Тонкослойная хроматография это кратко и понятно

Обновлено: 18.05.2024

Хроматография - это метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Этот физический метод позволяет химикам внимательно наблюдать за органическими и неорганическими соединениями и выяснять, из чего они сделаны.

Метод был предложен в 1903 г. Михаилом Семеновичем Цветом - выдающимся русским исследователем. Первоначально свой метод M.С. Цвет назвал адсорбционным анализом (1903) и лишь через три года - хроматографическим методом (1906) 1 .

Михаил Семёнович Цвет (1872-1919)— русский ботаник-физиолог и биохимик растений, создатель хроматографического метода.

M.С. Цвет использовал хроматографичекий метод для разделения пигментов растений. Для разделения хлорофиллов Цвет наполнял стеклянную трубку (колонку) твердым адсорбентом (например, инулином) и наносил на верхний слой экстракт хлорофиллов в лигроине. Затем промывал колонку лигроином. Цвет писал так – «Из нижнего конца воронки вытекает сначала бесцветная, потом желтая жидкость (каротин), в то время как в поверхностных слоях инулинового столба возникает интенсивное зеленое кольцо, на нижнем крае которого быстро образуется желтая кайма.

По экспертным оценкам, хроматография относится к 20 выдающимся открытиям прошедшего столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а через нее определили уровень развития техники и промышленности, цивилизации в целом. Хотя по образованию и роду занятий Цвет был ботаником, результаты его открытия столь значимы для всех естественных наук, что Федерация европейских химических обществ, например, приводит имя Цвета, наряду с четырьмя другими русскими именами - Ломоносова, Менделеева, Бутлерова и Семенова, - в числе ста выдающихся химиков прошлого. 5

Существуют различные способы классификации хроматографических методов: по физическому состоянию подвижной фазы (газовая и жидкостная хроматографии), по технике выполнения хроматографического разделения (колоночная, плоскостная, хроматография в полях сил), по природе взаимодействия разделяемых компонентов с неподвижной фазой (адсорбционная, ионообменная, эксклюзионная и др.) и др.
Современная хроматография имеет много разновидностей, наиболее популярные их них, которые помогут вам получить более полное представление о процессе представлены ниже. Мы попытались объяснить их очень простым языком.

Основы хроматографии

По своей сути хроматография включает взаимодействие двух разных фаз. Химическое соединение в одном состоянии вещества (например, жидкость или газ) перемещается по поверхности другого вещества в другом состоянии вещества (например, твердое вещество или жидкость).

Движущееся соединение известно как подвижная фаза, в то время как устойчивое вещество (которое вообще не движется) называется стационарной фазой. Компоненты подвижной фазы отделяются, когда она движется по стационарной фазе. Затем химики могут анализировать отдельные компоненты один за другим.

4 разных типа хроматографии

Существует несколько видов хроматографии, каждый из которых имеет свой вид подвижной и стационарной фазы. Хотя основной принцип остается тем же самым, способ взаимодействия различных компонентов с подвижной фазой и стационарной фазой может варьироваться в зависимости от используемого хроматографического метода.

Ниже приведен список основных типов хроматографии, которые помогут вам получить более полное представление о процессе. Мы попытались объяснить их очень простым языком.

1. Бумажная хроматография

Бумажная хроматография является наиболее распространенным и простым аналитическим методом для разделения и обнаружения цветных компонентов, таких как пигменты. Хотя в современных лабораториях чаще используют тонкослойную хроматографию, он все еще является мощным учебным пособием.

В этом методе каплю образца смеси (например, чернил) помещают вблизи края фильтровальной бумаги, а затем бумагу подвешивают вертикально, при этом ее край погружают в растворитель (вода или спирт). Бумагу подвешивают таким образом, что пятно чернил не должно касаться растворителя и остается немного над ним.

Через некоторое время растворитель (подвижная фаза) начинает постепенно продвигаться вверх по бумаге (неподвижная фаза) посредством капиллярных сил. Поскольку растворитель движется вверх, он увлекает красители, присутствующие в чернилах, вместе с ним.

Когда он поднимается, мы видим разные цвета на фильтровальной бумаге. Эти цвета представляют различные красители, присутствующие в чернилах. Поскольку разные красители имеют разные уровни растворимости и движутся с разной скоростью, когда растворитель поднимается, мы видим полосы разного цвета на разной высоте.

Вот как бумажная хроматография используется для разделения разных компонентов чернил. В некоторых случаях смеси не содержат цветных компонентов, поэтому химики добавляют другие вещества для идентификации.

2. Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография очень похожа на бумажную хроматографию. Основное отличие состоит в том, что вместо куска бумаги у нас есть предметное стекло, покрытое слоем силикагеля (неподвижная фаза). В этом методе на нижний край предметного стекла с силикагелем наносятся капли раствора исследуемой смеси, лежащие на отрезке, параллельном нижнему краю и отстоящем от него на такое расстояние, чтобы капли не погружались в элюент.

Когда они подсохнут, предметное стекло нижним краем погружается в слой растворителя (элюент). Предметное стекло с неподвижной фазой удаляется из резервуара с растворителем, когда растворитель (подвижная фаза) достигает верхнего края стекла. Различные соединения в смеси перемещаются вверх по слою силикагеля с различной скоростью в виде пятен. Эти отделенные пятна затем визуализируются в ультрафиолетовом свете.

В некоторых случаях для визуализации пятен используются химические процессы: например, серная кислота обугливает большинство органических компонентов, оставляя темное пятно на предметном стекле. Это простая и быстрая техника для разделения смесей органических соединений. Она часто используется для определения пигментов, анализа состава красителей в волокнах и выявления инсектицидов или пестицидов в пищевых продуктах.

По сравнению с бумажной хроматографией, применение тонкослойной хроматографии приводит к лучшему разделению.

3. Газовая хроматография

Газовая хроматография используется для разделения смесей летучих органических соединений. Прибор, выполняющий этот процесс, - газовый хроматограф - состоит из инжекционного порта, колонки с неподвижной фазой, детектора и системы регистрации данных. Смесь образцов (в газообразной форме) вводится через инжекционный порт.

Обычно количество пробы газа невелико, порядка микролитров. Подвижную фазу в газовой хроматографии называют газом-носителем. Поскольку мы не хотим, чтобы газ-носитель (подвижная фаза) реагировал с образцом, это должен быть инертный газ, такой как гелий, или нереакционноспособный газ, такой как азот. Колонка для газовой хроматографии (металлическая или стеклянная трубка) содержит неподвижную фазу тонкий слой жидкости или полимера на инертной твердой подложке.

Разделение компонентов в смеси происходит за счет разницы в их температурах кипения – соединения с низкой температурой кипения движутся быстрее компонентов с более высокой температурой кипения, а также за счет полярности и других специфических взаимодействий с подвижной фазой.

Это приводит к тому, что каждый компонент элюируется в разное время, также называемое временем удерживания компонента. Сравнивая времена удерживания разделенных компонентов с временами удерживания известных соединений, химики могут анализировать соединения в смеси.

4. Жидкостная хроматография

Жидкостная хроматография - это аналитический метод, используемый для разделения нелетучих соединений, находящихся в растворах в виде молекул или ионов. Его часто называют жидкостной хроматографией высокого давления, в которой подвижная фаза (растворитель) прокачивается через колонку с сорбентом под давлением.

Колонка обычно представляет собой металлическую или пластиковую трубку, заполненную крошечными частицами сорбента с определенным химическим составом поверхности. Поскольку каждое соединение в смеси по-разному реагирует с сорбентом (из-за различий в размерах, адсорбции и ионного обмена), они движутся в колонке с разными скоростями, что обеспечивает разделение их между собой. Выбор состава подвижной фазы зависит от свойств неподвижной фазы и анализируемых веществ.

Химики проводят серию тестов и отрабатывают методику разделения, чтобы найти оптимальный метод жидкостной хроматографии для смеси, который может обеспечить идеальное разделение пиков.

Вот быстрое сравнение четырех основных типов хроматографии -

метод	Подвижная фаза	Неподвижная фаза (НФ)	Описание
Бумажная хроматография	Вода или органический растворитель	Бумага	Разделение за счет процессов распределения
Тонкослойная хроматография	Органический растворитель	Оксид алюминия или силикагель - на пластине	Разделение за счет процессов распределения и специфических взаимодействий с НФ
Газовая хроматография	Азот или гелий	Тонкий слой жидкости или полимера на инертной твердой подложке – в колонке	Разделение за счет разницы в температурах кипения и специфических взаимодействий с НФ
Жидкостная хроматография	Растворы	Сорбенты – в колонке	Разделение за счет специфических взаимодействий с НФ

Применение

За научные исследования в области хроматографии или с применением хроматографического метода были присуждены несколько Нобелевских премий.

Более 60 процентов химических исследований во всем мире проводится с помощью различных видов хроматографии. Современные хроматографы способны разделить и идентифицировать несколько сотен соединений за один анализ. Некоторые хроматографические детекторы могут определять количество вещества в масштабе ppb.

Благодаря этим преимуществам, хроматография в настоящее время широко используется в

Криминалистика: анализ образцов, полученных с мест преступления
Мониторинг загрязнений: для обнаружения небольших концентраций опасных загрязнителей в воздухе и воде.
Медицинская сфера: в процессе производства и контроле качества биологических и фармацевтических продуктов.
Пищевая промышленность: обнаружение порчи в пищевых продуктах, определение качества продуктов питания, а также контроле пищевых добавок.
Юридические действия: определить наличие алкоголя в крови и кокаина в моче.
Радиохимия: для характеристики радиоактивно меченных соединений и определения радиохимической чистоты.

Помимо этого, хроматография также используется для расшифровки ДНК и в биоинформатике, клинической диагностике заболеваний и расстройств, а также в различных исследовательских целях.

Кипячение и нагревание – наиболее часто использующиеся техники в органической химии. Читать далее.

Видеоуроки

Видеоурок, посвященный основам Масс-спектрометрии. Смотреть.

Strict Standards: Only variables should be assigned by reference in /var/www/web783/html/plugins/content/pbspoiler/pbspoiler.php on line 24

Тонкослойная хроматография – способ анализа (реже препаративного разделения) смесей жидких или твердых веществ, основанный на различном сродстве разделяемых веществ к неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент) фазам. Как правило, чем лучше вещество сорбируется неподвижной фазой - тем медленнее вещество двигается по пластине. Тонкослойная хроматография чрезвычайно чувствительный метод, позволяет обнаруживать до ~0.5 масс.-% примесей.

Область применения

Оборудование

Типичный прибор для проведения ТСХ анализа приведен на рисунке:

Капилляр. Представляет собой стеклянную трубку с внутренним диаметром 0.3-1.0 мм, вытянутую в пламени(см. Видеоурок по вытягиванию капилляра , Важно! Оба конца капилляра должны быть открыты). Края капилляра должны быть ровными, чтобы не царапать слой сорбента и при легком прикосновении переносить раствор вещества на пластину. Важно! Чем уже капилляр, тем легче получить небольшое пятно вещества на пластине. В качестве капилляра также удобно использовать насадки для пипетмана (см. фото выше).

Ёмкость для ТСХ. Химический стакан с плоским дном, на дно которого наливается элюент слоем 4-6 мм. Для воспроизводимых результатов дно и стенки емкости выкладываются фильтровальной бумагой, которая пропитывается элюентом. Емкость закрывается крышкой (или чашкой Петри, часовым стеклом) для избежания испарения элюента.

Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться в его присутствии. Пример: гидролиз эпоксидов или ацеталей водой на силикагеле.

Элюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после проведения анализа (поэтому диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА) не подходят из-за высокой температуры кипения).

Элюент подбирают таким образом, чтобы пятно целевого вещества выходило с Rf не более 0.5-0.6 после одного прогона хроматограммы и было хорошо дифференцировано от примесей (~0.1 R_f). Если на старте остались еще вещества (R_f = 0, "сидят на старте"), следует сменить элюент и проанализировать состав этой смеси. Иногда целевое вещество может "сидеть на старте".

Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту.
Пример: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой.
Пример: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой. Ряд растворителей по полярности см. здесь .

Количество элюента. Элюент наливается в емкость до образования слоя 4-6 мм. Важно! Пластину погружают в элюент так, чтобы пятна веществ не соприкасались непосредственно с элюентом, иначе произойдет вымывание веществ в элюирующую смесь.

Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот).
Пример 1: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой.
Пример 2: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой.

Ширина пластины определяется: по 5 мм от краев пластины, и 4-6 мм расстояние между пятнами. Длина пластины: от 5 см (для хорошо разделяющихся веществ) до 10 см или более (для сложных смесей).

Линия "старта" проводится карандашом на расстоянии 5-7 мм от нижнего края пластины, с этого же края отрезаются уголки (~2 мм) для того, чтобы фронт элюента шел по пластине ровным слоем.

Вещество наносится на пластину в виде раствора с достаточно небольшой концентрацией (иначе возможна "перегрузка пластины", т.е. вещества будут выходить длинной растянутой линией, не разделяясь) при помощи капилляра. Диаметр пятен 3-5 мм. При мелких пятнах 6 мм - вещество сильно размывается при элюировании затрудняя дифференциацию пятен.

При анализе фракций колоночной хроматографии. Пятна нумеруют. Если все фракции не помещаются на одну пластину, то последняя фракция с предыдущей пластины также наносится на текущую пластину - для сравнения.
Пример: на 1 пластине наносят фракции с 1 по 10, на второй с 10 по 19, на третьей с 19 по 28 и т.д.

Линия "финиша" проводится карандашом после окончания элюирования на расстоянии 3-5 мм от верхнего края пластины. Важно! Для воспроизводимых результатов фронт элюента не должен достигать края пластины.
Типичную ТСХ пластину после проведения анализа и проявления пятен можно посмотреть ниже:
Пример:

Рекомендации при проведении

Если при помещении пластины в емкость фронт элюента пошел неровно, следует вынуть пластину, выровнять нижний край ножницами и поместить пластину в емкость снова.

Для воспроизводимых результатов элюент для каждого ТСХ анализа следует готовить заново. Так как растворители испаряются.

Для тщательного анализа смеси нескольких веществ можно использовать градиентное элюирование, т.е. (на примере хроматографии на силикагеле), начинать элюировать неполярными растворителями (пентан, гексан), далее постепенно увеличивать полярность смеси (смеси: гексан/этилацетат от 20:1 до 1:5) и, наконец, переходить к высоко полярным растворителям и смесям (метанол, смеси метанол/триэтиламин 20:1).

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее простых и эффективных экспресс - методов разделения и анализа веществ в пищевых продуктах, биологических жидкостях и других объектах, не требующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения). Этим методом можно определить 10-20 мкг вещества с точностью до 5 -7%.

В зависимости от природы НФ тонкослойная хроматография может быть адсорбционной и распределительной. Наиболее широко применим в ТСХ первый вариант разделения.

Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, силикагель и др.) тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или пластмассовую пластинку, закрепляется слой с помощью крахмала или гипса (иногда используют пластинки с незакрепленным слоем). Для хроматорафирования могут использоваться готовые пластинки, выпускаемые промышленностью, размером 5 х!5 или 20x20 см.

На расстоянии 2 см от края пластинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца наносят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3-5 мм). После испарения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно которой налит растворитель (ПФ) в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой.

Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Например, разделение хлорорганических пестицидов на пластинке с силикагелем проводят в среде гексана. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хрома-тографировании аминокислот используют смесь Н-бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов - водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН.

При хроматографировании растворитель движется снизу вверх (восходящий вариант) вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. После окончания хроматографического процесса пластинку вынимают из камеры, отмечают линию фронта растворителя (обычно « 10 см) и высушивают.

Если компоненты смеси окрашены, то они четко видны на пластине после разделения. Неокрашенные соединения обнаруживают различными способами. Если пластину поместить в камеру с парами йода, то четко проявляются коричневые пятна для органических соединений с непредельными связями. Хроматограмму можно проявить, опрыскивая ее каким-либо реагентом, дающим с компонентами пробы окрашенные соединения. В состав нанесенного слоя в готовые пластины часто вводят люминофор. При облучении такой пластины ультрафиолетовым (УФ) светом она флуоресцирует, а разделенные компоненты пробы видны в виде темных пятен. Вещества, имеющие собственную флуоресценцию, также обнаруживают в УФ - свете (например, пестициды).

Идентификацию веществ на хроматограмме осуществляют по характеру окраски пятен, параметру удерживания Rf и с помощью стандартных веществ (свидетелей).

При стандартных условиях величина Rf является постоянной величиной, характерной для данного соединения. Но практика показывает, насколько трудно создавать постоянство всех факторов, от которых зависит воспроизводимость значений Rf. На величину Rf влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителей и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю.

Качественный анализ после разделения компонентов смеси методом ТСХ часто используют для определения состава пищевых продуктов. Так, на рис.7.3.2 представлена хроматограмма жира, выделенного из мясного фарша различного состава.

Хроматографирование проводили на пластинках с силика-гелем в системе гексан-диэтиловый эфир (в соотношении 3:1), пятна детектировали 10% раствором фосфорно-молибденовой кислоты, идентифицировали по голубому цвету зон на желтом фоне пластинки. Как видно из хроматограммы, при данных условиях произошло разделение фосфолипидов и триглицеридов. По характерному составу компонентов мяса и печени можно сделать вывод о натуральности мясного фарша в пробах 1 - 2, и добавках к нему печени в пробах 3 — 5.

Количественное определение в ТХС может быть проведено непосредственно на пластинке, или после удаления веществ с плаСтинки. При непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным способом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества.

Более точен денситометрический метод определения веществ на хро-матограммах (ошибка 1-2%). В методе денситометрии производят измерение оптического поглощения проявленной хроматограммы сканирующим лучом в проходящем или отраженном свете на специальных приборах -денситометрах (рис.7.3.4.).

На денситограмме получают пики, площадь которых пропорциональна содержанию вещества в пятне. Построив с помощью стандартов калибровочный график, измеряют площадь пика компонента и по графику определяют его массу в пробе. Получают развитие также спектрофото-денситометрическос и флуори-метрическое определение веществ на хроматограммах. В первом случае используют специальные спектрофотоденситометры, измеряющие поглощение вещества в монохроматическом свете, во втором измеряют флюоресценцию пятна при облучении хроматограммы УФ светом. Широкое распространение получил способ экстрагирования компонентов из зон подходящим растворителем. При применении этого способа на хроматограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. После получеты хроматограммы производят ее обработку, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его экстрагирование подходящим растворителем. Полученный раствор анализируют инструментальным методом, имеющим высокую чувствительность. Чаще всего применяют спектрофотометрические и фотоколориметрические методы. Если вещество не имеет цвета или не обладает поглощением в УФ-области, с экстрактом проводят фотометрическую реакцию, позволяющую получить интенсивно поглощающее производное вещества.

Тонкослойная хроматография находит применение при исследовании некоторых видов пищевых продуктов на безопасность. Например, для определения токсинов (афлатоксинов, микотоксинов, патулина и др.) в арахисе, в зерновых, овощах, фруктах, напитках; для определения пестицидов (ДЦ'Г и др.) в растительных и животных продуктах , определения гистами-на как показателя порчи рыбы. Кроме того, ТСХ часто сочетают с газовой хроматографией, электрофорезом и другими методами.

Читайте также: