Получение трансгенных растений кратко

Обновлено: 02.07.2024

Задачей селекционеров во все времена было получение хозяйственно ценных растений, животных, микроорганизмов. Основными методами традиционной селекции являются отбор, гибридизация, мутагенез, полиплоидия с целью получения нужного признака, который кодируется новым геном или новым комплексом генов.

Существенное продвижение в понимании того, как функционируют гены, расшифровка геномов и развитие методологии генной инженерии позволили перейти от длительных и трудоемких методов традиционной селекции к прямому генетическому конструированию нужных признаков у конкретного организма. При создании трансгенного организма новый генный комплекс конструируется в пробирке и напрямую вводится в организм, фактически таким методом получения нового признака ученые просто ускоряют эволюцию.

Новые методы селекции - это сочетание молекулярных и традиционных методов. Необходимо отметить, что старые методы также остаются широко востребованными при создании новых организмов. Выяснилось, что трансформированные с идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны, полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются по уровню экспрессии введенного гена, поскольку работает эффект положения и копийности гена.

И необходимо проводить дальнейший отбор с анализом наследования полученного признака, используя традиционные методы селекции. Генно-инженерные манипуляции с геномом, сформировавшимся в процессе длительной эволюции, могут нарушать, в какой-то степени, сбалансированные генные комплексы и, соответственно, жизнеспособность полученных трансгенных организмов.

Например, встраивание селективного гена, нужного только для отбора трансгенных растений, может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации.

Появляется необходимость дальнейшего скрещивания и отбора для удаления нежелательных побочных мутаций у трансгенов. Иногда имеется необходимость удаления маркерных генов вообще, так что для получения новых организмов применяется сочетание старых и новых методов селекции.

В настоящее время практическая генно-инженерная биотехнология развивается по двум основным направлениям.

Конструирование трансгенных растений

Возможность получения трансгенных растений основана на тотипотентности их некоторых клеток, т.е. способности в определенных условиях под действием фитогормонов дифференцироваться с образованием полноценного растения. Таким образом, из сконструированных генно-инженерными методами отдельных клеток можно получить фертильные растения, все клетки которых несут чужеродный генный комплекс (трансгенные растения).

Если такое растение цветет и дает жизнеспособные семена, то желаемый признак передается последующим поколениям. Кроме того, многие растения легко размножаются вегетативно. Существующими приемами микроклонального размножения in vitro из микроскопических кусочков ткани (эксплантов) можно быстро получить за короткий промежуток времени генетически однородный посадочный материал с высоким коэффициентом размножения, что важно для последующего применения трансгенного организма.

Для создания трансгенного растения необходимо трансформировать культивируемые клетки, их протопласты или клетки в составе органов, отделить от нетрансформированных клеток и получить из отдельных клеток целые трансгенные растения (рис. 2.12). К настоящему времени для трансформации растений разработано несколько эффективных систем переноса рекомбинантной ДНК в клетки и экспрессирующих векторов, которые работают в ряде растительных клеток.
Векторы на основе Ti-плазмид.

Рис. 2.12. Схема получения трансгенного растения трансформацией эксплантов (кусочки органа растения, например фрагменты тканей семядоли)

Бактерии рода Agrobacterium иногда называют природными генными инженерами за их способность переносить свою плазмидную ДНК в клетки зараженных растений, интегрировать ее в геном организма-хозяина и вызывать стабильную трансформацию этих клеток введенными генами. Все они приводят к образованию у двудольных растений корончатых галлов - трансформация индуцирует образование опухолей, похожих на раковые. Инфекционным агентом является так называемая Ti-плазмида (tumor-inducing plasmid) в 200-250 тнп (рис. 2.13), которая содержит все гены, необходимые для инфекционного процесса.

Рис. 2.13. Схема Ti-плазмиды. Указаны основные гены и их группы. Сайт инициации репликации (ori) обеспечивает удвоение плазмиды при делении клетки Agrobacterium. Колечками обозначены левая и правая фланкирующие
последовательности Т-ДНК

После присоединения Agrobacterium, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке, часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (Т-ДНК (transferred DNA), 12-24 тнп в зависимости от штамма), транспортируется в клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного конъюгации. При этом Т-ДНК транспортируется в одноцепочечной форме, и именно в такой форме она встраивается в хромосомную ДНК растения. С переносимой Т-ДНК остаются связанными два кодируемых Ti-плазмидой белка, способствующие ее вырезанию, и третий белок покрывает оболочкой переносимую одноцепочечную ДНК, предохраняя от деградации.

Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют небольшие векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами из переносимой Т-области, которая ограничена 24-нуклеотидными повторами.

Вместо онкогенов встраивают последовательности клонируемой чужеродной ДНК и селективный маркер. Наличие сайта инициации репликации E. coli в составе Ti-вектора позволяет проводить в кишечной палочке все стадии сборки генетической конструкции. В качестве селективного маркера используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые дают возможность отбирать трансформированные клетки растений. После введения целевой ДНК рекомбинантным Ti-вектором трансформируют клетки агробактерий, несущих модифицированную Ti-плазмиду-помощницу с удаленной Т-областью, но содержащую все необходимое для переноса в растительные клетки T-ДНК части с рекомбинантной плазмиды. Такие вектора получили название бинарных, поскольку только вместе с плазмидой-помощницей они составляют пару из двух элементов для полноценного функционирования системы переноса генов в растительную клетку с помощью агробактерий.

Генетически модифицированные растения получают простой инкубацией любых частей растения с суспензией рекомбинантных агробактерий. Во всех случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов (эухроматин).

Для внедрения больших фрагментов ДНК в клетки растений путем введения фланкирующих Т-область последовательностей из Ti-плазмиды в состав векторов для клонирования больших фрагментов ДНК получены соответствующие космидные векторы, а также векторы на основе искусственных бактериальных хромосом (ВАС), получившие название TAC (transformation-competent bacterial artificial chromosomes). ТАС-векторы могут быть реплицированы как в клетках Е. coli, так и агробактерий, что позволяет с помощью рекомбинантных агробактерий вводить в клетки растений фрагменты ДНК длиной более 150 тнп.

Другие векторы для конструирования трансгенных растений c прямым введением чужеродных генов в виде очищенной ДНК в растительные клетки также разработаны, поскольку эффективные системы переноса генов в растительный геном с помощью агробактерий работают не для всех видов растений. Эти векторы в основном предназначены для сборки эффективной экспрессионной генной конструкции в E. coli с последующим введением в растительную в клетку очищенной ДНК. Наиболее известные способы доставки рекомбинантной ДНК в растительные клетки приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1.Методы введения рекомбинантной ДНК в растительные клетки

Растительные векторы отличаются главным образом различными сигнальными и регуляторными последовательностями, которые обеспечивают эффективную транскрипцию генов в растительных тканях, и различными селективными маркерами. Наиболее важными из регуляторных последовательностей являются проксимальный участок промотора, связывающий РНК-полимеразу; участок, кодирующий 5'-конец мРНК, необходимый для связывания с рибосомой и инициации трансляции, и эукариотический сигнал полиаденилирования на З'-конце мРНК.

Среди эукариотических организмов эти конститутивные сигнальные элементы оказались, к счастью, высококонсервативными и достаточно универсальными, так что растительные клетки в основном правильно экспрессируют чужеродные гены не только растений других видов, но и млекопитающих, дрожжей и других эукариот.

Но для обеспечения достаточного уровня работы чужеродного гена необходимы сильные регуляторные и сигнальные элементы экспрессии, в которых ключевыми являются промоторы, хорошо работающие именно в клетке-мишени. Как и в других системах, для конструирования растительных векторов популярны элементы экспрессионной системы вирусов.

В настоящее время одним из наиболее широко используемых промоторов для двудольных является сильный конститутивный 35S-промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК, CaMV) из группы каулимовирусов. Также для двудольных широко используется nos-промотор гена нопалин-синтазы агробактерий, хотя он намного слабее 35S; для однодольных - промоторы гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (Adh) и гена актина 1 риса (Act).

Особенно нужны эффективные тканеспецифичные и индуцибельные промоторы для тканеспецифичной и/или индуцированной экспрессии трансгена. Экспрессия под сильными конститутивными промоторами, с одной стороны, приводит к большому количеству целевого белка, с другой - к синтезу этого белка во всех тканях растения, что может отрицательно сказаться на жизнеспособности и стабильности трансгенного растения и часто нежелательно для исследователей.

Векторы для трансформации хлоропластов высших растений (транспластомные векторы) относятся к интегративным векторам. Хлоропласты содержат полноценную генетическую систему, сходную с прокариотическими, т.е. все компоненты, необходимые для экспрессии генетической информации, включая белоксинтезирующий аппарат. Геном хлоропластов (пластом) размером 130-160 тнп заключает в себе более 100 различных генов. Векторы для трансформации хлоропластов предназначены для интеграции чужеродной ДНК в пластом с помощью гомологичной рекомбинации.

Представляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие кроме обычного векторного набора два участка длиной по 1 -2 тнп, гомологичные последовательностям ДНК хлоропластов, в которую и происходит встраивание. Экспрессионная кассета между этими гомологичными последовательностями состоит из 5'-некодирующей области с промотором, регулирующим транскрипцию (иногда включает последовательность лидерного пептида перед множественным клонирующим сайтом для целевой ДНК) и 3'-некодирующей регулятор-ной области с терминатором транскрипции, стабилизирующей структуру мРНК, что является одним из условий достижения высокого уровня экспрессии трансгена в хлоропластах.

Для получения эффективной транскрипции клонированного гена часто используют сильный Prrn-промотор оперона рибосомальных рРНК (rrn). В зависимости от размера хлопластной ДНК растения данная векторная система позволяет вводить в геном хлоропластов фрагменты ДНК длиной до 50 тнп, содержащие до 20-30 генов. В геноме хлоропластов описано, по крайней мере, около 20 сайтов, по которым удалось получить продуктивную интеграцию вектора.

Получение транспластомных растений, содержащих генетически измененные хлоропласты, является одним из перспективных направлений, поскольку хлоропласты не переносятся с пыльцой, а значит, устраняется опасность распространения трансгенов с пыльцой среди перекрестно опыляемых растений близких видов. Кроме того, сама пыльца трансгенных растений менее токсична для насекомых, которые не являются мишенью ее токсического воздействия у растений, синтезирующих инсектициды.

Для генома хлоропластов характерен высокий уровень полиплоидии -10-100 копий на хлоропласт. Учитывая большое число самих хлоропластов на клетку, каждая отдельная клетка с трансформированными хлоропластами содержит тысячи копий трансгена, что позволяет получать очень высокий уровень экспрессии соответствующих рекомбинантных белков (до 25 % от суммарного растворимого клеточного белка).

Заражение растительных тканей производят рекомбинантными вирусами, несущими в своем составе гены целевых белков. Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счет чего достигается высокая копийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме зараженных клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений. Иногда такую технологию применяют для масштабного коммерческого производства.

Для транзиентной продукции в растениях также используют векторы Ti-системы. При инфицировании целого растения или его части (листья) рекомбинантной Agrobacterium, содержащей целевой ген в составе бинарного вектора, уровень продукции чужеродного белка может достигать 10-30 % от общего растворимого белка растения в короткое время (5-10 дней). Такой способ также используется, когда требуется проверить сконструированную экспрессионную кассету перед получением стабильных трансформантов или разово наработать небольшое количество (порядка миллиграмма) рекомбинантного белка, например, для оценки его качества или доклинических испытаний.

Веками селекционеры работали над выведением разных сортов культурных растений, придавая им различные полезные свойства. Чем лучше сорт растения, тем он капризнее, больше подвержен различным инфекционным заболеваниям, неустойчив к вредителям или засухе.

Как же получают так называемые трансгенные растения? Так ли много в них опасного и страшного, как о том говорят средства массовой информации? И чем они лучше обычных растений, если во многих странах их продолжают активно выращивать, несмотря на негативное отношение общественности?

В принципе, выведение генетически модифицированного растения ничем не отличается от получения генетически измененной бактерии. Главная задача — выделить нужный ген и встроить его в структуру ДНК растения. Но такая задача кажется простой только на первый взгляд. Ведь геном растения гораздо больше генома бактерий, он содержит многие тысячи генов. Так, совсем недавно ученые выяснили, что геном самого обычного риса по своим размерам превосходит даже геном человека! Теперь понятно, что встроить чужеродный ген в нужное место растительной ДНК вовсе не так просто.

Таким образом, процедура получения генетически измененного растения происходит так: нужный ген размножают и встраивают в ДНК полевой бактерии, затем модифицированными бактериями заражают культуру клеток нужного вида растений, а выращивать целое растение из одной-единственной клетки ботаники научились уже довольно давно.

Итак, сам процесс получения генетически измененных растений сейчас не вызывает никаких затруднений, над созданием трансгенных растений работает множество научных лабораторий в различных странах мира. Лишь в активе одной из американских фирм, впервые получившей генетически измененное растение в 1982 г., к настоящему времени имеется более 45 тыс. различных сортов трансгенных растений! Список растений, к которым были применены методы генной инженерии, составляет несколько сотен видов: это яблоки, сливы, виноград, капуста, баклажаны, огурцы, а также пшеница, рис, соя, рожь и множество других культур. Чем же так привлекательны генетически измененные растения?

В США ученым удалось таким образом получить картофель, который устойчив к колорадскому жуку, хлопчатник, несъедобный для гусениц хлопковой совки, и многие другие подобные трансгенные растения. Эти открытия позволили почти в два раза уменьшить использование химических препаратов, опасных для окружающей среды.

Кроме того, растениям можно привить гены устойчивости к различным вирусам: к настоящему времени получены трансгенные растения, которые могут противостоять воздействию огромного количества разнообразных вирусных инфекций. Конечно, трансгенные растения получают не только для того, чтобы отпугнуть вредителей или не дать распространиться опасному вирусу, — возможности генной инженерии гораздо шире.

Сегодня анализ трансгенных растений проводится на таком же уровне, как и нетрансгенных, — это медицинские экспертизы, химические экспертизы на алергенность и токсичность. Более того: трансгенные растения исследуются во много раз активнее и внимательнее — их фактически разбирают по молекулам. За трансгенными растениями будущее, как ни банально это звучит. Человек всегда воспринимает с осторожностью все новое, что приходит в нашу жизнь. Трансгенным растениям нужно дать шанс, и в будущем они спасут не одно поколение людей от голода.

Картофель, устойчивый к колорадскому жуку, был создан путем введения гена, выделенного из генома почвенной тюрингской бациллы Bacillus thuringiensis, вырабатывающей белок Cry, представляющий собой протоксин.

В кишечнике насекомых этот белок растворяется и активируется до истинного токсина, губительно действующего на личинок и имаго насекомых. У человека и других теплокровных животных подобная трансформация протоксина невозможна, соответственно, этот белок для человека не токсичен и безопасен. Путем трансформации картофеля при помощи Agrobacterium tumefaciens были получены растения, синтезирующие этот белок в мезофилле листа и других тканях растения и, следовательно, не поражаемые колорадским жуком. Данный подход используется и для создания других сельскохозяйственных растений, резистентных к различным видам насекомых.

Опасны ли трансгенные растения?

Каждый интересующийся темой трансгенных растений или генетически модифицированных организмов (ГМО) слышал ужасающую историю о том, что части их ДНК могут встраиваться в человеческие хромосомы и вызывать невероятные, опасные для жизни мутации.

Как уже отмечалось, в практике создания новых или улучшенных сортов сельскохозяйственных растений все большее значение приобретает прямое генетическое воздействие на растительный организм. В результате такого вмешательства получается трансгенный организм, геном которого содержит чужеродный генетический материал [5, 34, 47].

Общая схема создания трансгенных растений представлена на

Схема создания генетически модифицированных растений

Основные этапы этого процесса включают:

1) получение целевых генов, предназначенных для введения в растение, и конструирование кассеты экспрессии;

2) конструирование вектора, несущего целевой ген;

3) трансформацию растительных клеток;

4) регенерацию целого растения из трансформированной клетки;

5) детектирование трансформированных растений среди регенерантов.

Получение целевых генов. На первом этапе необходимо получить ген, который будет вводиться в реципи-ентную клетку растения-хозяина. Для этого существует несколько возможностей.

Если расшифрована нуклеотидная последовательность ДНК и картированы гены донорного организма (т.е. известно, какие фрагменты этой ДНК кодируют те или иные признаки), то нужный ген может быть вырезан специальными ферментами рестриктазами из геномной ДНК донора. Другим способом получения целевого гена является химический или ферментативный синтез нужного фрагмента ДНК. И, наконец, искомую нуклеотидную последовательность можно получить ферментативным синтезом ДНК с матричной РНК — кДНК. Таким образом, в результате реализации того или иного способа получают фрагмент ДНК, несущий ген, кодирующий необходимый признак.

Для того чтобы ген после введения его в организм нового хозяина экспрессировался, т.е. работал, и, как результат этого, в клетке синтезировался соответствующий белок, необходимо снабдить его регуляторными элементами. Регуляторные элементы представляют собой определенные последовательности нуклеотидов, которые позволяют гену функционировать. Обязательными компонентами регуляторных элементов являются:

♦ промотор — участок молекулы ДНК, с которым связывается РНК-полимераза (фермент, катализирующий синтез мРНК), что сопровождается инициацией транскрипции гена;

♦ терминатор — участок молекулы ДНК, определяющий окончание синтеза молекулы мРНК.

В качестве промотора чаще всего используют сильный промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Он относится к конститутивным промоторам, т.е. таким, которые работают на протяжении всей жизни растения. Иногда требуются специфические промоторы — такие, которые активны в отдельных клетках, тканях, органах или лишь на определенных стадиях жизни растений. Например, есть промоторы, которые работают только в клубнях картофеля и никогда не будут работать в его листьях. Наконец, существуют индуцибельные промоторы, которые активируются только под воздействием определенных факторов — химических веществ, температуры и др. В зависимости от того, какой ген должен быть перенесен в растение и в какой период он должен экспрессироваться, для создания вектора выбирают тот или иной промотор.

Таким образом, кассета экспрессии представляет собой группу функционально связанных участков ДНК, в состав которой входят промотор, целевой ген и терминатор.

Конструирование вектора. Сама по себе кассета экспрессии не может попасть в клетку-реципиент и интегрироваться (внедриться) в хромосомы растения-хозяина. Для этого нужен вектор — специальная молекула ДНК, которая может проникать в клетки растений и там самореплицироваться, либо встраиваться в ДНК хозяина и реплицироваться вместе с ней.

В качестве вектора обычно используют ДНК вируса или бактериофага, а также плазмиды бактерий (кольцевые молекулы ДНК, несущие небольшое количество генов и присутствующие в бактериальной клетке наряду с хромосомной ДНК). Именно плазмиды чаще всего применяются для трансформации растений.

Первые попытки создания таких векторных систем основывались на использовании 77-плазмиды (от англ. tumor-inducing plasmid) почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens — фитопатоген, который инфицирует клетки растений, что приводит к образованию опухоли — корончатого галла, нарушающей нормальный

рост растения . Причем, эта бактерия может поражать только клетки двудольных растений.

Инфицирование растений A. tumefaciens и образование корончатого галла

Образование корончатого галла является результатом трех взаимосвязанных процессов:

1. Проникновение бактерии в клетку растения.

2. Интеграция в геном растительной клетки специфического сегмента плазмидной ДНК бактерии — Т-ДНК (от англ. transferred DNA — часть плазми-ды, индуцирующей развитие опухоли).

3. Экспрессия отдельных генов Т-ДНК. Инфекционный процесс начинается с прикрепления

A. tumefaciens к клеткам растения в месте повреждения, чаще всего у основания стебля. Поврежденное растение выделяет специфические фенольные соединения, которые активируют гены вирулентности (vir-гены), локализованные в участке Ti-плазмиды за пределами Т-ДНК .

Продукты vir-генов необходимы для транспорта и интеграции Т-ДНК в геном растительной клетки. После активации fir-генов Т-ДНК транспортируется в клетку. При этом она находится в одноцепочечной форме, и именно в такой форме происходит ее встраивание в хромосомную ДНК растения.

Генетическая карта 77-плазмиды (масштаб не соблюден). Т-ДНК содержит гены ауксина, цитокинина и опина, которые транскрибируются и транслируются только в растительных клетках За пределами Т-ДНК находится кластер vir генов гены кодирующие ферменты катаболизма опина, и сайт инициации репликации (ori), который обеспечивает стабильное поддержание плазмиды в A. tumefaciens Л и П - левая и правая фланкирующие последовательности соответственно

Большинство генов Т-ДНК активируются только после ее интеграции в хромосомную ДНК растения. Их продукты и вызывают образование корончатого галла. Это происходит в результате экспрессии плазмидных генов, кодирующих ферменты, обеспечивающие синтез растительных гормонов ауксина (ИУК — индолилуксусная кислота) и цитокининов. Ауксин и цитокинины регулируют рост и

развитие растительной клетки, но, присутствуя в избытке, могут вызывать у растений образование опухолей.

При использовании 77-плазмиды в качестве вектора для генетической трансформации растений кассету экспрессии, содержащую целевой ген, встраивают в Т-ДНК, а затем такой модифицированной плазмидой, помещенной в бактерию A. tumefaciens, инфицируют клетки растений.

Несмотря на то что 77-плазмиды являются эффективными природными векторами, их использование имеет некоторые ограничения. Наиболее существенные из них следующие:

1. Ауксин и цитокинины, синтезируемые трансформированными 77-плазмидами клетками, подавляют регенерацию зрелых растений из этих клеток. Следовательно, при конструировании векторов на основе 77-плазмид гены ауксина и цитокинина должны быть удалены.

2. Ti-плазмиды имеют очень большой размер (200— 800 тыс. нуклеотидных пар), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера. Следовательно, участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены.

3. 77-плазмиды не реплицируются в кишечной бактерии Escherichia coli (именно в этих бактериях производят клонирование созданного вектора для получения множества его копий, которые в дальнейшем и будут использовать для трансформации растительных клеток). Следовательно, при конструировании векторов необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их воспроизводство в Е. coli.

Кроме манипуляций,, связанных с удалением из 77-плазмид определенных участков ДНК и введения в них сайта инициации репликации кишечной бактерии, в вектор включают специальный ген, который позволяет идентифицировать трансформированные клетки. Он дает возможность обнаружить клетки растений, несущие чужеродную ДНК в составе геномной ДНК трансформиро

ванного растения. Эти гены позволяют либо проводить отбор трансформированных клеток — в этом случае они называются селективными маркерными генами, либо оценивать активность кодируемого ими фермента — регуля-торные гены. Испытано несколько десятков генов, которые можно использовать как селективные маркерные гены, и репортерных генов, чей белковый продукт можно обнаружить с помощью специальных методов .

Как правило, в качестве репортерных используют бактериальный плазмидный ген фермента, который обеспе-

Системы репортерных и селективных маркерных генов растительных клеток

чивает устойчивость трансформированных растительных клеток к тому или иному антибиотику. Чаще всего это ген неомицинфосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к канамицину. В качестве селективных маркерных генов используют гены, которые кодируют ферменты, обеспечивающие устойчивость растительных клеток к антибиотикам или гербицидам. Так, в присутствии ка-намицина выживают только те клетки, которые синтезируют активную неомицинфосфотрансферазу. Поскольку этот ген бактериальный (прокариотический) и не может экспрессироваться в растениях, его ставят под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и терминатора. Это обеспечивает эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках. Однако следует отметить, что, по мнению экспертов-биотехнологов, присутствие некоторых генов и их продуктов может приводить к загрязнению коммерческого продукта. В связи с этим лучше не вводить гены устойчивости к антибиотикам в сельскохозяйственные растения.

Таким образом, осуществив всё необходимые модификации Ti-плазмид, получают вектор, пригодный для трансформации клеток растений.

Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и кроме кассеты экспрессии содержат следующие элементы:

♦ селективный маркерный ген, который обеспечивает устойчивость трансформированных клеток к антибиотикам;

♦ сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в Е. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens; .

♦ правая фланкирующая последовательность Т-ДНК, которая абсолютно необходима для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений;

♦ полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.

Так как клонирующие векторы не содержат uir-генов, то они сами не могут проникать в клетки растения и интегрироваться в их геном. Существуют два способа решения этой проблемы.

В первом случае используют бинарную векторную систему. Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации (ori) и для Е. сой и для A. tumefaciens, но не несет u/r-генов. Все стадии клонирования проводят в E.coli, а затем вектор вводят в A. tumefaciens, которая несет модифицированную неонко-генную 77-плазмиду. 77-плазмида содержит vir-гены, но из нее удалена Т-ДНК. Таким образом, бактерия не может транспортироваться в клетку растения, но может обеспечить синтез продуктов vir-генов, которые способствуют встраиванию Т-ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромосомную ДНК растения. То есть, она выполняет роль помощника интеграции Т-ДНК в геном растительной клетки.

Во втором случае используют коинтегративную векторную систему. Коинтегративный клонирующий вектор, несущий нужный ген, содержит сайт инициации репликации (ori) только для Е. coli и не может автономно существовать в A. tumefaciens. Он также несет бактериальный селективный маркерный ген, правую фланкирующую последовательность Т-ДНК (П), без которой невозможна интеграция в чужой геном, и фрагмент 77-плазмиды, гомологичный участку Т-ДНК неонкоген-ной 77-плазмиды. Неонкогенная 77-плазмида содержит левую фланкирующую последовательность (JI), vir-гены и сайт инициации репликации A. tumefaciens (ori). После рекомбинации коинтегративного клонирующего вектора и неонкогенной 77-плазмиды образуется рекомбинантная плазмида, Т-ДНК которой, несущая клонированный ген, может трансформировать клетки растений.

После накопления клонирующих векторов в Е. coli в нужном количестве и их выделения из этих бактерий возможно использование рекомбинантных ДНК для трансформации растительных клеток.

Две векторные системы на основе Ti-плазмид.

А - бинарный, Б - коинтегративный векторы Пояснения в тексте

Две векторные системы на основе Ti-плазмид.

А - бинарный, Б - коинтегративный векторы Пояснения в тексте

Трансформация растительных клеток. Для трансформации растительных клеток был разработан ряд методов: использование Ti-плазмид, бомбардировка микрочастицами, использование векторов на основе вирусов, микроинъекции, электропорация и др. .

Методы введения ДНК в клетки растений

Эффективность применения и перспективы использования

Высокоэффективная система. Применима не для всех видов растений

Высокоэффективная система. Может использоваться для широкого круга растений и тканей

Использование векторов на основе вирусов

Неэффективный способ доставки ДНК в растительные клетки

Применение ограничивается тем, что инъекция одновременно может быть сделана только в одну клетку

Применение возможно для введения генов только в протопласты, причем растений тех видов, из протопластов которых могут быть регенерированы жизнеспособные растения

Прямое введение генов в протопласты

Как указывалось выше, такими способами были трансформированы более 50 различных видов растений. Однако в настоящее время для производства трансгенных культур в промышленных масштабах в основном применяют агробактериальный (с помощью Тi-плазмид) и баллистический (бомбардировка микрочастицами) способы модификации растительного генома.

Использование агробактерий, содержащих клонирующий вектор, — достаточно высокоэффективная система, несмотря на то, что частота трансформации составляет 1 из 10 000 растительных клеток. Кроме того, как уже отмечалось, они могут быть применены только для переноса генов в двудольные растения, Однодольные растения, включая основные зерновые культуры (рис, пшеница, кукуруза), практически не трансформируются A. tumefaciens. Поэтому для трансформации клеток однодольных чаще всего применяют баллистический способ. Для бомбардировки используют золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,5—2 мкм, покрытые ре-комбинантной ДНК. Этим частицам посредством электрического разряда или сжатым газом придается скорость 300—600 м/с, в результате чего они пробивают клеточную стенку и клеточную мембрану. Попав в клетку, рекомби-нантная ДНК интегрируется в растительную ДНК. Эффективность метода очень высокая — до 15%. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в том числе однодольные и хвойные. Ниже указаны трансгенные растения, полученные баллистическим способом:

Вы должны это знать

В принципе, выведение генетически модифицированного (или, как говорят ученые, трансгенного) растения ничем не отличается от получения генетически измененной бактерии. Главная задача — выделить нужный ген и встроить его в структуру ДНК растения. Но такая задача кажется простой только на первый взгляд. Ведь геном растения гораздо больше генома бактерий, он содержит многие тысячи генов. Так, совсем недавно ученые выяснили, что геном самого обычного риса по своим размерам превосходит даже геном человека! Теперь понятно, что встроить чужеродный ген в нужное место растительной ДНК вовсе не так просто.

Итак, процедура получения генетически измененного растения выглядит следующим образом: нужный ген размножают и встраивают в ДНК полевой бактерии, затем модифицированными бактериями заражают культуру клеток нужного вида растений, а выращивать целое растение из одной-единственной клетки ботаники научились уже довольно давно.

Иногда в оболочке растительных клеток проделывают мельчайшие отверстия короткими импульсами высокого напряжения, а через них в клетку проходят кусочки ДНК. В некоторых случаях успешно применяется впрыскивание ДНК в клетку специальным шприцем под микроскопом.

Итак, сам процесс получения генетически измененных растений сейчас не вызывает никаких затруднений, над созданием трансгенных растений работает множество научных лабораторий в различных странах мира. Лишь в активе одной из американских фирм, впервые получившей генетически измененное растение в 1982 году, к настоящему времени имеется более 45 тысяч различных сортов трансгенных растений! Список растений, к которым были применены методы генной инженерии, составляет несколько сотен видов, это и яблоки сливы, виноград, капуста, баклажаны, огурцы, а также пшеница, рис, соя, рожь и множество других культур. Чем же так привлекательны генетически измененные растения?

Одна из важнейших задач, стоявших перед учеными, — получить растения, устойчивые к вирусам и насекомым-вредителям. Ведь на борьбу с вредными насекомыми ежегодно во всем мире тратятся миллионы долларов, на поля выливаются тысячи тонн опаснейших для окружающей среды химических соединений, а проблема все еще далека от решения.

Американским ученым удалось таким образом получить картофель, который устойчив к колорадскому жуку, хлопчатник, несъедобный для гусениц хлопковой совки, и многие другие подобные трансгенные растения. Эти открытия позволили почти в 2 раза уменьшить использование химических препаратов, опасных для окружающей среды.

Читайте также: