Днк зонд это кратко
Обновлено: 05.07.2024
Технологии генетической диагностики — это научные методы, используемые для изучения и понимания генов организма.
Генетические технологии быстро совершенствуются. Для копирования сегментов гена или нахождения изменений в генах используются различные методы.
Знаете ли Вы, что.
В обозримом будущем людям может стать доступна возможность получения подробной информации о полном собственном генотипе (уникальная комбинация генов или генетический профиль человека).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это лабораторный метод, посредством которого производят множественные копии гена или сегментов гена, что значительно облегчает исследования генов. Конкретный сегмент дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), например, конкретный ген, может быть скопирован (амплифицирован) в лаборатории. Начав с одной молекулы ДНК, в конце процесса 30-кратного удваивания (всего лишь через несколько часов) получают около миллиарда копий.
Генетические зонды
Для нахождения конкретной части гена (сегмента генной ДНК) или целого гена в отдельной хромосоме используется генетический зонд. Зонды применяются для нахождения нормальных или мутированных сегментов ДНК. Сегмент ДНК, который был клонирован или скопирован, становится меченым зондом после того, как в него встраивается радиоактивный атом или флуоресцентный краситель. Зонд способен отыскивать свой зеркальный сегмент ДНК и связываться с ним. Затем меченый зонд может выявляться с использованием сложных микроскопических и фотографических методов. При использовании генных зондов могут диагностироваться несколько заболеваний до и после рождения. Возможно, что в будущем генные зонды будут использоваться в анализах у людей для одновременного обнаружения многих основных генетических заболеваний.
Олигонуклеотидные матрицы
Олигонуклеотид — это цепь оснований (нуклеотидов). Иногда такие цепи отсутствуют или дублируются в сегментах ДНК. Анализ олигонуклеотидов используется для обнаружения недостающих или дублированных сегментов ДНК в отдельных хромосомах. В анализе нуклеотидов сравнивают ДНК человека с эталоном генотипа (уникальная комбинация генов или генетический профиль человека) с помощью нескольких олигонуклеотидных зондов. Как и при использовании других зондов, к олигонуклеотидным зондам добавляется флуоресцентный краситель. Если сегмент отсутствует, зонды показывают уменьшенное количество флуоресцентного красителя. Если сегмент дублирован или утроен, зонды показывают увеличенное количество флуоресцентного красителя. Такие зонды могут использоваться в анализе полного генотипа.
Микрочипы
Микрочипы — это мощные инструменты, используемые в идентификации мутаций ДНК, фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК) или белков. На одном чипе можно проанализировать миллионы различных изменений в ДНК с использованием всего лишь одного образца.
Технологии секвенирования следующего поколения
Применение технологий секвенирования следующего поколения позволяет обнаруживать даже меньшие фрагменты генов и ДНК — сначала расщеплением целого генотипа на небольшие сегменты, а затем проведением анализа последовательности ДНК некоторых или всех сегментов. Затем результаты анализируются с использованием мощного компьютера. Могут быть выявлены одиночные или множественные вариации, а также участки, в которых основания отсутствуют или были помещены в неподходящее место. Стоимость данной технологии значительно снизилась и продолжает снижаться. Также продолжают совершенствоваться оборудование и методы расчетов.
Некоторые такие изменения могут помочь врачам в диагностике генетических заболеваний. Методы секвенирования следующего поколения являются настолько чувствительными, что врачи могут обнаруживать ДНК плода в образце крови, взятом у матери, и анализировать эту ДНК на предмет наличия у плода синдрома Дауна. Однако значительный объем информации, получаемый при анализе генотипа, приводит к самым различным проблемам, которые иногда затрудняют понимание и интерпретацию результатов врачами. Несмотря на эти проблемы, эти технологии стали основой генетического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это — пользовательская версия ВРАЧИ: Нажмите здесь, чтобы перейти к профессиональной версии
ДНК-зонд (англ. DNA probe ) — фрагмент ДНК, меченный тем или иным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. Позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.
Описание
ДНК при температуре 94-100 о С диссоциирует на 2 цепи (денатурируется), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. Этот процесс обратим: при температуре 65 о С происходит восстановление структуры двойной спирали ДНК-гибридизация (ренатурация). Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК. На основе гибридизации осуществляют анализ с помощью ДНК-чипов: аналитические (детектирующие) ДНК-зонды гибридизуются со специфическими последовательностями нуклеиновых кислот и таким образом выявляют их в исследуемых образцах. Флуоресцентно-меченые зонды используются для проведения ПЦР в реальном времени, позволяющей детектировать количество ДНК в исследуемом образце. Также флуоресцентные зонды используются при проведении флуоресцентной гибридизации in situ (FISH — Fluorescence in situ hybridization) — цитогенетического метода, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на хромосомах. В нанотехнологии ДНК-зонды используются при создании детектирующих систем нового поколения (ДНК-наночипы).
Литература
- Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: Принципы и применение. — М.: Мир, 2002. — 589 с.
Ссылки
Wikimedia Foundation . 2010 .
Полезное
Смотреть что такое "ДНК-зонд" в других словарях:
ДНК-зонд — одноцепочечный радиоактивно или ферментомеченный клонированный фрагмент ДНК. Используется в гибридизации реакции (см.) для локализации специфических последовательностей НК в хромосомах, а также для экспресс идентификации микроба в иссл. материале … Словарь микробиологии
ДНК-зонд — Термин ДНК зонд Термин на английском DNA probe Синонимы Аббревиатуры Связанные термины биологические нанообъекты, биомедицинские микроэлектромеханические системы, биосенсор, геном, ДНК, ДНК микрочип, лаборатория на чипе, олигонуклеотид… … Энциклопедический словарь нанотехнологий
ДНК-маркер — Рис.1 Электрофорез ПЦР продуктов в агарозном геле и окрашенных бромистым этидием, полученных методом IRAP амплификации. Левая дорожка ДНК известной длины (от 900 до 3000 пар нуклеотидов) … Википедия
ДНК — Термин ДНК Термин на английском DNA Синонимы дезоксирибонуклеиновая кислота Аббревиатуры ДНК Связанные термины доставка генов, актуатор, бактериофаг, белки, биологические нанообъекты, биомиметика, биомиметические наноматериалы, генная инженерия,… … Энциклопедический словарь нанотехнологий
ДНК-микрочип — Термин ДНК микрочип Термин на английском DNA microarray Синонимы ДНК чип, DNA chip, Gene сhip, DNA chip Аббревиатуры Связанные термины биосенсор, геном, ДНК, ДНК зонд, лаборатория на чипе, РНК, олигонуклеотид Определение Миниатюрная пластина с… … Энциклопедический словарь нанотехнологий
ДНК или РНК зонд — * ДНК альбо РНК зонд * DNA or RNA probe однонитчатая молекула ДНК или РНК с определеной последовательностью нуклеотидов, а также радиоактивно или иммунологически меченная, которую используют для выявления комплементарных пар оснований при… … Генетика. Энциклопедический словарь
ДНК-хвостов образование — * ДНК хвастоў утварэнне * DNA tailing присоединение нуклеотидтрифосфатов к концевым 31 OH группам одно и двунитчатых молекул ДНК с помощью дезоксинуклеотидилтрансферазы (концевой трансферазы). ДНК с такими хвостами используется для получения кДНК … Генетика. Энциклопедический словарь
(зонд) молекулярный — — кДНК или любой др. фрагмент ДНК, используемый для выявления полиморфизма ДНК методом ПДРФ (см.) при построении генетических карт (см.) … Генетика. Энциклопедический словарь
ДНК-зонд (англ. DNA probe ) — фрагмент ДНК, меченный тем или иным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. Позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.
Для мечения зонда могут быть использованы хромофоры (флуоресцентное мечение), радиоактивные изотопы или группы, делающие возможным детектирование в ходе последующей ферментативной реакции (например, биотиновое мечение). [1]
ДНК-зонды могут быть использованы для гетерогенного детектирования целевых нуклеиновых кислот, при которой мишень или зонд прикрепляют к твёрдой фазе или гелевой подложке. К такому типу детектирования относятся саузерн-блот, нозерн-блот, дот-блот, ДНК-микрочип и флуоресцентная гибридизация in situ. После осуществления гибридизации несвязанные избыточные молекулы зонда отмывают. Введённая в ДНК-зонд метка позволяет определить области, в которых произошло связывание ДНК-зонда и мишени [1] .
ДНК-зонды также используют для гомогенного детектирования целевых нуклеиновых кислот без удаления избыточных количеств зонда. При этом успешная гибридизация должна сопровождаться детектируемым изменением определённых свойств зонда. Одно из преимуществ детектирования в гомогенной системе заключается в том, что можно проследить гибридизацию нуклеиновых кислот в реальном времени, при необходимости даже в живой клетке. ДНК-зонды в гомогенной фазе используются в полимеразной цепной реакции в реальном времени. [1]
За последнее десятилетие в гематологической цитогенетике произошли принципиально важные изменения, связанные с появлением и быстрым развитием молекулярно-цитогенетических исследований. Развитие молекулярной цитогенетике позволило перейти на новый уровень изучения клональных генетических нарушений, лежащих в основе развития онкогематологических заболеваний.
Предметом анализа в подобном исследовании являются не только метафазы, но и неделящиеся клетки, составляющие абсолютное большинство клеток в любой популяции. Гибридизация происходит со всеми клетками независимо от фазы клеточного цикла. Это означает что для анализа доступны клеточные популяции в целом, что координально изменяет ситуацию по сравнению с классической цитогенетикой. Становятся доступными для анализа те случаи, когда невозможно получить делящиеся клетки. Кроме того, исключается фактор выборочного выхода в митоз определенных популяций клеток, который при анализе метафаз способен порой существенно исказить реальную картину. Возможность анализа всех без исключения клеточных популяций, присутствующих в исследуемом препарате, включая терминально-дифференцированные клетки, делает метод FISH объективным и репрезентативным методом исследования. С введением в практику этого метода стремительно стало нарастать количество исследований по его использованию в клинической цитогенетике, в том числе применительно к онкогематологическим заболеваниям. В настоящее время метод FISH является важнейшем инструментом для цитогенетического анализа клональных нарушений у гематологических больных.
Флуоресцентная гибридизация in situ включает несколько обязательных этапов: денатурации, гибридизации, выявления (детекции) ДНК-зонда.
Цитогенетический препарат фиксируется на предметных стеклах по стандартной цитогенетической методике. Затем ядерная молекула ДНК, существующая в форме двойной полинуклеотидной цепи, подвергается процессу тепловой денатурации. Под действием температуры происходит разрыв водородных связей между комплементарными парами оснований, в результате чего молекула ДНК распадается на две отдельные полинуклеотидные цепи. Для того, чтобы несколько снизить температуру процесса (приблизительно с 95 до 70 °C), денатурацию проводят в растворе формамида, ослабляющего водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями.
Полученные одиночные полинуклеотидные цепи ДНК вступают затем в реакцию гибридизации с предварительно денатурированным в тех же условиях ДНК-зондом. Обязательным условием эффективной гибридизации является многократное избыточное количество зонда по отношению к количеству ядерной ДНК. Только в этом случае зонд может успешно конкурировать за место связывания со второй комплементарной цепью ДНК, присутствующей на стекле. Инкубацию проводят в гибридизационном буфере при 37 °C, время гибридизации зависит от типа используемого зонда. В результате гибридизации вновь образуется двухцепочечная молекула, включившая ДНК-зонд, связанный с комплементарной ему последовательностью нуклеотидов. После этого полученные препараты многократно отмывают для удаления несвязавшегося избытка зонда и предотвращения возможного неспецифического связывания его с другими участками ДНК.
Следующим шагом является контрастное по цвету окрашивание клеточных ядер с помощью ДНК-специфичного флуоресцентного красителя. После этого препарат готов к анализу с помощью флуоресцентного микроскопа, где под воздействием возбуждающего света определенного спектра, молекулы флуорохромов начинают испускать кванты света, длина волны которых зависит от свойств используемого флуорохрома. Анализ флуоресцентных сигналов позволяет получить объективную информацию о состоянии исследуемого хромосомного локуса.
Для анализа флуоресцентных сигналов используют флуоресцентный микроскоп с набором фильтров, соответствующих спектральным характеристикам флуорохромов. Выпускаемые фильтры могут быть одинарными, двойными или тройными. По отношению к FISH-анализу каждый из них имеет свою область применения. Одинарные фильтры предназначены для анализа сигнала только одного флуорохрома. Набор одинарных фильтров, соответствующий спектру применяемых флуорохромов, позволяет последовательно просмотреть и проанализировать все флуоресцентные сигналы. С помощью компьютерного анализа в этом случае можно получить картину, адекватно отображающую распределение сигналов разного цвета в ядре или метафазной пластинке. Однако, непосредственно увидеть разноцветные сигналы в ядре одновременно можно, только используя двойные и тройные фильтры. Двойные фильтры в основном предназначены для работы с одноцветными ДНК-зондами. С их помощью достигается эффект одновременной визуализации флуоресцентного сигнала зонда и контрастно окрашенного ядерного материала, например, зеленый сигнал флуорисцеина на фоне красного ядра, окрашенного PI.Тройной фильтр необходим для работы с двуцветным
ДНК-зондами. Он позволяет одновременно наблюдать красный, зеленый, комбинированный желтый сигналы и контрастно окрашенный в голубой цвет ядерный материал.
ДНК-зонды являются центральным и определяющим звеном при проведении in situ гибридизации. Необходимо всегда помнить, что та или иная хромосомная аномалия может быть выявлена только в том случае, если в распоряжении исследователя имеется соответствующий задаче ДНК-зонд. От типа зонда зависит и система анализа наблюдаемых флуоресцентных сигналов. Поэтому полная информация о специфике используемого зонда является залогом успешной гибридизации и правильной оценки полученных результатов FISH-анализа.
ДНК-зонды бывают двух типов – непрямые и прямые, в зависимости от того, каким образом они помечены. В непрямых ДНК-зондах в синтезированную полинуклеотидную цепь включены нуклеотиды, к которым присоединены гаптены: биотин (витамин H) или дигоксигенин (фитогормон). Эти биологически активные вещества имеют небольшого размера молекулы, обладают термоустойчивостью и легко выдерживают жесткие условия тепловой денатурации ДНК и горячего отмывания препаратов при проведении гибридизации, кроме того они недороги и удобны в работе.
Детекция биотинилированных ДНК-зондов основана на высоком сродстве к биотину белка авидина. Конъюгированный с флуорохромом авидин необратимо связывается с молекулами биотина, наблюдается затем флуоресцентный сигнал позволяет обнаружить ДНК-зонд в клеточном ядре. Меченые дигоксигенином ДНК-зонды инкубиуют с антителами к дигоксигенину, конъюгированными с флуорохромом. Интенсивность флуорисценции непрямых зондов может быть усилена за счет дополнительной инкубации с меченными флуорохромом антителами. Эта возможность усиления флуорисцентного сигнала повышает чувствительность метода при использовании непрямых зондов.
При использовании прямых ДНК-зондов, уже содержащих в своем составе флуорохром, дополнительного инкубирования с антителами естественно не требуется.
В качестве флуорохромов для мечения зондов чаще всего используют зеленый флуоресцеин (FITC), красные родамин и техасский красный (Texas Red). Для визуализации ядерного материала на препараты наносят раствор, содержащий флуорохром, тропный кДНК. В состав раствора входит также вещество, предохраняющее флуорохромы от быстрого истощения.
Основными флуорохромами, используемыми для визуализации клеточных ядер, являются красный пропидиум йодид (PI) и голубой 4.6 диамино-2-фенилиндол (DAPI). Главный принцип при подборе флуорохромов – это принцип цветового контраста.
ДНК-зонды, применяемые в гематологической цитогенетике, можно подразделить на несколько групп.
ДНК-зонды к центромерным участкам хромосом предназначены для идентификации центромерных регионов хромосом и выявления количественных нарушений кариотипа в интерфазных ядрах и метафазах. Эти зонды содержат сравнительно короткие последовательности нуклеотидов, комплементарные многочисленным хромосом-специфическим альфа-сателлитным ДНК-повторам, локализованным в центромерных участках хромосом. Поэтому для зондов этого типа характерна строгая хромосомная специфичность и яркость генерированного флуоресцентного сигнала.
Для выявления диагностически и прогностически значимых количественных хромосомных нарушений в гематологии используют индивидуальные центромерные зонды, например к хромосомам 7,8,12,X/Y. При использовании одного центромерного ДНК-зонда в нормальном интерфазном ядре или метафазе наблюдается два ярких флуоресцентных сигнала. В случае изменения числа копий данной хромосомы наблюдается один (моносомия), три (трисомия) или более сигналов.
При использовании комбинированного ДНК-зонда к хромосомам X/Y центромерные участки половых хромосом помечены флуорохромами генерирующими сигнал разного цвета. Клетки с женским кариотипом в этом случае характеризуются двумя одноцветными сигналами, в клетках с мужским кариотипом наблюдается два сигнала разного цвета.
ДНК-зонды к теломерным участкам хромосом предназначены для выявления делеций и перестроек, затрагивающих концевые участки плечей хромосом. Теломерные ДНК-зонды специфичны для p или q плечей хромосом и комплементарны участку длиной около 300 kb от конца хромосомы. Как правило, зонды к теломерным участкам p и q плечей связаны с разными флуорохромами. Это обстоятельство позволяет проводить детекцию двух различных концевых хромосомных участков на одном цитогенетическом препарате. При проведении анализа концевых делеций с помощью подобных зондов в интерфазных ядрах возникает неопределенность. Отсутствие одного сигнала может свидетельствовать как о делеции концевого участка хромосомы, так и о потере хромосомы. В этом случае удобно одновременно использовать ДНК-зонд к центромерному участку той хромосомы, связанный с флуорохромом другого цвета. В интерфазном ядре, несущем делецию, будет наблюдаться два флуоресцентных сигнала от центромерных участков хромосомы и только один сигнал другого цвета – от теломерного участка.
Локус-специфичные ДНК-зонды составляют еще одну группу зондов. К этому виду относят все ДНК – зонды, которые гибридизуются с уникальными (неповторяющимися) последовательностями ДНК. Среди них заметное место занимают зонды, предназначенные для выявления диагностически и прогностически значимых в гематологии транслокаций, делеций, инверсий.
Читайте также: