Сообщение о генной инженерии

Обновлено: 05.07.2024

Генная инженерия — это современное направление биотехнологии, объединяющее знания, приемы и методики из целого блока смежных наук — генетики, биологии, химии, вирусологии и так далее — чтобы получить новые наследственные свойства организмов.

Перестройка генотипов происходит путем внесения изменений в ДНК (макромолекулу, обеспечивающую хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) и РНК (одну из трех основных макромолекул, содержащихся в клетках всех живых организмов).

Если внести в растение, микроорганизм, организм животного или даже человека новые гены, можно наделить его новой желательной характеристикой, которой до этого он никогда не обладал. С этой целью сегодня генная инженерия используется во многих сферах. Например, на ее основе сформировалась отдельная отрасль фармацевтической промышленности, представляющая собой одну из современных ветвей биотехнологии.

История развития

Истоки

Параллельно с этим шел процесс формирования знаний о ДНК. Так, в 1869 году швейцарский биолог Фридрих Мишер открыл факт существования макромолекулы, а в 1910 году американский биолог Томас Хант Морган обнаружил на основе характера наследования мутаций у дрозофил, что гены расположены линейно на хромосомах и образуют группы сцепления. В 1953 году было сделано важнейшее открытие — американец Джон Уотсон и британец Фрэнсис Крик установили молекулярную структуру ДНК.

На подъеме

К концу 1960-х годов генетика активно развивалась, а ее важными объектами стали вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов, а в 1970-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК.

Генная инженерия как отдельное направление исследовательской работы зародилась в США в 1972 году, когда в Стэнфордском университете ученые Пол Берг, Стэнли Норман Коэн, Герберт Бойер и их научная группа внедрили новый ген в бактерию кишечной палочки (E. coli), то есть создали первую рекомбинантную ДНК.

Техника ПЦР была впервые разработана в 1980-х годах американским биохимиком Кэри Маллисом. Будущий лауреат Нобелевской премии по химии (1993 года), обнаружил в специфический фермент — ДНК-полимеразу, который участвует в репликации ДНК. Этот фермент буквально считывает отрезки цепи нуклеотидов молекулы и использует их в качестве шаблона для последующего копирования генетической информации.

Новая эра

В 1996 году методом пересадки ядра соматической клетки в цитоплазму яйцеклетки на свет появилось первое клонированное млекопитающее — овца Долли. Это событие стало революционным в истории развития генной инженерии, потому что впервые стало возможным серьезно говорить о создании клонов и выращивании живых организмов на основе молекул.

Технологии генной инженерии

Генная инженерия за короткий срок оказала огромное влияние на развитие различных молекулярно-генетических методов и позволила существенно продвинуться на пути познания генетического аппарата.

Теоретически, технология CRISPR может позволить редактировать любую генетическую мутацию и излечивать заболевание, которое она вызывает. Но практические разработки CRISPR в качестве терапии еще только в начальной стадии, и многое еще непонятно.

Есть и другие методы генной инженерии, например, ZFN и TALEN.

ZFN разрезает ДНК и вставляет туда заготовленный заранее новый фрагмент с помощью белков с ионами цинка (отсюда название — Zinc Finger Nuclease).
TALEN делает то же самое, только используя TAL-белки. Для обеих технологий приходится создавать отдельные белки, а это очень долгая работа, поэтому пока два этих метода особого применения не нашли.

Где и как применяется генная инженерия

Медицина

Уже сейчас активно применяется инсулин человека (хумулин), полученный посредством рекомбинантных ДНК. Клонированные гены человеческого инсулина были введены в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. С 1982 года компании США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин.

Кроме того, несколько сотен новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику. Среди лекарств, находящихся в стадии клинического изучения, препараты, потенциально лечащие артрозы, сердечно-сосудистые заболевания, онкологию и СПИД. Среди нескольких сотен генно-инженерных компаний 60% заняты именно разработкой и производством лекарственных и диагностических средств.

Сельское хозяйство

В сельском хозяйстве одна из важнейших задач генной инженерии — получение растений и животных, устойчивых к вирусам. В настоящее время уже есть виды, способные противостоять воздействию более десятка различных вирусных инфекций.

Еще одна задача связана с защитой растений от насекомых-вредителей. Путем генетической модификации растений можно уменьшить интенсивность обработки полей пестицидами. Например, трансгенные растения картофеля и томатов стали устойчивы к колорадскому жуку, растения хлопчатника — к разным насекомым, в том числе и к хлопковой совке.

Использование генной инженерии позволило сократить применение инсектицидов (препаратов для уничтожения насекомых) на 40–60%.

С помощью генной инженерии пытаются решить и экологические проблемы. Так, уже созданы особые сорта растений с функцией очистки почвы. Они поглощают цинк, никель, кобальт и иные опасные вещества из загрязненных промышленными отходами почв.

Скотоводство

В Кемеровской области работа генетиков позволила получить устойчивое к вирусу лейкоза племенное поголовье высокопродуктивных животных. Для проведения эксперимента кузбасские ученые отобрали здоровых коров черно-пестрой породы массой до 500 кг. Животным трансплантировали модифицированные эмбрионы, устойчивые к вирусу лейкоза. В середине сентября 2020 года родилось 19 телят с измененными генами.

По словам Зубовой, лейкоз крупного рогатого скота — вирусная хронически неизлечимая болезнь, при которой возникают поражение кроветворной системы и новообразования. Данное заболевание наносит значительный ущерб генофонду пород и мясной промышленности в целом, потому что мясо зараженных животных запрещено употреблять в пищу. Единственным доступным методом борьбы с лейкозом ранее было только уничтожение зараженного скота.

Этот успех позволяет говорить о том, что в дальнейшем будет возможно редактировать гены крупного рогатого скота и от других болезней.

С прицелом на человека

В 2009 году группа ученых под руководством молодого исследователя Джея Нейтца из Вашингтонского университета сумели с помощью генной терапии вернуть обезьянам способность различать оттенки зеленого и красного, которой они были лишены от рождения.

В область сетчатки глаза двух подопытных обезьян был введен безвредный вирус, несущий недостающий ген фоточувствительного рецептора. Вскоре после процедуры обе обезьяны начали различать оттенки красного и зеленого на сером фоне. Два года наблюдения не выявили у них каких-либо нарушений, поэтому ученые не исключают, что данную методику уже вскоре можно будет применять у людей, страдающих дальтонизмом.

Ученые шагнули еще дальше и уже пробуют выращивать в теле животных органы для трансплантации людям. Для минимизации риска отторжения тканей животным вводят специальные гены. Этими опытами занимается научная лаборатория Рослинского института в Великобритании, которая представила миру овцу Долли.

В 2019 году британские ученые вывели кур, яйца которых содержат два вида человеческих белков, способных противодействовать артриту и некоторым видам онкологических заболеваний. В яйцах содержится человеческий белок под названием IFNalpha2a, обладающий мощными противовирусными и противораковыми свойствами, а также человеческий и свиной вариант белка под названием макрофаг-CSF, который планируют использовать для создания препарата, стимулирующего самостоятельное заживление поврежденных тканей.

Изменение ДНК человека

Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы.

14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей наследственным иммунодефицитом, обусловленным мутацией в гене аденозиндезаминазы (АDA), были пересажены ее собственные лимфоциты.

Работающая копия гена ADA была введена в клетки крови с помощью модифицированного вируса, в результате чего клетки получили возможность самостоятельно производить необходимый белок. Через шесть месяцев количество белых клеток в организме девочки поднялось до нормального уровня.

После этого область генной терапии получила толчок к дальнейшему развитию. С 1990-х годов сотни лабораторий ведут исследования по использованию генной терапии для лечения различных заболеваний. Уже сегодня с помощью генной терапии можно лечить диабет, анемию и некоторые виды онкологии.

Содержание:

История развития

Истоки

На подъеме

Новая эра

Технологии генной инженерии

Есть и другие методы генной инженерии, например, ZFN и TALEN.

ZFN разрезает ДНК и вставляет туда заготовленный заранее новый фрагмент с помощью белков с ионами цинка (отсюда название — Zinc Finger Nuclease).
TALEN делает то же самое, только используя TAL-белки. Для обеих технологий приходится создавать отдельные белки, а это очень долгая работа, поэтому пока два этих метода особого применения не нашли.

Где и как применяется генная инженерия

Медицина

Сельское хозяйство

Скотоводство

С прицелом на человека

Изменение ДНК человека

Генная терапия

Генная терапия — введение, удаление или изменение генетического материала, в частности ДНК или РНК, в клетке пациента для лечения определенного заболевания.

Существует три основных стратегии использования генной терапии:

В 2015 году впервые была проведена процедура изменения ДНК человека с целью продления молодости клеток, когда американке Элизабет Пэрриш 44 лет ввели в организм препарат, влияющий на ДНК, а в 2018 году китайский ученый Хэ Цзянькуй заявил, что с его помощью у двух детей-близнецов якобы изменены гены для выработки у них иммунитета к вирусу ВИЧ, носителем которого являлся их отец.

Все это, с одной стороны, выглядит грандиозно и обнадеживает, но с другой, — вызывает опасения, ведь генетические манипуляции, теоретически, возможно использовать не только в благих и мирных целях.

После эксперимента с ДНК близнецов в Китае, ЮНЕСКО выступила с инициативой о запрете изменения генов у новорожденных до того момента, пока достоверно не будет доказана безопасность таких манипуляций.

Этическая сторона вопроса

В 1997 году ЮНЕСКО выпустила Всеобщую декларацию о геноме человека и его правах, рекомендовав мораторий на генетическое вмешательство в зародышевую линию человека, а в декабре 2015 года на международном саммите по геномному редактированию человека изменение гаметоцитов и эмбрионов для генерации наследственных изменений у людей было объявлено безответственным.

Российское сообщество генетиков в большинстве своем считает, что такие эксперименты на данный момент преждевременны и требуют более глубокого исследования и обсуждений.

Страх неизвестности

Вариантов развития событий в области генной инженерии существует множество, и далеко не все они изучены и, в принципе, известны. Поэтому они должны быть последовательно зафиксированы и регламентированы.

Естественно, больше всего опасений вызывают плохие сценарии развития событий. Как правило, все начинается с помощи людям и изобретения новых лекарств. Но потом человек может прийти к желанию сделать своего ребенка светловолосым и зеленоглазым или создать армию универсальных солдат, не боящихся боли и не ведающих страха.

Эксперты убеждены, что генная инженерия — это будущее медицины. Возможность избавить младенца от пожизненного гнета заболевания, излечить людей от рака, найти лекарство против ВИЧ — за всем этим будет стоять генная инженерия. При этом желание человека изменить, например, цвет глаз или предотвратить наследственное заболевание, несмотря на все риски, будет только расти. И похоже, что остановить этот процесс уже не представляется возможным.

Поэтому приоткроем завесу тайны над одной из актуальнейших тем последних пятидесяти лет. Поговорим сегодня о том, что такое генная инженерия, для чего она нужна, и чем отличается от генетической селекции.

Генная инженерия – что это такое

Все живые организмы на Земле – это сложные биологические системы, развитие которых происходит по запрограммированному алгоритму. Данный алгоритм записан в молекулах ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). В этой макромолекуле зашифрованы сведения о наследственной генетической информации.

ДНК состоит из генов. Каждый из них отвечает за какой-либо наследственный признак или участвует в формировании ряда признаков.

Внешняя среда может лишь в незначительной степени влиять на изменение запрограммированного природой алгоритма.

Развитие науки во второй половине 20 века сделало возможным изучить строение ДНК и научиться корректировать гены. Так возникло новое направление в науке, получившее название генной (генетической) инженерии.

Следовательно, генетическая инженерия – это комплекс методов, приемов и технологий, применяемых для проведения манипуляций с генами.

Генная инженерия (ГИ) относится к технологиям высокого уровня, в ней используются новейшие достижения микробиологии, вирусологии, биологии.

Методы генной инженерии (т.е. способы, с помощью которых ученые добиваются поставленных целей):

полиплоидия – количественное увеличение хромосомных наборов;
слияние протопластов – объединение клеток или их частей;
трансгенез – добавление генов от других видов (например, введение в ДНК папайи вируса пятнистости для придания фрукту устойчивости к поражению этим заболеванием);
корректирование генома в зависимости от желаемых характеристик.

Для справки: ДНК хранит наследственную информацию, а РНК – переносит ее. Процессы манипуляции с генами осуществляются вне живого организма, а затем вводятся в него уже измененными.

Узнавайте новое вместе с нами!

Автор статьи: Елена Копейкина

Эта статья относится к рубрикам:

Комментарии и отзывы (2)

Если честно, меня немного пугает генная инженерия, неизвестно куда она может привести. Мне почему-то кажется, что нельзя вмешиваться в то, что создал Бог. Кто знает, может, и не геном человека уже замахнулись.

В середине прошлого века в СССР доказали как дважды два, что генная инженерия сплошной обман народа. Но он продолжается до наших дней. Как можно говорить о чём-то, когда посмотреть ничего нельзя. Это же на молекулярном уровне. Что, прикажете каждому покупателю в магазин с микроскопом ходить. Такой же развод, как и с нано-технологией. Ничего не видно, но деньги дополнительные берут.

CRISPR — система редактирования генома

начала с производства человеческих белков. Генетически спроектированный человеческий инсулин был произведен в 1978 году, а бактерии, производящие инсулин, были коммерциализированы в 1982 году. Генетически модифицированные продукты в питании начали продавать в 1994 году с выпуском помидора Flavr Savr. Flavr Savr был спроектирован так, чтобы иметь более длительный срок хранения, но большинство современных ГМ-культур модифицируются, чтобы повысить устойчивость к насекомым и гербицидам. GloFish, первый ГМО, разработанный как домашнее животное, был продан в США в декабре 2003 года. В 2016 году были проданы лосось, модифицированный гормоном роста. [2]

Содержание

Процесс [ ]

Создание ГМО является многоступенчатым процессом. Генетические инженеры должны сначала выбрать, какой ген они хотят вставить в организм. Это обусловлено тем, что цель для получающегося организма и построена на более ранних исследованиях. Экраны могут быть проведены для определения потенциальных генов и дальнейших тестов, которые затем используются для определения лучших кандидатов. Разработка микрочипов, транскриптомов и секвенирования генома значительно облегчила поиск подходящих генов. [4] Удача также играет свою роль; Гены, готовые к открытию, были обнаружены после того, как ученые заметили, что бактерия процветает в присутствии гербицида. [5]

Изоляция генов и клонирование [ ]

Следующий шаг - изолировать ген-кандидат. Ячейку, содержащую ген, открывают и ДНК очищают. [6] Ген разделяют с помощью рестрикционных ферментов, чтобы разрезать ДНК на фрагменты или полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации сегмента гена. [7] Эти сегменты затем могут быть извлечены с помощью гель-электрофореза. Если выбранный ген или геном донорского организма хорошо изучен, он уже может быть доступен из генетической библиотеки . Если последовательность ДНК известна, но нет доступных копий гена, ее также можно искусственно синтезировать. После выделения ген лигируют в плазмиду, которая затем вводится в бактерию. Плазмиду реплицируют, когда бактерии делятся, обеспечивая неограниченные копии гена. [8]

Прежде чем ген вставляется в организм-мишень, он должен быть объединен с другими генетическими элементами. Они включают промотор и область терминатора, которые инициируют и заканчивают транскрипцию. Добавляется селективный маркерный ген, который в большинстве случаев обеспечивает устойчивость к антибиотикам, поэтому исследователи могут легко определить, какие клетки были успешно преобразованы. Ген также может быть модифицирован на этом этапе для улучшения экспрессии или эффективности. Эти манипуляции осуществляются с использованием методов рекомбинантной ДНК, таких как рестрикционные переваривания, лигирования и молекулярного клонирования. [9]

Вставка в геном хозяина [ ]

Существует ряд методов, позволяющих вставить ген в геном хозяина. Некоторые бактерии могут естественным образом захватывать чужую ДНК . Эта способность может быть индуцирована другими бактериями через стресс (например, тепловой или электрический шок), что увеличивает проницаемость клеточной мембраны ДНК;Поглощенная ДНК может либо интегрироваться с геномом, либо существовать как внехромосомная ДНК . ДНК обычно вводится в клетки животных с использованием микроинъекции, где ее можно вводить через ядерную оболочку клетки непосредственно в ядро или с помощью вирусных векторов. [10]

В растениях ДНК обычно вводят, используя Agrobacterium -mediated recombination, используя последовательность Т-ДНКAgrobacterium s, которая позволяет естественную вставку генетического материала в растительные клетки. Другим методом является биолистика, где частицы золота или вольфрама покрыты ДНК, а затем расстреляны в молодые растительные клетки или эмбрионы растений. Другим способом трансформации клеток растений и животных является электропорация . Это включает в себя подверженность клетки воздействию электрического шока, которая может сделать клеточную мембрану проницаемой для плазмидной ДНК. Из-за повреждения клеток и ДНК эффективность трансформации биолистики и электропорации ниже, чем агробактериальное опосредованное преобразование и микроинъекция. [11]

Поскольку только одна клетка трансформируется генетическим материалом, организм должен быть регенерирован из этой отдельной клетки. Поскольку бактерии состоят из одной клетки и воспроизводят клональную регенерацию, не является необходимым. В растениях это достигается за счет использования тканевой культуры . У животных необходимо убедиться, что вставленная ДНК присутствует в эмбриональных стволовых клетках . Выбираемые маркеры используются для легкой дифференциации преобразованных из нетрансформированных ячеек. Эти маркеры обычно присутствуют в трансгенном организме, хотя был разработан ряд стратегий, которые могут удалить селектируемый маркер из зрелого трансгенного растения. [12]

Дальнейшее тестирование с использованием ПЦР, южной гибридизации и секвенирования ДНК проводится для подтверждения того, что организм содержит новый ген. Эти тесты также могут подтвердить хромосомное расположение и количество копий вставленного гена. Наличие гена не гарантирует, что оно будет выражено на соответствующих уровнях в ткани-мишени, поэтому также используются методы, которые ищут и измеряют генные продукты (РНК и белок). К ним относятся северная гибридизация, количественная ОТ-ПЦР, Вестерн-блоттинг, иммунофлюоресценция, ИФА и фенотипическийанализ. Все потомства первого поколения будут гетерозиготными для вставленного гена и должны быть соединены вместе для получения гомозиготного животного. Для стабильной трансформации ген должен быть передан потомству в менделевской схеме наследования, поэтому также изучаются потомство организма. [13]

Как сообщается в статье Nature Biotechnology РНК-шпилька подавляет нуклеарную активность в тех местах, где нет правильного соотношения. [14]

Практическое применение [ ]

Совершенствование растений и животных [ ]

Ученые из Массачусетского технологического института сделали так, чтобы растения стали светящимися с помощью фермента светлячков, называемого люциферазой. У насекомых она связывана с другим химическим веществом - люциферином, вызывающим реакцию, излучающую свет. Учёные поняли, что эти белки можно встроить и в растения, предположив, что в будущем такие растения смогут освещать целые комнаты, что в свою очередь, по их задумке, может позволить в будущем сэкономить электричество [15]

В конце двадцатого века, в 90-ые годы, учёные смогли изменить геном риса(добавив ген SUB1), сделав его устойчивым к длительному пребыванию в воде. [16]

Площади сельскохозяйственного культивирования ГМО 1997—2009

Green Pigs demonstrate success of UH reproductive science technique

Зелёные светящиеся поросята

В Южном Китае учёные вырастили зелёных светящихся свиней. Смысл эксперимента заключался в доказательстве факта успешного и более быстрого(в 4 раза) переноса способом флуоресцентного протеина из ДНК медузы в организм животного. [17]

Светящийся в темноте ягненок Симен(трава) был подготовлен учеными из Стамбульского университета в сотрудничестве с Гавайским университетом в медицинской школе Mānoa (UHM).

Проект во главе с доктором Сема Бирлером включал инъекцию трех материнских овец

флуоресцентным белком в метод трансгенеза, который был разработан исследователями в Гавайской школе медицины Джона А. Бернса (JABSOM). [18]

Используя активный метод трансгенеза, основанный медицинскими исследователями из Университета Гавайи Маноа, ученые из Турции произвели светящихся зеленых кролики. Это первый раз, когда метод UH использовался для производства кроликов.

Трансгенные кролики родились в Стамбульском университете. При нормальном освещении они выглядят так же, как их пушистые, белые братья-кролики. Но при отсутствии света пара трансгенных кроликов сияет ярким оттенком зеленого.

Светящийся эффект является результатом флуоресцентного белка из ДНК медузы, который был введен в эмбрион материнского кролика в лаборатории.

Цель эксперимента заключалась в том, чтобы показать, что генетические манипуляции с техникой Университета Гавайи эффективно работают у кроликов. Общая цель состоит в том, чтобы ввести полезный ген в самки кроликов, а затем собрать белок, произведенный в молоке, произведенном самками-кроликами. Этот подход может привести к новым и конкурентно эффективным способам производства лекарств, сказал д-р Моисяди.

Успех заключался в сотрудничестве между двумя университетами в Турции и Институтом исследований биогенеза UHM (IBR) в Медицинской школе Джона А. Бернса (JABSOM).

Учёные модифицировали водоросли Acutodesmus dimorphus. Такие водоросли проверили в лабораториях, но в полевых условиях им запрещали в связи "возможности побега таких водорослей". В водорослях были добавлены следующие свойства: повышенное количество жиров и зелёное свечение при ультрафиолете(чтобы в случае побега их можно было обнаружить). И после долгих переговоров учёным разрешили проверить эти водоросли. [20]

Учёные с помощью генной инженерии смогли выяснить как изменить вкус и запах помидоров, выведенных селекционерами для того, чтобы можно было все плоды довезти в таком же виде [21]

GloFish® Fluorescent Fish Video! (Includes our new GloFish Tetras!)

Russet Burbank - это сорт картофеля с темно-коричневой кожей, который является наиболее широко распространенным картофелем в Северной Америке. [23] Имеет белую, сухую и мучнистую мякоть, и хорошо подходит для выпечки, затирания и картофеля фри. [24] Это распространенный и популярный картофель. [25]

Была выведена генетически модифицированная соя благодаря введению ДНК с использованием методов генной инженерии. [26] В 1998 году Monsanto выпустила на рынок США первую генетически модифицированную сою. В 2014 году во всем мире было посажено 90,7 млн. Гектаров ГМ-сои, что составляет 82% от общей площади возделывания сои. [27]

Учёные, которые клонировали овцу Долли, создадут кур, устойчивых к гриппу, с помощью технологии CRISSR. [28]

Генная инженерия и старость [ ]

Внедрение гена теломеразы TERT, [29] нокаут GHRKO, [30] нарушение в генах, кодирующих рецепторы к ИФР-1, [31] сверх экспрессия FGF21, [32] нокаут AC5, [33] удаление RIP3(работает через аутофагию), [34] редактирование гена PCSK9(понижение вероятности сердечно-сосудистых заболеваний), [35] сверхэкспрессия Klotho, [36] нокаут RAGE, сверхэкспрессия BubR1, сверхэкспрессия MTH1 — мутации, позволяющие продлевать жизнь животным до 30%.

В сентябре 2015 года Элизабет Пэрриш, директор фармацевтической компании BioViva, первой в мире решила генно модифицировать, чтобы продлить жизнь. С помощью специального вируса она активировала в организме фермент теломеразу. Он известен тем, что делает клетки человека бессмертными. [37]

Совершенствование человека [ ]

В 2015 году исследователи из Китая впервые отредактировали ДНК эмбриона человека. х. Для редактирования ДНК человеческих эмбрионов ученые из Китая использовали относительно молодой метод CRISPR/Cas9. [38]

Китайский ученый Цзянькуй Хэ генно-модифицировал эмбрионов-близнецов, сделав их устойчивым к ВИЧ благодаря гену CCR5. О своих успехам он решил рассказать в интервью журнала Associated Press. [39] [40]

По состоянию на 21 января 2019 года власти КНР подтвердили существование детей, которые были генно-модифицированы и ещё одну беременность. [41]

Применение генной инженерии в медицине [ ]

Генная терапия — это доставка конструкций на основе нуклеиновых кислот. Обычно применяется для лечения генетических заболеваний.

CRISPR (/ ˈkrɪspər /) (сгруппированные регулярно пересекающиеся короткие палиндромные повторы) представляет собой семейство последовательностей ДНК, обнаруженных в геномах прокариотических организмов, таких как бактерии и археи. Эти последовательности получены из фрагментов ДНК вирусов, которые ранее инфицировали прокариот, и используются для обнаружения и уничтожения ДНК от подобных вирусов во время последующих инфекций. Следовательно, эти последовательности играют ключевую роль в системе противовирусной защиты прокариот. [42]

В начале 2013 года была опубликована статья, в которой говорится о исследовании, доказывающем, что CRISPR можно использовать на человека и мыши. [43]

Учёные проводили эксперимент на генной терапии над человеком, пытаясь излечить болезнь Хантера. Болезнь пошла на спад, но фермент, который должен был увеличиться, так и остался в том же количестве. [44]

Американские учёные вылечили двух самцов саймири посредством вставки искусственных вирусов с геном длинноволнового опсина. Благодаря этому эксперименту учёные узнали, что для трихроматичного зрения не нужно перестраивать нервную систему, можно лишь воспользоваться генной терапией. [45]

Применение в научных исследованиях [ ]

Схема строения зелёного флуоресцентного белка, который светится в голубом свете.

Обзор

Авторы

Редакторы

Полвека назад человек вплотную приблизился к возможности примерить на себя роль творца, творца самого настоящего, способного целенаправленно наделять создаваемые им организмы нужными чертами. Научившись напрямую манипулировать генами, из селекционера он превратился в инженера. Что же подвело его к этой черте и как изменился мир после? Предлагаем заглянуть в историю генной инженерии: вспомнить важнейшие открытия, сформировавшие ее теоретическую основу и методический арсенал, поразмышлять над этическими вопросами и оценить вес генно-инженерных разработок в денежном эквиваленте.

12 биологических методов в картинках

И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!

Генетическая, или генная, инженерия — это не отдельная наука, а огромная и постоянно развивающаяся научно-технологическая платформа, вобравшая в себя самое ценное из генетики, биохимии и химической инженерии, молекулярной и клеточной биологии, микробиологии и вирусологии. Благодаря этой платформе у землян появилась возможность обсуждать такие понятия, как генетически модифицированный организм (ГМО) и генная терапия. Генная инженерия в широком смысле — это третье поколение инструментов для изменения наследственной информации. В отличие от первых двух — селекции, применяемой тысячелетиями, и индуцированного мутагенеза, создавшего с начала 20 века более двух тысяч разновидностей растений [1], — новый инструмент работает прецизионно и быстро. А потому порождает непредставимые ранее научные соблазны и коллективные фобии. Кто-то видит в генной инженерии спасение человечества, кто-то — козни дьявола, но все сходятся в одном: она изменила мир. Инструментарий и технологии генной инженерии мы разберем во второй части статьи, а пока пройдем путем, по которому шли ученые к созданию этой отрасли и ее современным достижениям (рис. 1).

История генной инженерии

Точка невозврата

Рисунок 2. Пол Берг со своей невестой Милли. Кстати, будущий нобелевский лауреат родился в семье, перебравшейся в США из маленькой деревушки под Минском.

Рисунок 3. Герберт Бойер и Стэнли Коэн — создатели первого трансгенного организма и обладатели первого генно-инженерного патента.

Что было до?

Существенно продвинуться в понимании природы наследственности помогли мушки дрозофилы, а затем и бактерии. В 1910-м профессор Колумбийского университета Томас Морган (рис. 4) показал, что гены расположены линейно на хромосомах и образуют группы сцепления. Этим он заслужил Нобелевскую премию [10]. Морган и его сотрудники — Бриджес, Стёртевант и Мёллер — составили первые карты хромосом, экспериментально подтвердили и развили хромосомную теорию наследственности Саттона и Бовери [11].

Рисунок 5. Они показали, что наследственная информация записана в ДНК: Колин Маклауд, Освальд Эвери, Маклин Маккарти.

В 1940-х и начале 1950-х Эдвард Тейтем, Нортон Зиндер, Джошуа и Эстер Ледерберги (рис. 6) описали основные процессы переноса генетического материала между бактериальными клетками с помощью плазмид и фагов (в частности, конъюгацию и трансдукцию). Эти мобильные генетические элементы [12] позже стали неотъемлемыми компонентами арсенала генного инженера.

Рисунок 6. Джошуа и Эстер Ледерберги. Несмотря на сексистскую атмосферу тех лет, Эстер Мириам Ледерберг заслужила искреннее восхищение коллег: в числе ее заслуг — открытие и изучение фага λ, F-плазмиды и трансдукции, введение знакомого теперь каждому микробиологу и многим генным инженерам метода реплик, организация в Стэнфорде специализированного плазмидного центра.

В том же году сотрудник Кембриджа Александер Робертус Тодд, изучавший структуру нуклеотидов, впервые химически синтезировал один из них — аденозинтрифосфат, или АТФ (сахар рибоза + азотистое основание аденин + фосфатные группы).

В 1953 году произошло эпохальное событие — установление молекулярной структуры ДНК. Верную модель обычной, B-формы, ДНК построили сотрудники Кембриджского университета Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик, а базисом для ее создания послужили работы рентгеноструктурщиков из Королевского колледжа Лондона — Мориса Уилкинса и Розалинд Франклин с ее аспирантом, Реймондом Гослингом (рис. 8). Дифракционное изображение кристаллизованной ДНК указывало на ее двуспиральный характер, и Франклин даже удалось рассчитать некоторые параметры этой спирали. Уотсон и Крик, заполучив материалы Франклин и держа в уме пропорции азотистых оснований, вычисленные в 1950-м Эрвином Чаргаффом, предположили, как закодирована и как передается наследственная информация. Полуконсервативный механизм репликации ДНК в знаменитом изотопном эксперименте доказали Метью Мезельсон и Франклин Сталь в 1958 году.

Рисунок 8. Им покорилась двойная спираль. Вверху — Морис Уилкинс и Розалинд Франклин с вошедшим в историю Фото 51 — самой удачной рентгенограммой ДНК. Внизу — Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик со своей моделью ДНК. Им всё-таки удалось опередить другого талантливого ученого — Лайнуса Полинга, известного своей любовью к аскорбинке и расшифровке структуры молекул.

В 1955-м Северо Очоа де Альборнос с аспиранткой, Марианной Грюнберг-Манаго (уроженкой Петрограда и будущим президентом Международного биохимического союза), выделили бактериальную полинуклеотидфосфорилазу и с ее помощью синтезировали в пробирке РНК. Позже оказалось, что синтез для этого фермента скорее хобби, основная же его работа — деградация РНК. В 1956-м Артур Корнберг (рис. 9) со своей женой Сильви выделил один из ферментов синтеза и коррекции ДНК — ДНК-полимеразу I — и получил с его помощью цепочку ДНК [15]. Как и в случае Очоа, фермент Корнберга не был главным строителем полинуклеотидных цепей, однако стал одним из основных инструментов генной инженерии.

Примерно тогда же, наконец, всплыли вопросы регуляции работы генов — те, что чуть раньше научное сообщество не хотело слышать из уст Барбары Макклинток. Жакоб вместе с Жаком Моно описали лактозный оперон и показали, что синтез ферментов контролируется внешними условиями посредством регуляторных белков, которые подавляют или активируют транскрипцию.

Рестриктазы стали жизненно важным инструментом для генной инженерии. Они нашли применение не только в технологии рекомбинантных ДНК, но и в геномной дактилоскопии и техниках секвенирования (прочтения) нуклеотидных последовательностей [16], [19]. Первые рекомбинантные ДНК получили с помощью эндонуклеазы EcoRI, правда, группы Берга и Коэна использовали ее немного по-разному. В считаные годы спрос на эти ферменты так возрос, что академические энтузиасты, выделявшие уже известные и новые рестриктазы, перестали справляться со снабжением всех желающих, и тогда за дело взялись коммерсанты: в 1975-м — New England Biolabs, а позже и другие компании. К октябрю 2017 года было выделено уже 4 155 эндонуклеаз II типа. Найти всю информацию о них и системах рестрикции-модификации в целом можно в базе данных REBASE.

Как резать и сшивать ДНК, стало более или менее ясно, но оставалась проблема универсального (не узкоспециализированного типа конъюгации или трансдукции) внесения нуклеиновых кислот в клетки. У кишечной палочки давно было замечено нежелание поглощать ДНК из среды, но в 1970-м эту проблему разрешили Мортон Мандель и Акико Хига. Обработка клеток E. coli хлоридом кальция сделала их компетентными, то есть способными принимать генетический материал извне. Немного усовершенствованный, этот метод и сейчас широко используют для трансформации бактерий. В те же 70-е изучили трансформирующие свойства Ti-плазмид в отношении растительных клеток и применили микроинъекции, а в 80-е сконструировали электропоратор и генную пушку [20]. С появлением последней стало возможным интегрировать чужеродные гены в хлоропласты.

В 1972 году сотрудники Амстердамского университета Кес Ай и Пит Борст опробовали визуализацию ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле с буфером, содержащим бромистый этидий. Это позволило видеть не меченные изотопами молекулы ДНК, просто положив гель на УФ-трансиллюминатор.

Что было после?

На исходе 70-х разработали неизотопные методы мечения нуклеиновых кислот.

1982 год запомнился открытием рибозимов: Томас Чех и Сидни Альтман показали, что молекулы РНК могут обладать каталитической активностью. Помимо существенной поддержки гипотезы мира РНК, это открытие в 2000-х вылилось в создание инженерных рибозимов для генетической терапии, способных разрезать нужные РНК. Самым логичным выглядело их использование для блокирования ВИЧ и иных РНК-содержащих вирусов [23].

В том же году появилось первое трансгенное растение: Майкл Беван, Ричард Флавелл и Мэри-Дэлл Чилтон модифицировали клетки табака с помощью Ti-плазмиды, несущей химерный ген антибиотикорезистентности.

В 1989-м удалось получить первую мышь с нокаутированными генами, крыс осилили гораздо позже — в 2003-м [25].

В 1990 году калифорнийские биологи пытались сделать цветки трансгенной петунии более яркими, а получили еще более бледные. Так неожиданно себя проявила РНК-интерференция, которую позже, в 1998 году, подробно описали у червя Caenorhabditis elegans Крейг Мелло и Эндрю Файер (рис. 13). Введением небольшой двухцепочечной РНК они вызвали сайленсинг (подавление экспрессии) генов, содержащих комплементарные этой РНК участки. Благодаря малым РНК, регулирующим экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, удались на славу гипоаллергенные томаты, табак без никотина, кофе без кофеина и многое другое. Двухцепочечные молекулы оказались более эффективными, чем одноцепочечные (простые антисмысловые РНК), механизм действия которых не относят к интерференции.

В апреле 2003 года завершились основные работы по секвенированию генома человека, которые стоили правительствам США и еще нескольких стран $3 млрд [26]. Прочтение геномов нескольких анонимных доноров вскрыло много интересных деталей. Оказалось, что обычных — кодирующих белок — генов у нас гораздо меньше, чем полагали ранее, — чуть более 20 тыс. [27]. Они составляют всего 1,5% совокупной человеческой ДНК, а остальное относят к ДНК некодирующей (хотя некоторые ее области кодируют малые регуляторные молекулы и мобильные генетические элементы) [28]. Некодирующая ДНК участвует в поддержании структуры хромосом, клеточном делении и регуляции экспрессии генов. Но самое интересное, что до 90% однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), ассоциированных с разными заболеваниями, сосредоточены в некодирующих, преимущественно регуляторных, участках ДНК. Поэтому логическим продолжением прочтения генома человека стали проекты, посвященные его вариабельности: Human Genome Diversity, HapMap, 1000 Genomes, ENCODE.

В 2007-м фармгигант Merck успешно завершил клинические исследования рекомбинантной вакцины Gardasil, защищающей от человеческих папилломавирусов высокого онкогенного риска, способных инактивировать гены опухолевых супрессоров и провоцировать развитие карцином шейки матки и некоторых других частей тела. Антигены вирусоподобных частиц, составляющих вакцину, производятся трансгенными дрожжами. Вскоре GlaxoSmithKline выпустила аналогичную, но более эффективную вакцину Cervarix.

В 2014 году с помощью ZFN модифицировали Т-лимфоциты инфицированных ВИЧ, чем снизили вирусную нагрузку. В 2015 безнадежной пациентке с лейкемией ввели донорские Т-лимфоциты, модифицированные с помощью TALEN, чем выиграли время для трансплантации костного мозга [37]. Тогда же в Китае покусились на редактирование генома нежизнеспособных эмбрионов CRISPR-системой [38]. В 2016 опухолевые клетки пациента с агрессивной карциномой легкого атаковали его собственными Т-лимфоцитами, подправленными CRISPR-Cas9 [39], [40]. Сейчас компания Sangamo Therapeutics (США) проводит набор участников I фазы клинических исследований ZNF-терапии in vivo: речь идет об исправлении дефектных генов, вызывающих мукополисахаридозы I/II и гемофилии А/В. Другой пионер отрасли, Editas Medicine, планирует начать клинические исследования CRISPR-терапии ex vivo и in vivo [39].

В том же 2014-м Денис Малышев с коллегами из Исследовательского института Скриппс и New England Biolabs сконструировал кишечную палочку с расширенным генетическим алфавитом, которая стабильно поддерживает плазмиду с неприродной парой нуклеотидов [43]. В 2017 году эту полусинтетическую бактерию тюнинговали [44].

Ну а мы в следующей части статьи попробуем разобраться, как создают молекулярные химеры и как используют нуклеиновые кислоты для решения исследовательских и медицинских задач.

Рекомбинантные ДНК и биоэтика: наступить на горло собственной песне

Генная инженерия и рынок: найти ключ к монетизации научных достижений

Любимые многими нашими не-учеными мечты о всегда голодных молодых ученых вряд ли нашли бы понимание у пионеров генной инженерии. Они были заняты не поиском пропитания, а интересной работой — в нормальных условиях и под руководством талантливых ученых. В итоге многие получили Нобелевские премии и миллионные состояния. А благодаря патентно-лицензионной системе миллионы они принесли и своим институтам, чтобы те лучше финансировали новые исследования.

В 1976 году Герберт Бойер и венчурный капиталист Роберт Свонсон, скинувшись по $500, основали биотехнологическую компанию Genentech. Их генно-инженерный инструментарий и сотрудничество с институтскими коллективами позволили экспрессировать в бактериях разные человеческие гены и получить таким образом терапевтически ценные белки: соматостатин, соматотропин, инсулин, ДНКазу I, интерферон-γ, моноклональные антитела. Компания оказалась на редкость доходной, и Калифорнийский и Стэнфордский университеты вели с ней нудные патентные споры, требуя миллионных компенсаций. В 2009 году фармгигант Hoffmann-La Roche приобрел Genentech за $46,8 млрд, и сейчас в компании работает почти 15 000 человек. Но самое важное для становления биотехнологической промышленности произошло в далеком 1980-м: 15 октября стоимость акции Genentech на Нью-Йоркской фондовой бирже взлетела в два раза — и за день несколькими миллионерами стало больше [51]. Более 7 млн акций подняли стоимость компании до $500 млн, а лицо Бойера украсило обложку журнала Time. И понеслось.

Американская академическая наука вступила в фазу коммерциализации. Сотрудники институтов активно налаживали связи с мировым капиталом, в том числе и организуя собственные биотехнологические компании. С 1980 по 1985 в США появилось более 400 подобных фирм. Этому благоприятствовали налоговые льготы и крупные навары с биржевых операций. На запах денег слетелись и представители Большой фармы. В Европе инвестиционный климат был похуже, но и там процесс быстро набрал обороты. Япония объявила биотехнологию национальным приоритетом, и, подучившись у американских биотехнологов, пополнила ряды лидеров индустрии. Другие страны тоже осознали стратегическую важность отрасли и по мере возможности старались уделять ей внимание [51]. Мы не будем пытаться объять необъятное, разбирая все генетические коммерческие проекты, а устроим маленькую историческую экскурсию по избранным, крупным перекресткам академической науки и генно-инженерной индустрии.

Одним из основателей Myriad Genetics был пионер секвенирования Уолтер Гилберт. Он же известен как соучредитель биотехнологического гиганта Biogen и компании Paratek Pharmaceuticals, а еще как один из первых апологетов секвенирования человеческого генома. Еще до старта известного международного проекта он анонсировал открытие Genome Corporation, в составе которой планировал первым прочитать геном человека и затем продавать расшифрованную информацию.

Удачный пример синтеза академической науки и фарминдустрии показали Артур Корнберг [15], Пол Берг и Чарльз Янофски, в 1980-м основав DNAX — институт молекулярной и клеточной биологии, который почти сразу приобрела компания Schering-Plough Pharmaceuticals (сейчас — часть Merck & Co.). DNAX предоставлял отличные кадры для разработки препаратов, и эти кадры не были ограничены в правах публикации своих результатов [53].

Крейг Мелло, одним из первых описавший РНК-войны [54], помимо основания успешной биофармацевтической компании RXi Pharmaceuticals занялся укреплением здоровья пчел с помощью РНК-интерференции. Специально созданная для этого израильско-американская фирма Beeologics в 2011 году была поглощена Monsanto.

Читайте также: