Биологический метод диагностики сообщение
Обновлено: 05.07.2024
Инфекции вызывают, в основном, следующие виды микроорганизмов: бактерии, вирусы, грибы, простейшие. Их обнаружение — достоверный признак инфекционного процесса.
Лаборатория располагает арсеналом методов, однако только 5 из них наиболее широко распространены:
Культуральный метод (метод посева)
Выявляет чистую культуру возбудителя. Метод сводится к тому, что полученный материал (мазок со слизистой оболочки, кровь, гной, кал и т.д) высевается на питательные среды. Среды могут содержать различные компоненты. Но суть сводится к следующему: микроорганизмы должны дать рост и колонии. Если есть рост патогенных микроорганизмов, то определяется их чувствительность к лекарствам: антибиотикам и бактериофагам.
Серологический метод (метод антител к возбудителю)
Тоже позволяет поставить диагноз. Метод основан на обнаружении в крови антигенов возбудителя или антител — специальных белков, которые образуются в организме в ответ на присутствие и размножение болезнетворных микроорганизмов. Антитела образуются постепенно, поэтому в крови их можно обнаружить только к концу первой недели инфицирования. Это главный недостаток метода.
Молекулярно-биологический метод (метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), метод амплификации РНК (NASBA))
Определяет генетический материал возбудителя — ДНК или РНК в образцах (соскоб со слизистой, кровь, моча, кал и т.д). Чтобы уловить малые концентрации ДНК или РНК, необходимо увеличить количество копий. Для этого исследуемый образец помещают в прибор — амплификатор, который позволяет увеличить число копий ДНК в геометрической прогрессии. Для этого метода диагностики крайне важен правильный забор биоматериала.
Микроскопический метод (исследование под микроскопом)
Подразумевает приготовление препаратов на стекле. Материал: кровь, отделяемое слизистых оболочек и т.д. Стекла могут быть окрашенными или неокрашенными, в зависимости от типа инфекции. Врач исследует препарат под микроскопом и выдает результат на основании визуальной оценки: размер, форма, отношение к красителям и т.д.
Метод газовой хроматографии (ГХ-МС)
Выявляет возбудителей по продуктам их жизнедеятельности. Материал: кровь, моча, кал, отделяемое ран, слизистых оболочек.
Биологический метод — заражение различным материалом (клиническим, лабораторным) лабораторных животных для индикации возбудителя, а также для определения некоторых свойств микроорганизмов, характеризующих их патоген-ность (токсигенность, токсичность, вирулентность).
В качестве лабораторных животных используют белых мышей и крыс, морских свинок, кроликов и др.
Воспроизведение заболевания у животного — абсолютное доказательство патогенное микроорганизма (в случае бешенства, столбняка и др.). Именно поэтому биологическая проба на животных — ценный и достоверный диагностический метод, особенно при тех инфекциях, возбудители которых в исследуемых биологических средах организма человека содержатся в малых концентрациях и плохо или медленно растут на искусственных средах.
Биологический метод применяют в целях накопления возбудителя в организме чувствительного животного и получения чистой культуры на искусственных средах, используя в качестве материала для посева кровь и внутренние органы животных.
Дополнительно:
Молекулярно-биологические методы, используемые в диагностике инфекционных болезней (ПЦР, рестрикционный анализ и др.).
Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в ис¬следуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру.
Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного микроба гена. Обнаружение гена осуществляют его накоплением. Для этого необходимо иметь праймеры комплементарного З'-концам ДНК. исходного гена. Накопление (амплификация) гена выполняется следующим образом. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на 2 нити. Добавляют праймеры. Смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры, при наличии в смеси ДНК искомого гена, связываются с его комплементарными участками. Затем к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования ДНК-полимеразы. В этих условиях, в случае комплементарное™ ДНК гена и праймера, происходит присоединение нуклеотидов к З'-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз вдвое. Проводят реакцию в специальных приборах — амплификаторах. ПЦР применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.
Рестрикционный анализ. Данный метод основан на применении ферментов, носящих название рестриктаз. Рестриктазы представляют собой эндонуклеазы, которые расщепляют молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Особое значение для методов молекулярной генетики имеют рестриктазы, которые узнают последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии. Точка разрыва ДНК может или совпадать с осью симметрии, или быть сдвинута относительно нее.
В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может происходить разрыв двойной спирали ДНК.
В геноме конкретной таксономической единицы находится строго определенное (генетически задетерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы.
Если выделенную из конкретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго определенного количества фрагментов ДНК фиксированного размера.
Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в агарозном геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем более крупные фрагменты, и длина их пробега больше. Гель окрашивают бромистым этидием и фотографируют в УФ-излучении. Таким образом можно получить рестрикционную карту определенного вида микробов.
Сопоставляя карты рестрикции ДНК, выделенных из различных штаммов, можно оп¬ределить их генетическое родство, выявить принадлежность к определенному виду или роду, а также обнаружить участки, подвергнутые мутациям.
Этот метод используется также как начальный этап метода определения последовательности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гибридизации.
Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения.
Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатурировать, т. е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда.
Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченная ра¬диоактивными нуклидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК.
Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют на специальном фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий радиоактивный зонд. Создаются условия, благоприятные для образования двойных спиралей. В случае наличия комплементарности между зондом и исследуемой ДНК, они образу¬ют между собой двойную спираль.
Риботипирование и опосредованная транскрипцией амплификация рибосомальной РНК. Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах, кодирующих рРНК, отличается консервативностью, присущей каждомувиду бактерий. Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких копиях. Фрагменты ДНК, полученные после об¬работки ее рестриктазами, содержат последовательности генов рРНК, которые могут быть обнаружены методом молекулярной гибридизации с меченой рРНК соответствующего виды бактерий. Количество и локализация копий оперонов рРНК и рестрикционный состав сайтов как внутри рРНК-оперона, так и по его флангам варьируют у различных вида бактерий. На основе этого свойства построен метод риботипирования, который позволяет производить мониторинг выделенных штам¬мов и определение их вида. В настоящее время риботипирование проводится в автомати¬ческом режиме в специальных приборах.
Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК используется для диагностики сме¬шанных инфекций. Этот метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гиб¬ридизации амплифицированных рРНК, спе¬цифичных для определенного вида бактерий. Исследование проводится в три этапа:
1. Амплификация пула рРНК на матрице выделенной из исследуемого материала ДНК при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы.
2. Гибридизация накопленного пула рРНК с комплементарными видоспецифическим рРНК олигонуклеотидами, меченными флюорохромом или ферментами.
3. Определение продуктов гибридизации методами денситометрии, иммуноферментного анализа (ИФА).
Реакция проводится в автоматическом режиме в установках, в которых одномоментное определение рРНК, принадлежащих различным видам бактерий, достигается разделением амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносятся комплементарные видоспецифическим рРНК меченые олигонуклеотиды для гибридизации.
Расшифруйте результаты
Реакция Райта (реакция развёрнутой агглютинации) + - сомнительная агглютинация (титр 1:50). При таких результатах рекомендуется повторная постановка р-ции Райта через некоторое время (7-10 дней)
Пробы Бюрне (кожно-аллергическая проба) ++++ - резко положительная. Она определяет способность организма специфически отвечать местной реакцией кожи на внутрикожное введение бруцеллина – фильтрата бульонной культуры бруцелл. Она становится резко положительной на 3-4 день от начала болезни, в дальнейшем сохраняется с большим постоянством на протяжении очень длительного времени, даже после клинического выздоровления.
ОФП (опсонофагоцитарная проба) 6 –слабоположительная. Её проводят с 15-20 дня заболевания. Она основана на способности сегментоядерных нейтрофилов фагоцитировать бруцеллы благодаря наличию в крови человека специфических опсонинов, нарастающих в процессе бруцеллезной болезни (можно определить по формуле: Фагоцитарное Число Больного разделить на Фагоцитарное Число Здорового (Фагоцитарное Число – это среднее число поглощенных микробных клеток в одном фагоците)).
Реакция Райта и проба Бюрне взаимно дополняют друг друга. Максимальный диагностический эффект достигается при комплексном их применение, что является надежным способом диагностики бруцеллеза. Вследствие сомнительной реакции Райта можно предположить: латентный период либо недавно перенесенное заболевание – бруцеллез. А положительная пробы Бюрне сохраняется в течение длительного времени, даже после полного клинического выздоровления.
Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроскопические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы.
Микроскопический метод исследования
Микроскопические методы исследований включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.
Микробиологический метод исследования
Биологический метод исследования
Биологические методы исследований направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели — кровь, кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
В настоящее время проведение микробиологических исследований является важной и актуальной деятельностью в биологии и медицине, так как они позволяют с высокой степенью точности и достоверности подтвердить или опровергнуть факт присутствия в организме (или другом исследуемом объекте) возбудителей инфекционных заболеваний. Классические микробиологические методы исследования решают задачи выделения чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией по биохимическим, антигенным и другим признакам [1]. Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроскопические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы [3]. Благодаря микробиологическим методам исследования можно установить возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний и подобрать правильный метод лечения этого заболевания.
Цель: Описать основные микробиологические методы исследований, применяемых в биологии и медицине.
Задачи:
- охарактеризовать основные методы исследований в микробиологии по литературным источникам;
- ознакомить учащихся с основными микробиологическими методами исследований в кратком изложении.
Микроскопический метод
Микроскопические методы исследования – это способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Широко применяются в бактериологических, гистологических, цитологических и других исследованиях.
Микроскопические методы исследований включают в себя приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы лишены явных морфологических (т.е. структурных) внешних и внутренних особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (например, наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить сам факт наличия или отсутствия микроорганизмов в исследуемых образцах.
Существуют световая, фазово-контрастная, темнопольная (ультрамикроскопия), люминесцентная, поляризационная, ультрафиолетовая и электронная микроскопия [2].
Микробиологический метод
Биологический метод
Биологические методы исследований направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение самого возбудителя (особенно при его незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают в себя заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы.
Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённой массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутривенно, внутримышечно, подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат (скопившуюся жидкость) из брюшной полости, после гибели — кровь, кусочки различных органов, экссудаты из различных полостей [3].
Серологический метод
Серологические методы исследований для выявления специфических антител и антигенов возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудителя не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров антител (т.е. их концентрации), в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 суток (иногда этот интервал может быть более длительным). Aнтитела обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для эпидемиологических исследований.
Особое значение имеют методы выявления микробных антигенов, порождающих антитела. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.
Аллергологический метод
Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, т.е. способны вызывать аллергические реакции. Это используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутрикожное введение Аг (аллергена). Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю [4].
Заключение
В данной работе были кратко описаны основные методы исследований в микробиологии (микробиологические методы исследований):
1. Микроскопический метод.
2. Микробиологический метод.
3. Биологический метод.
4. Серологический метод.
5. Аллергологический метод.
С помощью методов, применяемых в микробиологии, люди научились выявлять и определять различного рода возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний. Правильно выбранный метод способствует в дальнейшем правильному лечению заболеваний.
В настоящее время наиболее широко используются микроскопический, микробиологический и биологический методы исследования, потому что именно благодаря этим методам можно выявить причину возникновения и проявления инфекционных болезней у живых организмов и дать верную характеристику возбудителям этих болезней.
Читайте также: