевариваемыми виноградными листьями. Неочищенный экстракт из пищеварительного тракта виноградной улитки лиофильно высушивают и используют как комплексный ферментный препарат для получения протопластов из клеток грибов.
Следующий этап работы состоит в объединении суспензий двух образцов протопластов, принадлежащих разным штаммам или разным видам, в более редких случаях — даже разным родам. Добиться слияния двух протопластов разного происхождения — довольно сложная задача. Частота слияния резко повышается при добавлении к протопластам полиэтиленгликоля, обладающего свойствами детергента. В случае прокариот образующиеся протопласты имеют двойной набор хромосомного материала, т. е. это протопласты с двумя хромосомами. В гипертонической среде такие протопласты сохраняют свою целостность.
Известно, что среди актиномицетов есть принадлежащие к разным видам продуценты антибиотиков гликозидной структуры с варьирующими агликонами и сахарами. Так, антибиотик эритромицин имеет 14-членный макроциклический агликон и два сахара (дезозамин и кладинозу), присоединенных к нему гликозидной связью (см. с. 110); а у антибиотиков — антрациклинов агликон состоит из четырех сконденсированных углеродных шестичленных колец, соединенных с аминосахаром (см. с. 112).
С помощью клеточной инженерии были получены продуценты таких антибиотиков, у которых макролидный агликон эритромицина был связан с углеводной частью, соответствующей антрациклинам, и наоборот, антрациклиновый агликон с сахарами, свойственными эритромицину. Аналогичные работы ведутся по получению гибридных беталактамных антибиотиков.
В заключение отметим, что протопласты — основной объект, которым оперирует клеточная инженерия, довольно широко используются и в генетической инженерии. При этом обмен молекулами и фрагментами молекул ДНК у протопластов достигается легче, чем при трансформации клеток с их более сложной оболочкой.
Биологическая библиотека - материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.
Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.
Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.
Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.
Введение
В своей работе я раскрываю тему достижений генной инженерии и биотехнологии. Возможности, открываемые генетической инженерией перед че¬ловечеством как в области фундаментальной науки, так и во мно¬гих других областях, весьма велики и нередко даже революционны. Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое произ¬водство нужных белков, значительно облегчает технологическиепроцессы для получения продуктов ферментации — энзимов и аминокислот, в будущем может применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения наследственных болезней человека. Таким образом, генная инженерия, будучи одним из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствует ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сель¬скохозяйственная,энергетическая, экологическая.
Но особенно большие возможности генная инженерия открывает перед медици¬ной и фармацевтикой, поскольку применение генной инженерии и гибридомных методов может привести к коренным преобразо¬ваниям медицины. Многие болезни, для которых в настоящее время не существует адекватных методов диагностики и лечения (раковые, сердечно-сосудистые, вирусные и паразитные инфекции,нервные и умственные расстройства), с помощью генной инжене¬рии и биотехнологии станут доступны и диагностике, и лечению. Под влиянием биотехнологии медицина может превратиться из преимущественно эмпирической в фундаментально теоретически обоснованную дисциплину с ясным пониманием происходящих в организме молекулярных и генетических процессов.
Биотехнология
Возникновение биотехнологии
Современнаябиотехнология — это новое научно-техническое направление, возникшее в 60—70-х годах нашего столетия. Осо¬бенно бурно она стала развиваться с середины 70-х годов после первых успехов генно-инженерных экспериментов. Несмотря на столь короткий срок своего существования, биотехнология прив¬лекла пристальное внимание как ученых, так и широкой общест¬венности. Биотехнология, в сущности, не что иное, как использо¬ваниекультур клеток бактерий, дрожжей, животных или растений, метаболизм и биосинтетические возможности которых обеспечивают выработку специфических ве¬ществ. Биотехнология на основе применения знаний и методов биохимии, генетики и химической техники дала возможность получения с помощью легко доступных, возобновляемых ресурсов тех веществ и которые важны для жизни и благосостояния.
В промышленном масштабеподобная биотехнология представляет собой уже биоиндустрию.
Одно из объяснений живого интереса к биотехнологии можно найти прежде всего в том, что именно к этому времени была осоз¬нана действительная острота глобальных проблем, вставших перед человечеством: нехватка продовольствия, ограниченность энер¬гии и минеральных ресурсов, резкое, почти катастрофическое, ухудшение окружающей среды и, какследствие, ухудшение здо¬ровья человека. Стало понятно, что огромный индустриально-про¬мышленный комплекс не только не помогает решить эти проблемы, но и еще более усугубляет их. Возникла настоятельная практическая потребность в принципиально новых технологиях и новых способах организации производства. В это же время физико-хими¬ческая биология в союзе с генетикой, молекулярной биологией имикробиологией предложили новую технологию, как будто способ¬ную помочь в решении этих проблем. Тем более что первые опыты биотехнологического производства дали неплохие результаты и потому позволили строить оптимистические планы на будущее.
новая биотехнология—это больше научно-техническое новаторское направление, чем производственное, хотя и с довольно большими производственными перспективами. Однако это такоенаучно-техническое направление, которое само выступает производства, причем такого производства, которое уже не может сделать бук¬вально ни одного шага без глубоких фундаментальных и система¬тических прикладных научных разработок. Подчеркивая специфику новой технологии, т. е. отличая ее и от сельского хозяйства, и от традиционной промышленности, можно так.
Чтобы читать весь документ, зарегистрируйся.
Связанные рефераты
Новые методы и объекты моделирования
. Гл. 5. Некоторые новые методы и объекты Гл. математического.
Дение 1.История генетической инженерии 2. Ген
. 1.История генетической инженерии 2. Генетическая.
12 Стр. 50 Просмотры
Клеточная инженерия
. тему: Клеточная инженерия в создании микроорганизмов и клеток.
Клеточная инженерия
. Клеточная инженерия, совокупность методов, используемых для.
Клеточная инженерия
. КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Традиционно для получения более активных.
3. Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии.
Клеточная инженерия – это техника обмена фрагментами ДНК, участками хромосом у прокариот и любыми хро- мосомами у эукариот, независимо от удаленности организмов в эволюционном плане.
В случае клеточной инженерии нет видовых и родовых барьеров, т.е. в клеточной инженерии осуществляют обмен генетическим материалом между организмами, которые в обычных условиях не вступают в половой процесс, что от- крывает большие возможности в создании биообъектов.
В случае с клеточной инженерией исследователь оперирует целыми клетками.
Техника клеточной инженерии основана на технике протопластирования.
Протопласт– это клетка без клеточной стенки, окруженная цитоплазматической мембраной. Протопласт получают, обрабатывая клетку ферментами, которые гидролизуют полимеры в клеточной стенке.
1. Выбор биообъектов
Берут биообъект, продуцирующий целевой продукт (например, продуцент цефалоспоринов гриб (эукариот) Acre-
monium chrysogenum и с другой стороны биообъект, которому хотят придать свойство продуцировать целевой про- дукт (например, прокариот E. coli ).
2. Обработка клеточных стенок ферментами.
Прокариоты: лизоцим
Эу (микроскопические грибы) : ферментный препарат из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix po-
matia.
3. Стабилизация протопластов
Гипертонический раствор, состоящий из 20%-ных маннита/ сахарозы или 10% р-ра хлорида натрия.
Ионная сила раствора такова, что клетка находится в состоянии тургора, но не лопается, при этом раствором также производится отмывание фермента.
4. Слияние протопластов.
Слияние суспензий протопластов производится в среде ПАВ в полиэтиленгликоле, который нарушает клеточную цитоплазму, и ДНК двух протопластов объединяются. Этот процесс происходит постепенно.
Для облегчения клетке процесса фузии (слияния) клетку необходимо сделать компетентной. Для этого:
1. обрабатывают клетку тяжелыми металлами
2. производят быструю заморозку и оттаивание клеток
3. обрабатывают клетки ферментами.
При слиянии получается протопласт с двумя наборами хромосом – диплоидный набор (при образовании гибрида происходит рекомбинация ДНК).
5. Регенерация (восстановление клеточной стенки протопласта).
Полученный гибрид засевают на плотную питательную среду с необходимыми компонентами для прокариот и эу- кариот. При этом происходит восстановление клеточной оболочки.
Для того, чтобы отличить гибридную клетку от негибридной, необходимо на уровне 4-ой стадии включить еще один протопласт, несущий маркер. Маркер– это участок гена, образующий какой-либо фермент, заявляющий о себе своеобразным путем при высеве на питательную среду.
В данном случае маркером является β-лактамаза. В среду добавляют бензилпенициллин и вырастают только те клетки, которые содержат β-лактамазу, расщепляющую его. А так как β-лактамазу содержат только клетки гибриды, то на среде и вырастают только гибриды.
4. Создание новых биообъектов методами клеточной и генетической инженерии (технология рекомби-
нантной ДНК).
Отличие клеточной инженерии от генной инженерии в том, что в генной инженерии имеют дело с изолированны- ми ДНК, с которыми работают in vitro.
Специфическая резистентность организма обусловлена видовыми и индивидуальными особенностями организма при воздействии на него как активной (введение вакцин или анатоксинов), так и пассивной (введение иммунных сы- вороток) иммунизации против возбудителей инфекционных заболеваний.
Органы иммунной системы подразделяются на центральные и периферические. К центральным органам от- носятся вилочковая железа (тимус), костный мозг, и пейеровы бляшки, в которых осуществляется созревание лимфо- цитов. Лимфоциты поступают в кровь и лимфу и заселяют периферические органы: селезенку, лимфатические узлы, миндалины и скопления лимфоидной ткани в стенках полых внутренних органов пищеварительной, дыхательной сис- тем и мочеполового аппарата.
Различают две основные формы иммунной защиты: гуморальный и клеточный иммунитет.
Гуморальный иммунитет.
Это защита от большинства бактериальных инфекций и нейтрализация их токсинов. Он осуществляется В-
лимфоцитами, которые образуются в костном мозге. Они являются предшественниками плазмоцитов – клеток, ко- торые секретируют или антитела или иммуноглобулины. Антитела или иммуноглобулины обладают свойством спе- цифически связывать антигены и обезвреживать их.
Антигены — это чужеродные вещества, внедрение которых в организм вызывает иммунный ответ. Антигенами могут быть вирусы, бактерии, опухолевые клетки, неродственные пересаженные ткани и органы, высокомолекуляр- ные соединения (белки, полисахариды, нуклеотиды и др.), попавшие в другой организм.
Клеточный иммунитет.
Это защита от большинства вирусных инфекций, отторжение чужеродных пересаженных органов и тканей. Кле- точный иммунитет осуществляется
Т- лимфоцитами образующимися в вилочковой железе (тимусе), макрофагами и другими фагоцитами.
В ответ на антигенный раздражитель Т-лимфоциты трансформируются в крупные делящиеся клетки – иммунобла- сты, которые в конечной стадии дифференцировки превращаются в клетки-киллеры (to kill — убивать), обладающие цитотоксической активностью к клеткам-мишеням.
Т-киллеры разрушают опухолевые клетки, клетки генетически чужеродных трансплантатов и мутированные соб- ственные клетки организма. Кроме клеток-киллеров в популяции Т-лимфоцитов выделяют и другие клетки, участ- вующие в регуляции иммунного ответа.
Т-хелперы (to help — помогать), взаимодействуя с В-лимфоцитами, стимулируют их превращение в плазмоциты, синтезирующие антитела.
Т-супрессоры (suppression-подавление) блокируют Т-хелперы, тормозят образование В-лимфоцитов, что позволяет снизить силу иммунного ответа.
Т-усилители – способствуют иммунному ответу клеточного типа.
Т- дифференцирующие клетки – изменяют дифференцировку стволовых клеток гемопоэза в миелоидном или лимфоидном направлениях.
Т-клетки иммунологической памяти – стимулированные антигеном Т-лимфоциты, способные сохранять и пере- давать другим клеткам информацию о данном антигене.
Лейкоциты, пройдя через стенку капилляров, проникают в те ткани организма, которые подвержены воспа- лительному процессу, где они захватывают и пожирают микроорганизмы, отмершие клетки организма и инородные частицы. Открывший это явление русский ученый И. И. Мечников назвал этот процесс фагоцитозом, а клетки, по- жирающие бактерии и чужеродные частицы — фагоцитами. Клетки-фагоциты распространены по всему организму.
ИММУНИТЕТ – это врожденная или приобретенная невосприимчивость организма к проникшим в него инород- ным веществам или инфекционным агентам.
Различают врожденный и приобретенный (естественный и искусственный) иммунитет.
Врожденный иммунитет представляет собой невосприимчивость человека к микроорганизмам, вызывающим за- болевания. Это видовой признак, передающийся по наследству. Видовой врожденный иммунитет является наиболее прочной формой невосприимчвости (чума собак и другие болезни животных).
Приобретенный естественно или искусственно иммунитет вырабатывается самим организмом в течение жизни и может быть активным или пассивным:
1. Приобретенный естественный активный иммунитет развивается после перенесенной инфекционной бо- лезни (постинфекционный). При этом организм сам активно вырабатывает антитела. Этот иммунитет не передается по наследству, но является очень стойким и может сохраняться многие годы (корь, ветрянка)
2. Приобретенный естественный пассивный иммунитет обусловлен передачей антител от матери ребенку че- рез плаценту или с грудным молоком, длительность этого иммунитета не превышает 6 месяцев.
3. Приобретенный искусственный активный иммунитет , развивается в организме после вакцинации. Вакци-
ны — препараты, содержащие убитые, или ослабленные живые микроорганизмы, вирусы, или обезвреженные про- дукты их жизнедеятельности — анатоксины. В результате действия на организм антигенов, в нем образуются антите- ла. В процессе активной иммунизации организм становится невосприимчивым к повторному введению соответст- вующего антигена.
4. Приобретенный искусственный пассивный иммунитет создается при введении в организм иммунных сыво- роток, полученных из крови человека, перенесшего данное заболевание, или из крови животного, привитого опреде- ленной вакциной и содержащих антитела, способные обезвредить соответствующих возбудителей болезни. Такая форма иммунитета наступает быстро, через несколько часов после введения иммунной сыворотки. Сыворотку вводят людям, которые находились в контакте с больным, но сами не были привиты от данного заболевания (корь, краснуха,
паратит и т.д.). После укуса незнакомой собаки в течении 1-х максимум 3-х суток ставят антирабическую сыворотку против бешенства.
6. Виды инфекционных агентов и их локализация в организме
Все известные инфекционные агенты, вызывающие заболевания у человека, разделяются на 5 групп: вирусы, бак- терии, грибы, протозойные, гельминты. Их можно обнаружить в разных участках тела. Уничтожение их происходит с помощью разных механизмов иммунологической защиты хозяина. С патогенетической точки зрения важно разделе- ние инфекционных агентов по месту их преимущественного роста и размножения. С этих позиций выделяют 2 основ- ные группы микроорганизмов:
1. Интрацеллюлярные (внутриклеточные).
2. Экстрацеллюлярные (внеклеточные).
Следует отметить, что фактически все патогены проходят экстрацеллюларную фазу, где они становятся уязвимы для действия антител. В то же время интрацеллюларная фаза развития микроорганизмов остается недоступной для антител и в этом случае основная роль в защите отводится атаке Т-лимфоцитов.
Локализация возбудителя
Интрацеллюлярные
Экстрацеллюлярные
Цитоплазматические
Везикулярные
Интерстициональное простран- ство, кровь, лимфа
Эпителиальная по- верхность
Вирусы
Хламидии
Риккетсии – внутриклеточные паразиты
Листерии – род грамм+ па- лочковидных бак-й
Протозойные – вызв про- стейшими
Микобактерии
Сальмонеллы
Лейшмании
Листерии
Трипаносомы
Легионелла
Криптококки
Гистоплазмы
Иерсиния пестис
Вирусы
Бактерии
Протозойные
Грибы
Гельминты
Гонококки
Гельминты
Микоплазмы
Пневмококки
Холерный вибрион
E.coli
Candida alb.
Helicobacter pylori
7. Виды иммунного ответа на первичную инфекцию
Протективный ответ на первичную инфекцию обеспечивается в основном за счет следующих механизмов
Локализация возбудителя
Интрацеллюлярные
Экстрацеллюлярные
Цитоплазматические
Везикулярные
Интерстициональное пространство, кровь, лимфа
Эпителиальная поверхность
Вирусы
Хламидии
Риккетсии
Листерии
Протозойные
Микобактерии
Сальмонеллы
Лейшмании
Листерии
Трипаносомы
Легионелла
Криптококки
Гистоплазмы
Иерсиния пестис
Вирусы
Бактерии
Протозойные
Грибы
Гельминты
Гонококки
Гельминты
Микоплазмы
Пневмококки
Холерный вибрион
E.coli
Candida alb.
Helicobacter pylori
Протективный ответ на первичную инфекцию
СД 8 Т-клетки
Т-клеточный им- мунитет
Антитела
Антитела
(особенно IgA)
NK-клетки
Активированные макрофаги
Комплемент
Фагоцитоз
АЗКЦ (антитело- зависимая клеточная ци- тотоксичность)
Следует подчеркнуть, что в элиминации внеклеточных, в основном пиогенных микроорганизмов (пневмококки, стафилококки, стрептококки и др.) главная роль принадлежит триаде: нейтрофилу, иммуноглобулину и комплементу,
причем гибель микроба происходит в нейтрофиле, а комплемент и иммуноглобулины (опсонины) усиливают этот процесс.
В элиминации внутриклеточных возбудителей главная роль так же принадлежит триаде: Т-лимфоцитам, NK- клеткам и макрофагам, причем все эти 3 группы клеток обладают способностью синтезировать цитокины (IFN-g, ИЛ-
1, ИЛ-2, ФНО-a, и др.), резко усиливающих их функциональные свойства.
В ответе на впервые попавшую в организм человека инфекцию выделяют 3 фазы иммунного ответа, отличающиеся как механизмами распознавания антигена, так и эффекторными механизмами.
Фазы иммунного ответа
При первом попадании возбудителя в организм человека включаются механизмы врожденного и адаптивного им- мунного ответа.
Основные характе- ристики
Фазы иммунного ответа
Немедленная
(0-4 часа)
Ранняя
(4-96 часов)
Поздняя
(позже 96 часов)
Неспецифическая врожден-
ная
Нет иммунологической памя- ти
Нет специфических Т-клеток
Неспецифическая и специ-
фическая (индуцированная)
Нет иммунологической па- мяти
Нет специфических Т-клеток
Специфическая (индуцирован-
ная)
Индуцированная
Есть иммунологическая память
Специфические Т-клетки
Барьерные функции Кожа
Эпителий
Локальное воспаление
TNF-a
IgA-антитела
IgE-антитела на тучных клетках
Ответ на экстра- целлюлярные пато- гены
Фагоцитоз
Альтернативный путь акти- вации комплемента
Активация комплемента
IgG-антитела
IgM-антитела
Классический путь активации комплемента
Ответ на интрацел- люлярные патогены
Макрофаги
Активация макрофагов
IL-1, IL-6, TNF-a, IL-12
Т-клеточная активация макрофагов с помощью
IFN-g
Ответ на вирус- инфицированные клетки
NK-лимфоциты
IFN-g, INF-b
NK-активированные клетки
IL-12
CD8T-клетки
IFN-g
В соответствии со временем возникновения выделяют следующие фазы:
–
в первые 0 – 4 часа после попадания возбудителя активируются механизмы врожденного иммунитета. Ин- фекционные агенты распознаются неспецифическими эффекторами (предсуществующими) и происходит удаление части инфекционного агента;
–
спустя 4 – 96 часов развивается ранний индуцированный ответ адаптивного иммунитета, который сопрово- ждается рекрутированием эффекторных клеток, наступлением стадии распознавания антигена и активации эффек- торных клеток, что также приводит к удалению возбудителя;
–
позже 96 часов имеет место поздний адаптивный ответ на инфекцию, который проявляется в транспорти- ровке антигена к лимфоидным органам, распознавании антигена нативными Т- и В-клетками, клональной селекции и дифференцировке их в эффекторные клетки, способные к удалению возбудителя.
В случае повторного попадания того же самого возбудителя, т.е. при реинфицировании, удаление возбудителя мо- жет происходить с большей скоростью за счет сохранения протективного иммунитета и иммунологической памяти.
Протективный иммунитет – это ответ на реинфицирование путем распознавания антигена предсуществующими антителами (преформированными) и эффекторными Т-клетками с последующим удалением возбудителя.
Иммунологическая память – проявляется в том, что в ответ на реинфицирование происходит распознавание анти- гена с помощью В- и Т-лимфоцитов памяти. Это приводит к быстрой экспансии антигенспецифических лимфоцитов, дифференцировке их в эффекторные клетки и удаление инфекционного агента.
Презентация на тему: " Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии" — Транскрипт:
1 ГБОУ ВПО Тюменский ГМУ Минздрава России
3 I этап ( ) - Г. Хаберландт, Х. Фёхтинг, С. Рехингер. Они пытались культивировать в растворе сахарозы различные растительные ткани. Для сегментов цветоносов одуванчика и изолированних почек тополя был получен первичный каллус. Каллус – это недифференцированные клетки, являющиеся тотипотентными и способными поэтому дать начало целому растению.
4 II этап ( гг.) - создание питательних сред для культивирования тканей животних. Эти среды были природного происхождения и содержали, как правило, плазму крови и зародышевую жидкость. Попытки вырастить изолированные растительные ткани на искусственних питательних средах, содержащих растительные экстракты, оказались неудачными. III этап ( гг.). Американский ученый В. Робинс и немецкий ученый В. Котте показали возможность культивирования на твердых питательних средах меристемы кончиков корня томатов и кукурузы. Подлинное развитие метода культуры растительних тканей началось с 1932 г.
5 IV этап ( гг.) связан с именем французского ученого Р.Готре, который показал возможность долгого культивирования в условиях in vitro растительних тканей за счет периодического пересаживания их на свежую питательную среду. Культура ткани корня моркови, изолированная Р.Готре в 1938 г. 30 дней выращивания на питательной среде.
6 V этап ( ) 1)С открытием в 1955 г. цитокининов была получена возможность стимулировать деление клеток ткани сердцевинной паренхимы табака, лишенной проводящих пучков и камбия. 2) Было оценено положительное действие натуральних экстрактов типа эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции процессов морфогенеза в культуре каллусних тканей и клеточних суспензий. 3) В 1959 г. был предложен метод выращивания большой массы клеточних суспензий.
7 VI этап ( ). Наиболее важным событием этого периода была разработка Е. Кокингом метода получения ферментативным путем изолированних протопластов из корней и плодов томата. В 1970 г. С. Пауэром было осуществлено искусственное слияние протопластов, что открыло новый путь к созданию соматических гибридов. В этот же период был разработан метод клонального микроразмножения растений с использованием меристемной культуры. Основоположник – французский ученый Ж. Морель. Микроклональное размножение растений малины красной в стеклянних стаканчиках
8 VII этап ( по настоящее время). Продолжается быстрое развитие техники in vitro, изучение биологии культивируемых объектов, разрабатываются методы : 1) электрослияния изолированних протопластов, 2) мутагенеза и клеточной селекции, 3) получения гаплоидних растений, 4) совершенствуется метод глубинного культивирования клеток с использованием изолированних протопластов и векторов, созданних на основе Ti- и Ri-плазмид.
9 1) Использование изолированних клеток в селекции растений in vitro 2) Использование культуры изолированних тканей для размножения и оздоровления посадочного материала 3) Использование способности изолированних растительних клеток продуцировать ценные для медицины, парфюмерии и косметики вторичные метаболиты (алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др.) 4) Протопласты – основной объект, которым оперирует клеточная инженерия, широко используется и в генетической инженерии
10 1) Необходимым условием работы с культурой изолированних тканей является соблюдение строгой стерильности. 2) Богатая питательная среда – прекрасный субстрат для развития микроорганизмов 3)Изолированные фрагменты ( экспланты ) легко поражаются микроорганизмами. 4)Необходимо тщательно стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. 5)Все манипуляции с изолированными тканями проводят в стерильными инструментами в стерильних помещениях (ламинар-боксе)
11 Питательные среды для культивирования изолированних клеток и тканей должны включать в себя все необходимые макро- и микро- элементы, а также : 1)Витамины 2) Углеводы (сахароза или глюкоза) 3) Гормоны или их синтетические аналоги (индукторы клеточних делений) 4)Гидролизат казеина 5)Аминокислоты
12 1) Освещение. Большинство каллусних тканей получают в темноте или при рассеянном свете. 2) Морфогенез ткани проводят на свету в климатической камере с учетом фотопериодизма. 3) Оптимальная влажность 60-70% 4) Оптимальная температура град.
13 Техника клеточной инженерии основана на технике протопластирования. Протопласт – содержимое растительной клетки, за исключением внешней клеточной оболочки (клеточной стенки), однако при сохранении клеточной (плазматической) мембраны. Протопласт получают, обрабатывая клетку ферментами, которые гидролизуют полимеры в клеточной стенке. Таким методом уже в 1919 г. были получены протопласты клеток грибов в результате обработки их клеточних стенок желудочным соком улитки. В микробиологических экспериментах протопласты получают путем разрушения клеточних стенок бактерий ферментом лизоцимом. Источником лизоцима как лабораторного реагента является белок куриного яйца.
14 Для культивирования протопластов используются два методических приема : 1)Инкубирование в каплях жидкой среды. 2) Помещение в агаровый слой. В этом случае суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45С. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28С. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга.
15 Схема получения каллусной и суспензионной культур растений.
16 Этапы работы: 1. Выбор биообъектов. Берут биообъект, продуцирующий целевой продукт (например, продуцент цефалоспоринов гриб (эукариот) Acrimonium chrysogenum с другой стороны биообъект, которому хотят придать свойство продуцировать целевой продукт (например, прокариот E. coli ).
17 2. Обработка клеточних стенок ферментами. 3. Стабилизация протопластов. Гипертонический раствор, состоящий из 20%-них маннита или сахарозы, иногда с 10%- ным раствором хлорида натрия. Ионная сила раствора такова, что клетка находится в состоянии тургора, но не лопается. При этом данным раствором также производится отмывание фермента. Превращение суспензии клеток в суспензию протопластов обычно контролируется методом фазово- контрастной микроскопии.
18 4. Слияние протопластов - это своеобразный метод соматической гибридизации. В настоящее время в качестве эффективних фьюзогенов (индукторов слияния) используют полиэтиленгликоль (ПЭГ) и растворы с рН 9-11 и высокой концентрацией ионов кальция. Механизм слияния протопластов при использовании ПЭГ состоит в высокой концентрации этого вещества (20-30%), что способствует поглощению всей свободной воды между протопластами, вызывая их слияние. Кроме того, поглощение свободной воды индуцирует образование пор в мембране, через которые перетекает внутриклеточное содержимое. Повреждения мембран обратимы, поэтому слившиеся протопласты регенерируют клеточную стенку. Механизм слияния протопластов при использовании ПЭГ состоит в высокой концентрации этого вещества (20-30%), что способствует поглощению всей свободной воды между протопластами, вызывая их слияние. Кроме того, поглощение свободной воды индуцирует образование пор в мембране, через которые перетекает внутриклеточное содержимое. Повреждения мембран обратимы, поэтому слившиеся протопласты регенерируют клеточную стенку.
20 5. Регенерация (восстановление клеточной стенки протопласта). Полученный гибрид засевают на плотную питательную среду с необходимыми компонентами для прокариот и эукариот. При этом происходит восстановление клеточной оболочки. При регенерации протопластов формируются нормальные клетки, часть которых имеет гибридные хромосомы.
21 Для того, чтобы отличить гибридную клетку от негибридной, необходимо на уровне 4-ой стадии (слияния протопластов) включить еще один протопласт, несущий маркер. Маркер – это участок гена, образующий какой- либо фермент, заявляющий о себе своеобразным путем при высеве на питательную среду. В данном случае маркером является β-лактамаза. В среду добавляют бензилпенициллин и вырастают только те клетки, которые содержат β-лактамазу, расщепляющую его.
22 Схема получения и культивирования протопластов из клеток растений из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур.
23 1)Возможность индуцированного слияния и получения соматических гибридов 2)Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. 3) Получение растений, содержащие хлоропласты другого организма. В целом использование изолированних протопластов в генетической реконструкции клетки открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией.
1. Пути совершенствования биообъектов (селекция, мутагенез, клеточная и генная инженерия)
2. 1.Селекция 2.Мутагенез 3.Генетическая инженерия 4.Клеточная инженерия
Методы совершенствования
биообъектов:
1.СЕЛЕКЦИЯ
2.МУТАГЕНЕЗ
3.ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
4.КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
3. селекция и мутагенез- способы Повышения продуктивности микроорганизма как продуцента. Селекционная работа с микроорганизмом
Селекция и мутагенез
СЕЛЕКЦИЯ И МУТАГЕНЕЗ- СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМА КАК ПРОДУЦЕНТА.
СЕЛЕКЦИОННАЯ РАБОТА С МИКРООРГАНИЗМОМ СОСТОИТ:
1.В ПОИСКЕ ПРИРОДНЫХ ФОРМ, КОТОРЫЕ ОБЛАДАЮТ КАКИМИ-ЛИБО ПОЛЕЗНЫМИ
ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА СВОЙСТВАМИ (НАПРИМЕР, СИНТЕЗ БАВ, ВЫСОКАЯ СКОРОСТЬ РОСТА,
СПОСОБНОСТЬ УСВАИВАТЬ ДЕШЕВЫЕ СРЕДЫ И ТАК ДАЛЕЕ),
2. В ДАЛЬНЕЙШЕМ СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ ЕГО,
3. В СОЗДАНИИ НА ЕГО ОСНОВЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАММОВ.
МЕТОДЫ СОВРЕМЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ -ЭТО ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ, КОГДА
МОЖНО ИЗМЕНИТЬ ГЕНЕТИЧЕСКУЮ ПРОГРАММУ МИКРООРГАНИЗМА.
1. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ В ЖИВОЙ КЛЕТКЕ IN VIVO ВКЛЮЧАЕТ
ПОЛУЧЕНИЕ И ВЫДЕЛЕНИЕ МУТАНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ
ОБМЕНА НАСЛЕДСТВЕННОЙ ИНФОРМАЦИЕЙ ЖИВЫХ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК.
2. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ IN VITRO ОСНОВАНО НА ПРИМЕНЕНИИ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ, КОТОРАЯ МАНИПУЛИРУЕТ ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ ОРГАНИЗМА
ДНК.
4. Мутации – наследственные изменения, резкие скачкообразные изменения последовательности нуклеотидов. Реверсия- возвращение к
исходному генотипу (обратное мутирование).
Ревертанты- мутанты, появившиеся в результате реверсии.
Типы мутаций:
1. Делеция (удаление)- выпадение участков хромосомы или нескольких генов.
2. Дупликация- удвоение генов.
3. Амплификация- увеличение количества отдельных генов или группы генов.
4. Транспозиция- перемещение небольших участков генетического материала в
пределах одной хромосомы.
5. Инверсии – изменения чередования генов в хромосоме, вследствие поворота
участка хромосомы на 180 градусов.
6. Летальные мутации - это мутации, захватывающие слишком большие
участки генома, в результате чего организм погибает.
7. Внутригенные мутации:
• точечные – изменение последовательности нуклеотидов в пределах
одного гена.
• транзиция и трансверсия – выпадение или вставка одного или
нескольких оснований, например, транзиция – пурин замещается на
пурин или пиримидин на пиримидин, трансверсия – пурин
замещается на пиримидин.
5. Классификация биообъектов и возможности целевого воздействия на них 1. Макрообъекты: человек, млекопитающие, рептилии, рыбы,
насекомые,
растения
2. Микрообъекты:
2.1.Эукариоты – низшие грибы, водоросли (кроме
нитчатых)
2.2.Прокариоты – актиномицеты, бактерии, синезеленые водоросли.
2.3.Микробиосистемы – ферменты, протопласты.
6. Человек: у него можно воздействовать только на отдельные гены, но против использования человека как биообъекта в плане
1.Макрообъекты:
ЧЕЛОВЕК: У НЕГО МОЖНО ВОЗДЕЙСТВОВАТЬ ТОЛЬКО НА
ОТДЕЛЬНЫЕ ГЕНЫ, НО ПРОТИВ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЧЕЛОВЕКА
КАК БИООБЪЕКТА В ПЛАНЕ МУТАГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ
ВОЗРАЖАЕТ ЭТИКА.
ЧЕЛОВЕКА МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ:
1. ДОНОР КРОВИ – НЕОБХОДИМО, ЧТОБЫ ЧЕЛОВЕК БЫЛ
ЗДОРОВ, КРОВЬ НЕ ДОЛЖНА БЫТЬ ЗАРАЖЕНА, ПРИ ВЗЯТИИ
КРОВИ НЕ ДОЛЖЕН НАРУШАТЬСЯ ГОМЕОСТАЗ.
2. ДОНОР ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ (ПОСЛЕ ЕГО СМЕРТИ).
ЧЕЛОВЕК ЯВЛЯЕТСЯ ПРИМЕРОМ ТОГО, КАКИЕ ПРОДУКТЫ
МОЖНО ПОЛУЧАТЬ (ИНТЕРФЕРОН, ИНСУЛИН, ГОРМОНЫ
ВНУТРЕННЕЙ СЕКРЕЦИИ, РАЗНООБРАЗНЫЕ ФАКТОРЫ РОСТА).
ВОПРОС ЭТИКИ ПРЕПЯТСТВУЕТ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЮ
ЧЕЛОВЕКА КАК БИООБЪЕКТА.
7. Млекопитающие: совершенствование млекопитающих как биообъектов сомнительно, хотя в принципе, можно добиться увеличения
1.Макрообъекты:
МЛЕКОПИТАЮЩИЕ: СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ КАК БИООБЪЕКТОВ СОМНИТЕЛЬНО,
ХОТЯ В ПРИНЦИПЕ, МОЖНО ДОБИТЬСЯ УВЕЛИЧЕНИЯ
ПРОДУКЦИИ ИНСУЛИНА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗОЙ
СВИНЕЙ ИЛИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА.
РЕПТИЛИИ: ЯД ЗМЕЙ ЛУЧШЕ СОБИРАТЬ ВЕСНОЙ.
РАСТЕНИЯ: СЕЛЕКЦИЯ И ОТБОР – ЕДИНСТВЕННЫЙ ПУТЬ ИХ
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ДО НАСТОЯЩЕГО ВРЕМЕНИ. ЧТОБЫ
УВЕЛИЧИТЬ ВЫХОД ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА, СЕГОДНЯ
ИСПОЛЬЗУЮТ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК ПОЛУЧАЮТ БИОЖЕНЬШЕНЬ, СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ И ДР.
8. Эукариоты и прокариоты: главные успехи при селекции и отборе получены у микроорганизмов, т.к. они легко размножаются, имеют
2.Микрообъекты:
ЭУКАРИОТЫ И ПРОКАРИОТЫ: ГЛАВНЫЕ УСПЕХИ ПРИ
СЕЛЕКЦИИ И ОТБОРЕ ПОЛУЧЕНЫ У МИКРООРГАНИЗМОВ, Т.К.
ОНИ ЛЕГКО РАЗМНОЖАЮТСЯ, ИМЕЮТ БОЛЬШОЕ КОЛИЧЕСТВО
МУТАНТОВ И ЛЕГЧЕ ОТБИРАЕТСЯ БИООБЪЕКТ С
ИНТЕРЕСУЮЩИМИ БИОТЕХНОЛОГА СВОЙСТВАМИ. МЕТОДОМ
ОТБОРА И МУТАГЕНЕЗА БЫЛО ДОСТИГНУТО ПОВЫШЕНИЕ
АКТИВНОСТИ У ПРОДУЦЕНТА ПЕНИЦИЛЛИНА С 40-Х ГОДОВ В
100 000 РАЗ, СТРЕПТОМИЦИНА В 20 000 РАЗ.
ТЕ ЖЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ПОЛУЧЕНЫ В РАБОТЕ С
ПРОДУЦЕНТАМИ ВИТАМИНОВ И АМИНОКИСЛОТ.
10. Мутации: спонтанные и индуцированные Спонтанные- неконтролируемые, внезапные или причины которых не установлены. Индуцированные
11. 1. Химические мутагены: а) нитрозогуанидин – алкилирует основания в репликативной вилке, вызывает мутации по типу трансверсии,
транзиции и делеции,
б) нитрозометилмочевина – вызывает трансверсию
в) акридиновые красители (акридиновый оранжевый) – вставка
другого гена между основаниями
г) некоторые противоопухолевые антибиотики, которые являются
ДНК-тропными агентами.
2.Физические мутагены:
а) УФ- облучение, при этом образуются димеры пиридиновых
оснований,
идут мутации по типу транзиции и трансверсии. Изменяется порядок
считывания генов на уровне трансляции.
б) рентгеновское облучение
в) быстрые нейтроны
г) гамма-лучи (радиоактивный Со)
д) ультразвук (Но! при уровнях средней интенсивности ультразвука до 100
мВт/см2 (используемых в диагностике) какие-либо существенные изменения в
тканях не выявляются).
12. Главный тезис биотехнолога: увеличение выхода продукта на единицу биомассы продуцента.
Цели, которые необходимо достигать биотехнологу
при совершенствовании продуцента:
1. Увеличение продуктивности в достижении большого выхода
лекарственных веществ на единицу биомассы.
2. Придать продуценту способность использовать менее дефицитные и
более дешевые среды.
3. Продуцент не должен ретроингибировать биосинтез конечного
продукта.
4. Устойчивость продуцента к вирусным инфекциям (бактериофагам).
5. Нетребовательность к оборудованию, т.е. биосинтез не должен
снижаться при несовременной технологии оборудования (например,
достижение меньшей вспениваемости культуральной жидкости)
6. Оптимизация свойств продуцента в аспекте медицинской
промышленности (продуцент не должен иметь неприятного запаха и
т.д.).
ГЛАВНЫЙ ТЕЗИС БИОТЕХНОЛОГА:
УВЕЛИЧЕНИЕ ВЫХОДА ПРОДУКТА НА
ЕДИНИЦУ БИОМАССЫ ПРОДУЦЕНТА.
13. Клеточная инженерия - это техника обмена фрагментами ДНК, участками хромосом у прокариот и любыми хромосомами у эукариот,
Клеточная инженерия
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ - ЭТО ТЕХНИКА ОБМЕНА ФРАГМЕНТАМИ
ДНК, УЧАСТКАМИ ХРОМОСОМ У ПРОКАРИОТ И ЛЮБЫМИ
ХРОМОСОМАМИ У ЭУКАРИОТ, НЕЗАВИСИМО ОТ УДАЛЕННОСТИ
ОРГАНИЗМОВ В ЭВОЛЮЦИОННОМ ПЛАНЕ.
В СЛУЧАЕ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ НЕТ ВИДОВЫХ И РОДОВЫХ
БАРЬЕРОВ, Т.Е. В КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ ОСУЩЕСТВЛЯЮТ
ОБМЕН ГЕНЕТИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛОМ МЕЖДУ ОРГАНИЗМАМИ,
КОТОРЫЕ В ОБЫЧНЫХ УСЛОВИЯХ НЕ ВСТУПАЮТ В ПОЛОВОЙ
ПРОЦЕСС, ЧТО ОТКРЫВАЕТ БОЛЬШИЕ ВОЗМОЖНОСТИ В
СОЗДАНИИ БИООБЪЕКТОВ.
В СЛУЧАЕ С КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИЕЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬ
ОПЕРИРУЕТ ЦЕЛЫМИ КЛЕТКАМИ.
14. Техника клеточной инженерии Техника клеточной инженерии основана на технике протопластирования. Протопласт – это клетка без
ТЕХНИКА КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ
ТЕХНИКА КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ ОСНОВАНА
НА ТЕХНИКЕ ПРОТОПЛАСТИРОВАНИЯ.
ПРОТОПЛАСТ – ЭТО КЛЕТКА БЕЗ КЛЕТОЧНОЙ
СТЕНКИ,ОКРУЖЕННАЯ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ
МЕМБРАНОЙ. ПРОТОПЛАСТ ПОЛУЧАЮТ,
ОБРАБАТЫВАЯ КЛЕТКУ ФЕРМЕНТАМИ, КОТОРЫЕ
ГИДРОЛИЗУЮТ ПОЛИМЕРЫ В КЛЕТОЧНОЙ
СТЕНКЕ.
Техника получения гибридных клеток слиянием
прокариотов и эукариотов.
Этапы работы:
1. Выбор биообъектов
Берут биообъект, продуцирующий целевой продукт (например,
продуцент цефалоспоринов гриб (эукариот) Acremonium chrysogenum и
с другой стороны биообъект, которому хотят придать свойство
продуцировать целевой продукт (например, прокариот E. coli ).
18. 2. Обработка клеточных стенок ферментами. Прокариоты: лизоцим Эу (микроскопические грибы) : ферментный препарат из
пищеварительного тракта виноградной
улитки Helix pomatia.
3. Стабилизация протопластов
Гипертонический раствор, состоящий из 20%-ных маннита/
сахарозы или 10% р-ра хлорида натрия.
Ионная сила раствора такова, что клетка находится в
состоянии тургора, но не лопается, при этом раствором
также производится отмывание фермента.
19. 4. Слияние протопластов. Слияние суспензий протопластов производится в среде ПАВ в полиэтиленгликоле, который нарушает
клеточную
цитоплазму, и ДНК двух протопластов объединяются. Этот
процесс происходит постепенно.
Для облегчения клетке процесса фузии (слияния) клетку
необходимо
сделать компетентной. Для этого:
1. обрабатывают клетку тяжелыми металлами
2. производят быструю заморозку и оттаивание клеток
3. обрабатывают клетки ферментами.
При слиянии получается протопласт с двумя наборами хромосом –
диплоидный набор (при образовании гибрида происходит
рекомбинация ДНК).
20. 5. Регенерация (восстановление клеточной стенки протопласта. Полученный гибрид засевают на плотную питательную среду с
необходимыми компонентами для прокариот и эукариот. При этом
происходит восстановление клеточной оболочки.
Для того, чтобы отличить гибридную клетку от негибридной,
необходимо на уровне 4-ой стадии включить еще один
протопласт, несущий маркер. Маркер – это участок гена,
образующий какой- либо фермент, заявляющий о себе
своеобразным путем при высеве на питательную среду. В
данном случае маркером является β-лактамаза. В среду
добавляют бензилпенициллин и вырастают только те клетки, которые
содержат β-лактамазу, расщепляющую его. А так как β-лактамазу
содержат только клетки гибриды, то на среде и вырастают только
гибриды.
6. Хранение гибридов, новых продуцентов.
21. Техника клеточной генной инженерии 1-ый метод. Метод перегруппировки генов Внутри клетки есть определенный набор и
последовательность генов. При
протопластировании идет перегруппировка генов. Также происходит и
активация молчащих генов.
II-ой метод. Слияние или фузия генов.
Прокариот сливают с эукариотом, образуется рекомбинант, содержащий
кусок
одного ДНК и другого ДНК.
III-й метод: Трансформация.
а) клетка с определенным набором генов в ДНК → живой протопласт без
перегруппировки генов → протопласт гибрид-рекомбинант → клетка
б) выделение изолированной ДНК в пробирке - вектор (это фрагмент
изолированной ДНК, выделенный из другого микроорганизма (фаг,
плазмида)
Если есть клетка и изолированная ДНК с нужным геном (вектор, который
может быть в виде фага, плазмиды, вируса, космиды (плазмида+ фаг), то
можно включить вектор в изолированный протопласт (т.е. провести
трансформацию).
24. Компетентность Для того, чтобы прошла трансформация, необходимо сделать клетку компетентной, т.е. увеличить ее проницаемость.
Это достигается
следующим образом:
1. воздействовать на клетку ионами тяжелых металлов (цинк, кобальт,
литий, магний)
2. воздействовать на клетку ферментами (лизоцим, комплексный
фермент
виноградной улитки)
3. быстрое замораживание и оттаивание.
Компетентные клетки легче поглощают вектор, куски ДНК. У них
обнажена цитоплазматическая мембрана, которая в некоторых местах
выходит на поверхность, и в образующиеся в этих местах “окошечки”
легко проникает вектор в виде изолированной ДНК, а также в виде фага,
вируса, космиды (космида- изолированная ДНК или плазмида+ фаг).
25. Совершенствование биообъекта методами генной инженерии Отличие клеточной инженерии от генной инженерии в том, что в генной
инженерии имеют дело с изолированными ДНК, с
которыми работают in vitro.
Суть технологии: производят соединение фрагментов ДНК in
vitro (в пробирке) с последующим введением изолированной
ДНК в живую клетку.
Чистая генная инженерия – это техника обмена
изолированными фрагментами ДНК. Это происходит с
помощью ферментов, которые относятся к эндонуклеазам
(например, рестриктазы).
Цель генной инженерии: создание новых продуцентов для
выработки новых целевых продуктов (новые
лекарственные средства, диагностические и
профилактические препараты).
26. Необходимые условия для осуществления генной инженерии: 1. Нужен такой биообъект, который способен синтезировать чужеродный
белок, воспринимать и передавать
генетическую информацию.
2. Организм человека не должен отторгать продукт,
синтезированный продуцентом.
3. Клетка должна делиться, необходимо, чтобы гены,
продуцирующие целевой продукт у клеток, образующихся
после деления, экспрессировались (работали).
4. Необходимо иметь транспортное устройство для внесения
ДНК в клетку продуцента: вектор в виде плазмид, фага.
27. Пути введения вектора: 1. коньюгация – генетический материал клеток при сближении переходит из одной клетки в другую в виде
плазмиды.
2. трансдукция – передача клетке генетического
материала через вирус или фаг.
3. трансформация – передача клетке
генетического материала изолированной ДНК, в
результате чего изменяется геном. Процесс
трансформации – перенос генетического
материала, при котором фрагмент ДНК,
выделенный из клетки донора, поступает в
клетку-реципиент.
В генной инженерии включение нового гена происходит с
помощью фермента рестриктазы.
30. Техника генноинженерного эксперимента (стадии) 1. Получение ДНК чужеродного фрагмента, который необходимо включить (вклеить) в
клетку хозяина. Например,
получение ДНК человеческого инсулина.
2. Получение плазмиды из клетки донора
Есть клетка-реципиент (напр. , Е. coli ), из которой мы получаем
плазмиды (это элементарная концевая молекула ДНК в 100-1000
раз меньше хромосомы,существует в бактериальных клетках или
клетках прокариот, плазмиды несут ограниченное количество
генов ( не более 30 ).
3. Конструирование рекомбинантной плазмиды ( вектора)
Вектор – рекомбинант ( подготовленная для генно-инженерных
манипуляций плазмида или в виде фага, или в виде
изолированной ДНК или вируса) или часть рекомбинантной ДНК,
которая обеспечивает проникновение и дальнейшую репликацию
этой ДНК в клетке хозяина. Вектор получают с помощью
рестриктазы ( разрывает фосфодиэфирные связи в строго
определенном месте последовательности оснований
нуклеотидной цепи)
31. Рестриктазы и лигазы Большинство методик в генной инженерии включают выделение определенных фрагментов ДНК (DNA) и последующее
Лигазы
В 1961 г. Мезельсон и Вейгл на примере фага
l показали, что рекомбинация включает
разрыв и последующее воссоединение
молекул ДНК. Это положило начало поискам
фермента, участвующего в сшивании
фрагментов ДНК. В 1967 году такой фермент
был найден и получил название ДНК-лигаза.
Он катализирует синтез фосфодиэфирной
связи в 2-х цепочечной молекуле
нуклеиновой кислоты.
Иными словами, ДНК-лигазы сшивают
рядом расположенные нуклеотиды, образуя
связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы
абсолютно необходимы в процессах
репарации ДНК, в процессах репликации при удвоении цепи ДНК.
Существует 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся
по потребностям в кофакторах и способу
действия. ДНК-лигаза E. coli в качестве
кофактора использует
дифосфопиридиннуклеотид, а лигаза фага
Т4 - АТФ в присутствии Mg2+. Лигаза фага Т4
более универсальна, так как помимо
лигирования липких концов способна
катализировать реакцию воссоединения
двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми
концами. Она используется чаще.
33. 4. Включение вектора в клетку-реципиент (Е.coli) Условием включения вектора в клетку реципиента является то, что
цитоплазматическая мембрана ее должна близко
подходить к клеточной стенке,
когда вектор входит внутрь клетки через окошечки.
5. Отбор гибридных клонов
Читайте также: