Различные методы культивирования аэробов и анаэробов реферат

Обновлено: 08.07.2024

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и биологических методов.

Физические методы.

Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;

3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта-Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по способу Виньяль-Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку.

В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль-Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов — анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы.

Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na₂S20₄.

Биологические методы.

Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 сут). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированные методы.

Основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

Типы и механизмы питания бактерий.

Типы питания.

Микроорганизмы нуждаются в углеводе, азоте, сере, фосфоре, калии и других элементах. В зависимости от источников углерода для питания бактерии делятся на аутотрофы , использующие для построения своих клеток диоксид углерода С0₂ и другие неорганические соединения, и гетеротрофы , питающиеся за счет готовых органических соединений. Аутотрофными бактериями являются нитрифицирующие бактерии, находящиеся в почве; серобактерии, обитающие в воде с сероводородом; железобактерии, живущие в воде с закисным железом, и др.

Гетеротрофы, утилизирующие органические остатки отмерших организмов в окружающей среде, называются сапрофитами. Гетеротрофы, вызывающие заболевания у человека или животных, относят к патогенным и условно-патогенным. Среди патогенных микроорганизмов встречаются облигатные и факультативные паразиты (от греч. parasitos — нахлебник). Облигатные паразиты способны существовать только внутри клетки, например риккетсии, вирусы и некоторые простейшие.

В зависимости от окисляемого субстрата, называемого донором электронов или водорода, микроорганизмы делят на две группы. Микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода неорганические соединения, называют литотрофными (от греч. lithos — камень), а микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения, — органотрофами.

Учитывая источник энергии, среди бактерий различают фототрофы, т.е. фотосинтезирующие (например, сине-зеленые водоросли, использующие энергию света), и хемотрофы, нуждающиеся в химических источниках энергии.

Механизмы питания.

Поступление различных веществ в бактериальную клетку зависит от величины и растворимости их молекул в липидах или воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран и др. Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы и ионы, задерживая макромолекулы массой более 600 Д. Основным регулятором поступления веществ в клетку является цитоплазматическая мембрана. Условно можно выделить четыре механизма проникновения питательных веществ в бактериальную клетку: это простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт, транслокация групп.

Наиболее простой механизм поступления веществ в клетку — простая диффузия, при которой перемещение веществ происходит вследствие разницы их концентрации по обе стороны цитоплазматической мембраны. Вещества проходят через липид-ную часть цитоплазматической мембраны (органические молекулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой каналам в цитоплазматической мембране. Пассивная диффузия осуществляется без затраты энергии.

Облегченная диффузия происходит также в результате разницы концентрации веществ по обе стороны цитоплазматической мембраны. Однако этот процесс осуществляется с помощью молекул-переносчиков, локализующихся в цитоплазматической мембране и обладающих специфичностью. Каждый переносчик транспортирует через мембрану соответствующее вещество или передает другому компоненту цитоплазматической мембраны — собственно переносчику. Белками-переносчиками могут быть пермеазы, место синтеза которых — цитоплазматическая мембрана. Облегченная диффузия протекает без затраты энергии, вещества перемещаются от более высокой концентрации к более низкой.

Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и направлен на перенос веществ от меньшей концентрации в сторону большей, т.е. как бы против течения, поэтому данный про цесс сопровождается затратой метаболической энергии (АТФ), образующейся в результате окислительно-восстановительных реакций в клетке.

Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспортом, отличаясь тем, что переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется.

Выход веществ из клетки осуществляется за счет диффузии и при участии транспортных систем.

Основные принципы культивирования бактерий.

Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).

Искусственные питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.).

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин — кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5-2% агара, полужидкие — 0,3-0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80-86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застывшем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10-15 %). Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.

По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.

Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона — в щелочной среде и т. д.

Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для разграничения отдельных видов (или групп) микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

Особую группу составляют синтетические и полусинтетические питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследовательской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.

В последние годы в целях экономии питательных сред и ускоренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так называемые микротест-системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Тема: Питательные среды для культивирования микроорганизмов. Методы выделения чистой культуры аэробов и анаэробов. Проблемы антибиотикотерапии в современном обществе. Особенности химиотерапии вирусных инфекций.

2)Питательные среды для культивирования микроорганизмов.

3) Методы выделения чистой культуры аэробов и анаэробов.

4) Проблемы антибиотикотерапии в современном обществе.

5) Особенности химиотерапии вирусных инфекций.

Микробы, как любые другие живые организмы свое развитие и рост, обновление строительного материала, обеспечение энергетических процессов осуществляют за счёт постоянного обмена веществ с окружающей его внешней средой, т.е. путём питания и дыхания. В зависимости от типа питания микробы подразделяют на аутотрофы (способные усваивать углерод из СО2 , а также молекулярный азот из воздуха, а минеральные вещества путём хемо- или фотосинтеза) и гетеротрофы (способны усваивать углерод и другие вещества только из готовых органических соединений). К аутотрофам относятся в основном многие почвенные бактерии, к гетеротрофам (параторофам) – микробы инфекционных болезней животных и растений.

Типы питания, дыхания (аэробы и анаэробы), индукцию и активность ферментов, токсинов, пигментов, рост и размножение являются основными физиологическими параметрами, которые учитывают при разработке составов питательных сред и условий культивирования микробов invitro.

2)Питательные среды для культивирования микроорганизмов.

Питательные среды — биологические препараты, используемые для выращивания микроорганизмов и изучения культуральных, биохимических, антигенных свойств, фаголизабельности и чувствительности к антибиотикам.

Питательные среды широко используют в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также для контроля за стерильностью лекарственных средств.

Для того чтобы микроорганизмы росли и развивались, питательные среды должны отвечать следующим требованиям.

1. Оптимальный состав.

В их состав должны входить все необходимые компоненты, которые нужны для развития микробов: белки, витамины, углеводы, минеральные вещества.

2. Оптимальное значение pH. Большинство микроорганизмов развивается при pH 7,2…7,4.

3. Стерильность. Она необходима для того, чтобы избегать конкурентной борьбы между микробами.

Для лучшего изучения характера микробных колоний.

5. Влажность. Питание и дыхание осуществляются путем осмоса и диффузии, поэтому питательные среды должны быть слегка влажными.

Питательные среды подразделяют по следующим признакам.

По консистенции: а) плотные (твердые) — агара 1,2…2 % (мясопептонный агар); б) полужидкие — агара 0,2…0,3 % (полужидкий агар); в) жидкие — мясопептонный бульон.

Для придания средам плотной или полужидкой консистенции чаще всего используют агар-агар — полисахарид, выделяемый из морских водорослей.

Агар способен образовывать в воде гель, плавящийся при 80…100 °С и затвердевающий при 37…40 °С. Устойчивость агара к разжижающему действию большинства микроорганизмов, а также способность образовывать прочные студни обусловили его широкое применение в бактериологии.

По происхождению: а) искусственные: животного (МПА, МПБ) и растительного происхождения (пивное сусло); б) естественные: животного (кровь, молоко) и растительного происхождения (кусочки картофеля).

3. По составу: а) белковые; б) безбелковые; в) минеральные.

4. По назначению: а) среды для культивирования (простые, специальные); б) среды для обогащения (для накопления микроорганизмов при их низкой концентрации в исходном материале); в) среды консервирующие для первичного посева и транспортировки патогенов; г) среды для идентификации (дифференциально-диагностические) — микробы одного вида образуют колонии, отличающиеся по внешнему виду от колоний других микроорганизмов.

Если материал слабо загрязнен посторонней микрофлорой, то для выделения культур применяют простые среды общего назначения (МПА), при обильной контаминации сапрофитами используют специальные среды: элективные (для отдельных видов) и дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации).

3) Методы выделения чистой культуры аэробов и анаэробов.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего питательного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непрозрачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Выделение чистых культур анаэробных бактерий:

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами анаэробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В дальнейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания агара в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извлекают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные колонии пересевают на среду Китта-Тароцци.

4) Проблемы антибиотикотерапии в современном обществе.

Проблемы и перспективы антибактериальной терапии

К числу наиболее актуальных задач в разработке проблемы антибиотиков сегодня относятся:

•создание и разработка способов преодоления антибиотикорезистентности микробов;

•изыскание природных и создание полусинтетических антибиотиков, эффективных в борьбе со стафилококковой, синегнойной и другими инфекциями, злокачественными опухолями;

•поиски новых продуцентов среди малоизученных групп организмов; •изучение генетических рекомбинаций у микроорганизмов с продукцией новых антибиотиков;

•получение новых антибиотиков путем направленного биосинтеза и подбора соответствующих мутантов и рекомбинантов.

5) Особенности химиотерапии вирусных инфекций.

Химиотерапия вирусных инфекций — это особая проблема.

Успехи в поиске эффективных противовирусных терапевтических препаратов пока не столь значительны как в области противомикробных средств. Трудность заключается в создании препаратов, избирательно подавляющих репродукцию вируса и не затрагивающих процессы жизнедеятельности клеток и всего организма в целом.

Результаты многолетних трудоемких поисков антивирусных веществ путем такого отбора оказались весьма скромными и увенчались открытием единичных химиопрепаратов, обладающих узким спектром действия.

Благодаря достижениям фундаментальных исследований в области вирусологии и выяснению молекулярных механизмов репродукции вирусов первое направление в химиотерапии вирусных инфекций более перспективно. Но оно основано на направленном получении или синтезе химиопрепаратов, действующих на заведомо известные уязвимые стадии репродукции вирусов либо на функции клеток, необходимые на каком-то общем для различных групп вирусов этапе их репродукции.

Можно выделить три основные группы препаратов, подавляющих начальные (адсорбция, проникновение и депротеинизация), средние (синтез компонентов) и заключительные [композиция (сборка) и высвобождение] стадии взаимодействия вирусов с клетками.

Ремантадин и амантадин специфически блокируют стадию раздевания вируса и вызывают накопление промежуточных продуктов раздевания. Они блокируют слияние вирусной оболочки с лизосомальной мембраной, блокируется удаление белка М, и вирусный геном не выходит из лизосомы. Оба препарата ингибируют репродукцию ряда вирусов — гриппа, болезни Ньюкасла, кори, краснухи, везикулярного стоматита, альфа-вирусов и других липидсодержащих вирусов. Амантадин и ремантадин — эффективные средства химиотерапии и химиопрофилактики гриппа.

Ингибиторы синтеза вирусных компонентов. Это главным образом аномальные нуклеозиды, которые ингибируют функции вирусных полимераз, а при включении во вновь синтезируемые нуклеиновые кислоты делают их нефункциональными. Наиболее известные препараты этой группы — азидотимидин, ацикловир, рибавирин.

Азидотимидин (зидовудин) ингибирует обратную транскриптазу, избирательно взаимодействует с ферментом ретровирусов, включая ВИЧ.

Ацикловир — нуклеозидный аналог гуанозина с высокой избирательностью к инфицированным вирусами клеткам. В клетках после последовательных превращений ацикловира образуется ациклогуанозинтрифосфат, который ингибирует ДНК-полимеразу вирусов, тормозя образование полноценной молекулы нуклеиновой кислоты, так как из-за отсутствия гидроксильной группы к ациклогуанозинтрифосфату не могут присоединиться последующие нуклеотиды. Препарат не влияет на синтез ДНК в незаряженной клетке, так как в них он не превращается в активную форму. Он эффективен при лечении инфекций, вызванных вирусом простого герпеса.

Рибавирин — имеет широкий спектр действия, обладая эффективностью против ДНК — и PHK-содержащих вирусов — вирусов гриппа, парагриппа, полиомиелита, риновируса, везикулярного стоматита, герпеса, осповакцины и др.

Ингибиторы сборки и освобождения потомства вирионов. Такими ингибиторами являются производные тиосемикарбазонов. Практическое применение нашел метисазон. Антивирусное действие его обусловлено подавлением трансляции поздних вирусных иРНК и сборки вирусных частиц. Препарат активен против вирусов оспы.

Ингибиторы протеаз. Известно, что для возникновения инфекционного процесса необходима протеолитическая активность вируса, т. е. нарезание одного или нескольких его белков. Сущность этого феномена заключается в том, что многие вирусные белки приобретают функциональную активность лишь после протеолитического нарезания. У пикорна-, тога-, ретро — и других вирусов этот процесс лежит в основе формирования всех структурных вирусных белков, которые образуются в результате нарезания белка — предшественника. У ортомиксо-, парамиксо-, рео-, бунья-, арена — вирусов и других протеолитическому нарезанию подвергаются в первую очередь гликопротеиды. Так, например, у парамиксовирусов на суперкапсидной оболочке вириона два гликопротеида: HN (гемагглютинин/нейраминидаза) и F (белок слияния); у вирусов гриппа НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидаза). В процессе инфекции вирусные гликопротеиды у вирусов обоих семейств претерпевают протеолитическое нарезание. У парамиксовируеов белок F0 нарезается на два гликопротеида — F1 и F2; у ортомиксовирусов протеолизу подвергается гемагглютинин, который нарезается на два фрагмента — НА1 и НА2.

Вирионы приобретают способность заражать клетки (т. е. становятся инфекционными) лишь после нарезания (НА → НА1 + НА2, F0 → F1 + F2). Чем выше уровень протеолитического нарезания вируса в организме, тем интенсивнее развитие инфекционного процесса и выше вирулентность вируса.

Нарезание белков у различных вирусов осуществляется либо только клеточными, либо клеточными и вирусспецифическими протеазами. Для правильного нарезания белка, обеспечивающего его активность, необходимы протеазы определенной специфичности. Отсюда следует, что подавление активности протеаз, участвующих в нарезании вирусных белков, должно блокировать способность вирионов заражать чувствительные клетки.

В последние годы проводятся многочисленные эксперименты на модели ВИЧ. Отмечают усиление противовирусной эффективности при совместном использовании ингибиторов протеаз ВИЧ и аномальных нуклеозидов.

Ингибиторами протеаз являются препараты: гордокс, контрикал, апротинин и др.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах. К универсальным средствам относят мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон. Первая характеристика изучаемого микроорганизма определяется способностью его роста на универсальных средах. На плотных питательных средах многие микроорганизмы образуют колонии. Для микроорганизмов, не растущих на обычных средах, используют специальные среды. Для выделения каких-либо определенных видов, отличающихся особенностями роста, применяют элективные среды.

Правильный подбор и использование питательных сред обеспечивает успешное культивирование микробов для накопления биомассы и её биотехнологическое использование для производства диагностических и вакцинных препаратов, определения и идентификации микробов в диагностической лаборатории и научных исследованиях.

Дальнейшие успехи бактериологии и микробиологии зависят главным образом от усовершенствования питательных сред в смысле приближения их к условиям естественного питания микроорганизмов.

1. К. Френкель, "Основы учения о бактериях"

2. Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней. / Н.А. Семина. - М.: Медицина, 1999

3. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.

4. Санитарная микробиология и вирусология. / З.Н. Качемасова, С.А. Ефремова, А.М. Рыбакова - М.: Медицина, 1987. 5. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М 1976

Анаэробы — организмы, получающие энергию при отсутствии доступа кислорода путем субстратного фосфорилирования, конечные продукты неполного окисления субстрата при этом могут быть окислены с получением большего количества энергии в виде АТФ в присутствии конечного акцептора протонов организмами, осуществляющими окислительное фосфорилирование.

ГЛАВА АНАЭРОБНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

В отличие от аэробов культивирование анаэробных микроорганизмов более сложное, поскольку контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом должен быть сведен к минимуму. В жидкой питательной среде облигатные аэробы и микроаэрофилы содержатся в верхней части пробирки (колбы), тогда как облигатные анаэробные бактерии во избежание контакта с кислородом располагаются в нижней части сосуда. Факультативные анаэробы собираются в основном в верхней части питательной среды, однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как имеют два набора ферментных систем. Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрацию кислорода и равномерно распределяются по всему объему питательной среды. На практике к анаэробным относят бактерии, которые не растут на поверхности плотной или полужидкой среды на воздухе при атмосферном давлении. Степень анаэробиоза измеряется по окислительно-восстановительному (Eh) потенциалу среды. При увеличении Eh выше -100 мВ, обусловленном присутствием растворимого кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. Для создания анаэробных условий при культивировании микроорганизмов используют физические, химические, биологические и смешанные методы.

Физические методы предусматривают откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (N2 — 85 %, CO2 — 10 %, H2 — 5 %, или азот с 5 % СО2 и 10 % Н2). Эти методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах — микроанаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо другим газом, например, СО2. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробы в пробирках в глубине столбика расплавленного и остуженного сахарного агара или среды Вильсона-Блера. По методу Вейона-Виньяля агар с посевным материалом набирают в стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.

Химические — методы, при которых применяют химические поглотители кислорода или восстанавливающие агенты. В первом случае при культивировании исследуемого материала на плотных средах в эксикатор помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода. Помимо щелочного раствора пирогаллола в качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют дитионит натрия (N a 2 S 2 O 4), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы. При использовании восстанавливающих агентов в жидкие питательные среды добавляют различные редуцирующие вещества: аскорбиновую, тиогликолевую кислоту или тиогликолат натрия, цистеин, которые снижают окислительновосстановительный потенциал.

Культивирование и рост микроорганизмов … Культивирование и рост микроорганизмов … Культивирование и рост микроорганизмов … Культивирование и рост микроорганизмов …

Биологический метод основан на одновременном культивировании анаэробов с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. Для этого питательную среду в чашках Петри разделяют желобком на две половины, на одну половину засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой анаэроб. Края чашки заливают парафином. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине. Наиболее удобна для культивирования анаэробов специальная среда Китта-Тароцци, которую перед употреблением кипятят на водяной бане для удаления из нее растворенного кислорода. Среду заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. В зависимости от количества посевного материала видимый рост анаэробов в виде помутнения может наблюдаться уже через 48 ч с момента посева.

Рост изолированных колоний анаэробов можно получить при рассеве определенного количества исследуемого материала, нанесенного на поверхность кровяно-сахарного агара в чашках Петри, которые помещают в анаэростат. Образовавшиеся колонии анаэробов выделяют, распилив пробирку в месте роста. Колонии анаэробов для получения значительного количества биомассы отсевают затем на среду Китта-Тароцци. В качестве источника углерода и энергии в питательную среду добавляют глюкозу.

При смешанных методах используют несколько вариантов. Для культивирования анаэробных бактерий могут быть использованы и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре. В их числе методы выращивания в высоком слое среды; в толще плотной питательной среды; культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в жидкость уменьшается с увеличениемее плотности; заливка засеянной среды высоким слоем стерильного вазелинового масла. При создании оптимальных условий для строгих анаэробов необходимо постоянное поддержание безкислородных условий культивирования. Это достигается за счет использования специальных сред, не содержащих растворенный кислород, поддержания на соответствующем уровне окислительно-восстановительного потенциала, а также путем забора, доставки и посева материала в анаэробных условиях.

Существует ряд методов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов — предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом, использование герметически закрывающейся посуды с инертным газом, плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Наиболее простым и эффективным оборудованием являются системы с газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях (например, HiAnaerobicTM System-10).

Типы и механизмы питания бактерий.

Типы питания.

Микроорганизмы нуждаются в углеводе, азоте, сере, фосфоре, калии и других элементах. В зависимости от источников углерода для питания бактерии делятся на аутотрофы , использующие для построения своих клеток диоксид углерода С02 и другие неорганические соединения, и гетеротрофы , питающиеся за счет готовых органических соединений. Аутотрофными бактериями являются нитрифицирующие бактерии, находящиеся в почве; серобактерии, обитающие в воде с сероводородом; железобактерии, живущие в воде с закисным железом, и др.

Механизмы питания.

Выход веществ из клетки осуществляется за счет диффузии и при участии транспортных систем.

Какие бактерии для чего подходят

Исходя из условий жизнедеятельности и функциональных характеристик биологических средств для септиков, определяется сфера их использования.

ЛЕКЦИЯ 10 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И РОСТ … Культивирование облигатных анаэробов … 6.Методы культивирования облигатных … Анаэробные организмы — Википедия

Анаэробные бактерии просты в работе, не требуют особых условий для деятельности, хорошо работают в разных средах. Они удобны в использовании: достаточно добавить биопрепарат в сантехнический слив. Использовать такие средства лучше всего в качестве средства для септиков закрытого типа, так как они не нуждаются в воздухе. Очищенные стоки можно использовать для последующего полива огородов. Если загородный дом или дача не используется для регулярного проживания, такой вид бактерий подойдет лучше всего, так как при работе бактерий выделяется метан, кроме того, для удаления осадка придется прибегать к услугам ассенизатора.
Аэробные бактерии применяются как средство для септика для частного дома при постоянном проживании в качестве биосредства для выгребных ям дачных туалетов, а также в закрытых септиках. Однако, применяя бактерии для бетонных септиков, не следует забывать, что для их использования необходимы определенные условия – регулярная подача воздуха компрессором или аэратором. Результат деятельности аэробных бактерий – активный ил – может использоваться для удобрения огородов, а очищенная воды – для полива и в качестве технической.
Биоактиваторы – универсальные средства. Принцип их действия такой: сначала начинают работать аэробы, запуская кислую реакцию. После того, как, отработав кислород, аэробы погибают, в дело вступают анаэробные микроорганизмы. Таким образом, биоактиваторы подходят для любых видов септиков – от сливных открытых ям до промышленных септиков закрытого типа.

Причины развития инфекции

Можно выделить несколько основных причин, по которым происходит инфицирование:

Создание подходящих условий для жизнедеятельности патогенных бактерий. Это может произойти:
когда на стерильные ткани попадает активная внутренняя микрофлора;
при применении антибиотиков, которые не оказывают действия на анаэробные грамотрицательные бактерии;
при нарушении кровообращения, например, в случае хирургического вмешательства, опухолей, травм, попадания чужеродного тела, болезней сосудов, при омертвении ткани.
Заражение ткани аэробными бактериями. Они, в свою очередь, создают необходимые условия для жизнедеятельности анаэробных микроорганизмов.
Хронические заболевания.
Некоторые опухоли, которые локализуются в , кишечнике и голове нередко сопровождаются этим заболеванием.

Классификация анаэробов

Согласно устоявшейся в микробиологии классификации, различают:

Факультативные анаэробы
Капнеистические анаэробы и микроаэрофилы
Аэротолерантные анаэробы
Умеренно-строгие анаэробы
Облигатные анаэробы

Если организм способен переключаться с одного метаболического пути на другой (например, с анаэробного дыхания на аэробное и обратно), то его условно относят к факультативным анаэробам .

До 1991 года в микробиологии выделяли класс капнеистических анаэробов , требовавших пониженной концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислоты (Бруцеллы бычьего типа — B. abortus )

Культивирование аэробных и анаэробных … Культивирование бактерий. Выделение … Способы и системы культивирования … Презентация на тему: «КУЛЬТИВИРОВАНИЕ …

Умеренно-строгий анаэробный организм выживает в среде с молекулярным O 2 , однако не размножается. Микроаэрофилы способны выживать и размножаться в среде с низким парциальным давлением O 2 .

Облигатные анаэробы в присутствии молекулярного кислорода O 2 гибнут — например, представители рода бактерий и архей : Bacteroides , Fusobacterium , Butyrivibrio , Methanobacterium ). Такие анаэробы постоянно живут в лишенной кислорода среде. К облигатным анаэробам относятся некоторые бактерии, дрожжи, жгутиковые и инфузории.

Культивирование аэробных микроорганизмовпроводят следующим образом:

1) На поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород прямо из воздуха.

2) В жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование. Наиболее простой и широко используемый в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на шейкерах, обеспечивающих встряхивание колб или пробирок со скоростью 100–200 об/мин и более. Помимо перемешивания, аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием под давлением через толщу среды стерильного воздуха.

Граница между аэробными и анаэробными микроорганизмами является относительно условной. Хотя облигатными анаэробамиобычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кислорода, на практике к анаэробным относят те бактерии, которые не растут на поверхности твердой или полужидкой среды на воздухе при атмосферном давлении. Аэротолерантные бактериихорошо растут на поверхности агара и чашках при низком уровне кислорода. Степень анаэробиоза измеряется по окислительно-восстановительному (редокс,Eh) потенциалу среды. При увеличении Eh выше 100 мВ, обусловленном присутствием растворимого кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. Для удаления кислорода и создания соответствующих условий среды можно воспользоваться следующими методами:

1 Культивирование в микроанаэростате – аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с 5 % СО₂и 10 % Н₂.

2 Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na₂S₂O₄), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы. Поглотители помещают на дно химического эксикатора с притертой крышкой, а также анаэробные бактерии, засеянные в колбу, пробирку или чашку Петри. При таком способе создания анаэробных условий необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращиваются бактерии.

3 Использование восстанавливающих агентов, которые добавляют для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, дитиотрейтол, аскорбиновая кислота. Удаления кислорода из среды можно добиться и в результате быстрого нагревания и кипячения среды с последующим быстрым охлаждением. Если в такую среду засеять анаэробные микроорганизмы и наслоить смесь (1:1) масла и парафина, то в подобных условиях будет наблюдаться рост нестрогих анаэробов.

4 Выращивание совместно с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. В жидкой среде с восстанавливающими агентами перед инокуляцией анаэроба проводят культивирование, например, E.coli, что приводит к удалению из среды остаточного кислорода. Перед инокуляцией анаэробов клетки E.coli убивают нагреванием.

Существует и другая модификация метода. На половине чашки Петри засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой – анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется после полного использования кислорода аэробом.

Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре:

• выращивание в высоком слое среды;

• выращивание в толще плотной среды;

• культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в среду уменьшается с увеличением ее плотности;

• заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина.

Читайте также: