Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот кратко

Обновлено: 02.07.2024

1. Физико-химические свойства ДНК: денатурация, ренатурация, вязкость, поглощение в УФ, реакционноспособность

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА ДНК: ДЕНАТУРАЦИЯ,
РЕНАТУРАЦИЯ, ВЯЗКОСТЬ,
ПОГЛОЩЕНИЕ В УФ,
РЕАКЦИОННОСПОСОБНОСТЬ
Подготовили: Гильмуллина Л.Р., Колесникова
А.И.
Группа: 01-503
Сентябрь 2017г

2. Денатурация ДНК

ДЕНАТУРАЦИЯ ДНК
Денатурация ДНК (DNA denaturation) [лат. de— приставка, означающая отделение,
удаление, уничтожение, отмену чего-либо, и
natura — природные свойства, природа] —
расхождение цепей двухцепочечной молекулы
ДНК вследствие различных воздействий
(температура, рН, денатурирующие агенты,
химические факторы – мочевина,
гуанидинхлорид, кислота), что сопровождается
потерей ее биологической активности и
разрушения структуры ДНК.
2

3. Ренатурация

РЕНАТУРАЦИЯ
Ренатурация(процесс воссоединения,
реассоциации или отжиг) - это процесс
восстановления нативной конформации ДНК,
происходит при понижении температуры или
рН.
Если температура или рН понижаются
постепенно, то цепи соединяются правильно, с
восстановлением всех исходных пар оснований.
При резком понижении температуры или рН
правильное воссоединение комплементарных
цепей затрудняется из-за спаривания
оснований локально комплементарных
участков в пределах одной или разных цепей.
3

4. Денатурация (диссоциация) двухцепочечной ДНК при повышении температуры раствора и ренатурация (реассоциация) двух

ДЕНАТУРАЦИЯ (ДИССОЦИАЦИЯ) ДВУХЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК ПРИ
ПОВЫШЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ РАСТВОРА
И РЕНАТУРАЦИЯ (РЕАССОЦИАЦИЯ) ДВУХ КОМПЛЕМЕНТАРНЫХ
ЦЕПЕЙ ПРИ ОХЛАЖДЕНИИ
4

5. Вязкость и Реакционноспособность

ВЯЗКОСТЬ И РЕАКЦИОННОСПОСОБНОСТЬ
Растворы ДНК характеризуются аномальной
(структурной) вязкостью, что объясняется
удлиненной формой молекул. Величина
вязкости зависит от конформации молекул.
По реакционной способности молекулы ДНК
относятся к категории химически ин
ертных
веществ.
5

6. Mеханизм действия ультрафиолетового излучения на нуклеиновую кислоту

MЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО
ИЗЛУЧЕНИЯ НА НУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ
Основное действие ультрафиолетовых лучей на
нуклеиновую кислоту заключается в том, что последняя
теряет биологическую активность, т. е. способность
передавать заключенную в ней информацию. При этом
основную роль в инактивации ДНК играют процессы
димеризации тиминовых оснований.
6

ДНК поглощает свет в ультрафиолетовой
области спектра с максимумом ~ 260 нм.
Поглощение для нативной двуспиральной ДНК на
40-50% меньше, чем поглощение смеси свободных
нуклеотидов того же состава.
7

8. Вывод:

ВЫВОД:
Диссоциация (денатурация) и реассоциация
(ренатурация) ДНК играют ключевую роль в
реализации разнообразных биологических функций
in vivo. Способность двух отдельных
комплементарных цепей нуклеиновой кислоты
воссоединяться с образованием исходной структуры
является ключевым моментом для проведения
соответствующих опытов in vitro, а также для
выделения, сравнения и идентификации
специфических нуклеиновых кислот. Уникальная
способность нуклеиновой кислоты образовывать
двойные спирали путем ассоциации одиночных
комплементарных цепей имеет огромное значение
для самых разных областей генетики.
Подобно большинству мутагенов, УФ-лучи
индуцируют в ДНК предмутационные повреждения.
8

Полное расплетение цепей и их разделение называют денатурацией. Денатурация происходит только in vitro. Двухцепочечная ДНК может быть денатурирована воздействием высоких температур.

При медленном повышении температуры двойная спираль ДНК денатурирует постепенно, за счет нарушения стэкинг и водородных связей. Две цепи постепенно расплетаются и наконец полностью диссоциируют (разделяются). Температура, при которой половина молекулы ДНК подверглась денатурации, называется точкой плавления

Ренатурация происходит самопроизвольно при охлаждении раствора, в котором содержатся диссоциировавшие цепи ДНК.

Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК.

Функции нуклеиновых кислот.

1. ДНК – геномная (хранение и передача наследственной информации)

2. РНК - геномная (вирусы), рибосомальная, матричная

3. РНК - затравки/ праймеры участвуют в репликации ДНК)

4. Антисмысловая РНК (соединяется с ДНК, в результате соединения репликации не будет)

5. РНК учавствует в обратной транскрипции, является матрицей для синтеза ДНК

6. Рибозины, ферменты (белок+РНК= теломераза)

Механизм репликации по Уотсону и Крику. Эксперимент Мезельсона и Сталя.

Модель ДНК Уотсона и Крика сразу же позволила понять принцип удвоения ДНК. Поскольку каждая из цепей ДНК содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную другой цепи, при удвоении ДНК цепи расходятся, а затем каждая цепь служит матрицей, на которой выстраивается комплементарная ей новая цепь ДНК. В результате образуются два дуплекса ДНК, каждый из которых состоит из одной цепи исходной родительской молекулы ДНК и одной новосинтезированной цепи. Экспериментально показано, что именно так, по полуконсервативному механизму, происходит репликация ДНК.

Эксперимент Мезельсона-Сталя - эксперимент, проведённый двумя молекулярными биологами — Мэтью Мезельсоном и Франклином Сталем в 1958 году. Он показал, что репликация ДНК имеет полуконсервативный характер. Это означает, что каждая дочерняя двойная спираль ДНК состоит из одной старой (матричной) цепи и из одной вновь синтезированной цепи.

Мезельсон и Сталь показали, что если вырастить несколько поколений бактерий Escherichia coli в среде, богатой 15N или 14N, затем центрифугировать их ДНК в градиенте плотности хлористого цезия, то окажется, что более тяжёлая 15N-ДНК останавливается ближе ко дну центрифужной пробирки, чем 14N-ДНК.

Для того чтобы установить механизм репликации, E. coli, которые в течение нескольких поколений росли в 15N-содержащей среде (а значит их ДНК содержала только 15N) были перенесены в 14N-содержащую среду, где им было позволено разделиться только один раз. Плотность выделенной из этих клеток ДНК оказалась больше плотности ДНК бактерий, выращенных в среде, богатой 14N, но меньше плотности ДНК бактерий, выращенных в 15N среде.

Термодинамика нуклеиновых кислот это исследование того, как температура влияет на структура нуклеиновой кислоты двухцепочечного ДНК (дцДНК). Температура плавления (Т_м) определяется как температура, при которой половина нитей ДНК находится в случайный катушки или одноцепочечное (оцДНК) состояние. Т_м зависит от длины молекулы ДНК и ее специфики нуклеотид последовательность. ДНК, когда она находится в состоянии, когда две ее цепи диссоциированы (т. Е. Молекула дцДНК существует как две независимые цепи), упоминается как подвергшаяся диссоциации. денатурированный высокой температурой.

Содержание

Концепции

Гибридизация

Гибридизация - это процесс создания нековалентный, специфичное для последовательности взаимодействие между двумя или более дополнительный нити нуклеиновые кислоты в единый комплекс, который в случае двух цепей называется дуплекс. Олигонуклеотиды, ДНК, или же РНК будут связываться со своим комплементом в нормальных условиях, поэтому две идеально дополняющие друг друга нити будут легко связываться друг с другом. Чтобы уменьшить разнообразие и получить наиболее энергетически предпочтительные комплексы, метод, называемый отжиг используется в лабораторной практике. Однако из-за различной молекулярной геометрии нуклеотидов единственное несоответствие между двумя цепями сделает связывание между ними менее энергетически выгодным. Измерение эффектов несовместимости оснований путем количественной оценки температуры, при которой отжигаются две нити, может предоставить информацию о сходстве в последовательности оснований между двумя отжигаемыми цепями. Комплексы могут быть диссоциированы термическим денатурация, также называемый плавлением. При отсутствии внешних негативных факторов процессы гибридизации и плавления могут повторяться подряд до бесконечности, что создает основу для полимеразной цепной реакции. Чаще всего образуются пары нуклеиновых оснований A = T и G≡C, из которых последнее более стабильно.

Денатурация

Процесс денатурации ДНК можно использовать для анализа некоторых аспектов ДНК. Поскольку пары оснований цитозина / гуанина обычно сильнее, чем пары оснований аденина / тимина, количество цитозина и гуанина в геноме (называемое "Содержимое GC") можно оценить путем измерения температуры плавления геномной ДНК. [2] Более высокие температуры связаны с высоким содержанием GC.

Денатурацию ДНК также можно использовать для обнаружения различий в последовательностях между двумя разными последовательностями ДНК. ДНК нагревают и денатурируют в одноцепочечное состояние, а смесь охлаждают, чтобы позволить цепям повторно гибридизоваться. Гибридные молекулы образуются между похожими последовательностями, и любые различия между этими последовательностями приведут к нарушению спаривания оснований. В геномном масштабе этот метод использовался исследователями для оценки генетическая дистанция между двумя видами, процесс, известный как ДНК-ДНК гибридизация. [3] В контексте единственной изолированной области ДНК, денатурирующие гели градиента и гели температурного градиента могут быть использованы для обнаружения наличия небольших несоответствий между двумя последовательностями, процесс, известный как гель-электрофорез в градиенте температуры. [4] [5]

Методы анализа ДНК, основанные на температуре плавления, имеют недостаток в том, что они являются прокси для изучения лежащей в основе последовательности; Секвенирование ДНК обычно считается более точным методом.

Процесс плавления ДНК также используется в методах молекулярной биологии, особенно в полимеразной цепной реакции. Хотя температура плавления ДНК не является диагностической в методике, методы оценки Т_м важны для определения подходящей температуры для использования в протоколе. Температуры плавления ДНК также могут использоваться в качестве показателя для выравнивания сил гибридизации набора молекул, например олигонуклеотидные зонды ДНК-микрочипы.

Отжиг

Отжиг, в генетика, средства для комплементарные последовательности одноцепочечных ДНК или же РНК спариваться водородные связи образовывать двухцепочечный полинуклеотид. Перед отжигом одну из нитей может потребоваться фосфорилированный ферментом, таким как киназа чтобы обеспечить правильное водородное связывание. Термин отжиг часто используется для описания связывания ДНК-зонд, или привязка грунтовка к цепи ДНК во время полимеразной цепной реакции. Этот термин также часто используется для описания реформации (ренатурация) обратно-комплементарных нитей, которые были разделены нагреванием (термически денатурированы). Белки, такие как RAD52 может помочь отжигу ДНК. ДНК отжиг прядей является ключевым этапом на пути гомологичная рекомбинация. В частности, во время мейоз, отжиг прядей, зависящий от синтеза является основным путем гомологичной рекомбинации.

Штабелирование

Стабильность при плавлении стопок пар оснований (B ДНК) [6]

Шаг	Плавление ΔG °₃₇ (Ккал / моль)
Т А	-0.12
T G или же C A	-0.78
C G	-1.44
А G или же C T	-1.29
А А или же Т Т	-1.04
В	-1.27
G A или же Т С	-1.66
С С или же G G	-1.97
А С или же G T	-2.04
G C	-2.70

Укладка - это стабилизирующее взаимодействие между плоскими поверхностями соседних оснований. Сложение может происходить с любой гранью основания, то есть 5'-5 ', 3'-3' и наоборот. [7]

Накопление "свободных" молекул нуклеиновой кислоты в основном обеспечивается межмолекулярная сила, в частности, электростатическое притяжение между ароматическими кольцами, процесс, также известный как пи стекинг. Для биологических систем с водой в качестве растворителя: гидрофобный эффект способствует и помогает в формировании спирали. [8] Укладка - главный стабилизирующий фактор двойной спирали ДНК. [9]

Вклад стэкинга в свободную энергию молекулы можно экспериментально оценить, наблюдая равновесие изогнутого стэка в порезанная ДНК. Такая стабилизация зависит от последовательности. [6] Степень стабилизации зависит от концентрации соли и температуры. [9]

Термодинамика модели двух состояний

Для расчета используются несколько формул Т_м значения. [10] [11] Некоторые формулы более точны при прогнозировании температуры плавления дуплексов ДНК. [12] Для олигонуклеотидов ДНК, то есть коротких последовательностей ДНК, термодинамика гибридизации может быть точно описана как процесс с двумя состояниями. В этом приближении можно пренебречь возможностью промежуточных состояний частичного связывания при образовании двухцепочечного состояния из двух одноцепочечных олигонуклеотидов. Исходя из этого предположения, можно элегантно описать термодинамические параметры для образования двухцепочечной нуклеиновой кислоты AB из одноцепочечных нуклеиновых кислот A и B.

Температура плавления, Т_м, возникает, когда диссоциировала половина двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Если дополнительных нуклеиновых кислот нет, то [A], [B] и [AB] будут равны и равны половине исходной концентрации двухцепочечной нуклеиновой кислоты, [AB]_{исходный}. Это дает выражение для температуры плавления дуплекса нуклеиновой кислоты

Поскольку Δграмм° = ΔЧАС° -ТΔS°, Т_м также дается

Члены ΔЧАС° и ΔS° обычно даются для ассоциации, а не для реакции диссоциации (см., Например, метод ближайшего соседа). Затем эта формула превращается в: [13]

В предыдущем абзаце показано, как температура плавления и термодинамические параметры (Δграмм° или ΔЧАС° и ΔS°) связаны друг с другом. Наблюдая за температурами плавления, можно экспериментально определить термодинамические параметры. И наоборот, что важно для приложений, когда термодинамические параметры данной последовательности нуклеиновой кислоты известны, температура плавления может быть предсказана. Оказывается, для олигонуклеотидов эти параметры могут быть хорошо аппроксимированы моделью ближайшего соседа.

Метод ближайшего соседа

Свободная энергия образования этой ДНК из отдельных цепей Δграмм°, представлен (при 37 ° C) как

Δграмм°₃₇(прогноз) = Δграмм°₃₇(Инициирование C / G) + Δграмм°₃₇(CG / GC) + Δграмм°₃₇(GT / CA) + Δграмм°₃₇(TT / AA) + Δграмм°₃₇(ТГ / АС) + Δграмм°₃₇(GA / CT) + Δграмм°₃₇(Запуск A / T)

За исключением члена инициирования C / G, первый член представляет свободную энергию первой пары оснований, CG, в отсутствие ближайшего соседа. Второй член включает как свободную энергию образования второй пары оснований, GC, так и стэкинг-взаимодействие между этой парой оснований и предыдущей парой оснований. Остальные термины определяются аналогично. В общем, свободная энергия образования дуплекса нуклеиновой кислоты равна

Каждый Δграмм° терм имеет энтальпию, ΔЧАС° и энтропийное ΔS°, параметры, поэтому изменение свободной энергии также определяется выражением

Значения ΔЧАС° и ΔS° были определены для десяти возможных пар взаимодействий. Они приведены в таблице 1 вместе со значением Δграмм° рассчитано при 37 ° C. Используя эти значения, значение Δграмм₃₇° для показанного выше дуплекса ДНК составляет -22,4 кДж / моль. Экспериментальное значение -21,8 кДж / моль.

Таблица 1. Параметры ближайшего соседа для дуплексов ДНК / ДНК в 1 М NaCl. [13]

Последовательность ближайшего соседа (5'-3'/3'-5')	Δ ЧАС ° кДж / моль	Δ S ° Дж / (моль · К)	Δ грамм °₃₇ кДж / моль
AA / TT	−33.1	−92.9	−4.26
AT / TA	−30.1	−85.4	−3.67
TA / AT	−30.1	−89.1	−2.50
CA / GT	−35.6	−95.0	−6.12
GT / CA	−35.1	−93.7	−6.09
CT / GA	−32.6	−87.9	−5.40
GA / CT	−34.3	−92.9	−5.51
CG / GC	−44.4	−113.8	−9.07
GC / CG	−41.0	−102.1	−9.36
GG / CC	−33.5	−83.3	−7.66
Клемма A / T базовая пара	9.6	17.2	4.31
Клемма G / C базовая пара	0.4	−11.7	4.05

Параметры, связанные с десятью группами соседей, показанными в таблице 1, определяют по температурам плавления коротких олигонуклеотидных дуплексов. Любопытно, что только восемь из десяти групп независимы.

Модель ближайшего соседа может быть расширена за пределы пар Уотсона-Крика, чтобы включить параметры для взаимодействий между несовпадениями и соседними парами оснований. [14] Это позволяет оценивать термодинамические параметры последовательностей, содержащих изолированные несовпадения, такие как, например, (стрелки указывают на несовпадение)

Эти параметры были подобраны на основе экспериментов по плавлению, и расширение таблицы 1, которая включает несоответствия, можно найти в литературе.

Денатурация белков. Ренатурация белков.

Под денатурацией понимают утрату трехмерной конформации, присущей данной белковой молекуле. Это изменение может носить временный или постоянный характер, но и в том, и в другом случае аминокислотная последовательность белка остается неизменной. При денатурации молекула развертывается и теряет способность выполнять свою обычную биологическую функцию. Вызывать денатурацию белков могут разнообразные факторы, перечисленные ниже.

Нагревание или излучение белка, например инфракрасное или ультрафиолетовое. Кинетическая энергия, сообщаемая белку, вызывает вибрацию его атомов, вследствие чего слабые водородные и ионные связи разрываются,и белок свертывается (коагулирует).

Сильные кислоты, щелочи, соли денатурируют белок. Под действием этих реагентов ионные связи разрываются и белок коагулирует. Длительное воздействие реагента может вызвать разрыв и пептидных связей.

Тяжелые металлы денатурируют белок. Положительно заряженные ионы тяжелых металлов (катионы) образуют прочные связи с отрицательно заряженными карбоксил-анионами R-групп белка и часто вызывают разрывы ионных связей. Они также снижают электрическую поляризацию белка, уменьшая его растворимость. Вследствие этого находящийся в растворе белок выпадает в осадок.

Органические растворители и детергенты денатурируют белок. Эти реагенты нарушают гидрофобные взаимодействия и образуют связи с гидрофобными (неполярными) группами. В результате разрываются и внутримолекулярные водородные связи. Использование спирта в качестве дезинфицирующего средства основано именно на том, что он вызывает денатурацию белка любых присутствующих бактерий.

Ренатурация белков

Иногда денатурированный белок в подходящих условиях вновь спонтанно приобретает свою нативную структуру. Этот процесс называется рена-турацией. Ренатурация убедительно показывает, что третичная структура белка полностью определяется его первичной структурой и что сборка биологических объектов может осуществляться на основе немногих общих принципов.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Читайте также: