Суспензионные культуры животных клеток реферат

Обновлено: 02.07.2024

Животные клетки гораздо сложнее
культивировать in vitro по сравнению с
растительными клетками по следующим
причинам:
1. Требуются более сложные по составу питательные
среды.
2. Клетки очень чувствительны к механическим
воздействиям.
3. Рост клеток происходит
преимущественно после
прикрепления к поверхности.

Культуры клеток животных классифицируют
по следующим признакам:
•способу культивирования;
•происхождению;
•продолжительности культивирования

Способы культивирования
животных клеток
Культивирование в
прикрепленном
состоянии на внутренней
поверхности
культурального сосуда
Монослойные
культуры
Глубинное
культивирование
Суспензионные
культуры

Монослойные (опорно-зависимые) культуры – культуры,
клетки которых размножаются в форме монослоя,
прикрепившись к субстрату

В качестве субстрата для опорно-зависимых
клеток используют:
1. Пластик
(полистирол, поликарбонат,
поливинилхлорид, тефлон и др.)
2. Стекло
(пирекс (алюмоборосиликатное стекло))
3. Металлы
(нержавеющая сталь, титан)

Клетки связываются с субстратом не
непосредственно, а с участием факторов адгезии
К факторам адгезии относятся белки:
• фибронектин;
• коллаген;
• поли-L-лизин;
• хондронектин (адгезия хондроцитов);
• ламинин (адгезия эпителиальных, нервных клеток)

Монослойные
культуры
Стационарные
культуры, растущие в
неподвижных
культуральных сосудах
Роллерные
культуры, растущие в
сосудах, вращаемых вдоль
своей продольной оси
Площадь,
занимаемая
клетками,
увеличивается
на порядок по
сравнению со
стационарными
культурами

Роллерные культуры (до 700 бутылок в каждой
установке, сотни литров) используют для получения
противовирусных вакцин и интерферона

Суспензионные культуры – культуры, клетки которых
способны расти во взвешенном (суспендированном)
состоянии в жидкой питательной среде

Преимущества суспензионных
культур:
•простота субкультивирования;
•экономия площадей;
•простота сбора клеток
!Не все типы животных клеток могут расти
в суспендированном состоянии

А) в зависимости от типа исходной ткани:
- элементы соединительной ткани
(фибробласты, лимфоциты,
клетки хряща и др.);
- мышечные ткани (скелетные,
сердечные и гладкие мышцы);
- эпителиальные ткани
(печень, легкие, почки и др.);
- клетки нервной системы;
- эндокринные клетки
(надпочечники, гипофиз и др.);
- опухолевые клетки

Широко используемые культуры клеток животных:
а – фибробласты; , б – эпителиальные клетки;
с – мышечные клетки; d – лимфоциты; e - нейроны

Фибробласты
Отличаются легкостью
культивирования.
Используются для изучения
клеточных,
биохимических, молекулярных
аспектов патогенеза ряда
болезней.
Данные, полученные на
культивируемых фибробластах,
могут быть перенесены
(экстраполированы)
на условия in vivo.

Эпителиальные
клетки
Клетки почек мыши (первичная культура)
Клетки почек хомяка
(после нескольких субкультивирований)

Б) в зависимости от степени специализации
ткани (эмбриональная либо взрослая ткань)
Эмбриональные ткани
активный рост, лучшая
выживаемость in vitro
Взрослые ткани
низкая пролиферативная
способность
В) в зависимости от физиологического
состояния (нормальная либо опухолевая ткани)
Нормальные ткани
дают начало культурам с
ограниченным временем
жизни
Опухолевые ткани
способны
пролиферировать
неограниченно долгое
время

HeLa
Одна из первых и наиболее широко используемых
культур опухолевых клеток человека
• 8 января 1951 г.: выделена из раковой опухоли
шейки матки (Henrietta Lacks (1920-1951))
Henrietta Lacks (circa 1945)

Типы культур животных клеток
в зависимости от продолжительности культивирования
Первичные культуры
Клеточные линии
Свежевыделенные
культуры.
Существуют лишь до
первого пересева даже
при систематической
смене питательной среды
Культуры, подвергаемые
пассированию в течение
ограниченного времени
(до 50 пассажей) либо
способные к неограниченному росту

Получение первичной культуры
Этап 2. Механическая и ферментативная
дезагрегация экспланта
2.1. Ткань измельчается до кусочков объемом до
1-3 мм, экспланты отмываются от эритроцитов
раствором Хенкса с антибиотиками пока жидкость
не станет почти прозрачной

2.2. Для разрушения межклеточного вещества
используют ферменты:
трипсин или коллагеназу
Обработку раствором трипсина можно проводить
при комнатной (холодная трипсинизация) либо
повышенной температуре (+37ºС).
Кусочки ткани заливают
раствором трипсина и в
смесителе на магнитной
мешалке перемешивают взвесь
в течение 10-30 мин

Получение первичной культуры
Этап 3. Центрифугирование полученной
суспензии клеток
Для отделения крупных комочков ткани и
соединительнотканных волокон содержащую клетки
жидкость фильтруют через марлю, затем
центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 5 мин.

Получение первичной культуры
Этап 4. Ресуспендирование клеток в
питательной среде, перенос в культуральные
сосуды
Надосадочную жидкость сливают, осадок отмывают
и разводят питательной средой, чтобы получить в 1
мл 100 000-400 000 клеток.
Взвесь клеток разливают
в матрацы, плотно
закрывают пробками и
помещают в термостат
при температуре 37 °С.

Получение первичной культуры
Этап 5. Формирование монослойной
культуры
Прикрепляясь к субстрату, клетки в течение
нескольких суток (как правило, 5-7) образуют
монослой в виде пласта, сцепленного со стенками
матрацев

Схема получения первичной
культуры
Измельченная
ткань
Засев в
культуральные сосуды
Эксплант
Орган
Энзиматическая
дезагрегация
Формирование
монослоя

Как определить, что клеточную культуру
пора рассевать?
•клетки образуют плотный монослой;
•индикатор-краситель меняет цвет
(например, индикаторный краситель Phenol Red (феноловый
красный) меняет цвет с ярко-красного в свежей среде до
желто-оранжевого в среде с культивируемыми в течение
некоторого времени клетками)

Первичная культура
Субкультивирование
Клеточная линия
Ограниченная
Постоянная
Трансформация
Деградация

КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
1. Клеточные линии с ограниченным ростом –
культуры клеток, которые сохраняют
способность к делению в течение
определенного времени
К ним относятся диплоидные культуры
(диплоидные штаммы).

В зависимости от вида животного продолжительность
жизни диплоидных штаммов различна:
для свиней – 25-40 пассажей,
овец – 30-35 пассажей,
крупного рогатого скота – 30-45 пассажей,
лошадей – 50-60 пассажей.
Человек 50±10 пассажей
Наиболее активное размножение клеток диплоидных
штаммов наблюдают в период от 5 до 20 пассажей,
затем активность клеточного метаболизма
снижается.

Предел или лимит Хейфлика — число делений
соматических клеток
Максимальное число делений различно в зависимости от типа клеток и
ещё сильнее различается в зависимости от организма.
Для большинства человеческих клеток предел Хейфлика составляет 52
деления.
Граница Хейфлика связана
с сокращением размера
теломер - участков ДНК на
концах хромосом
Раковые клетки производят
фермент теломеразу,
которая наращивает
теломеры на концах ДНК
хромосом
2009 г. - присуждение Нобелевской премии за исследования в
области применения теломеразы.

После определенного количества пассажей ограниченная клеточная линия
либо стареет и дегенерирует, либо трансформируется и превращается в
постоянную клеточную линию

КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
2. Постоянная клеточная линия – линия клеток,
которая поддерживается в результате
последовательных субкультивирований
неограниченно долгое время.
Полностью адаптированы к
существованию вне организма.
Автономно размножаются подобно бактериям.
Получают из раковых и реже нормальных
тканей.

Преимущества постоянной клеточной
линии:
•более высокая скорость роста;
•высокая плотность, а следовательно, и больший
выход биомассы;
•возможность поддержания в более простых средах;
•способность к росту в суспензии

Культивирование клеток– это метод сохранения и выращивания клеток вне организма в искусственно созданных условиях. используется два направления в культивировании животных клеток:

1) культура клеток

2) культура органов и тканей.

Для ведения культуры клеток используются различные источники. Таковыми могут являться взрослые или эмбриональные ткани, а также нормальные и опухолевые.

Каждая такая культура клеток будет характеризоваться рядом морфологических, биохимических и физиологических особенностей.

Наиболее часто культивируются следующие элементы:

1) соединительной ткани – фибробласты;

2) скелетной – кость и хрящи;

3) мышечной – скелетные, сердечные и гладкие мышцы;

4) эпителиальной – печень, легкие, кожа, мочевой пузырь, почки, молочная железа;

5) нервной – глиальные клетки и нейроны (хотя они лишены способности к пролиферации);

6) эндокринной системы – гипофиз, надпочечники, клетки островков Лангерганса;

7) различные типы опухолевых клеток.

различают 3 основных типа культур животных клеток:

1)первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева;

2)диплоидные культуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие до 50 пересевов диплоидный набор хромосом;

3) трансформированные постоянные гетероплоидные культуры, способные к существованию вне организма неограниченно долгое время.

Культуры тканей могут подразделяться

1) по виду животного, от которого они происходят;

2) по типу ткани-источника;

3) по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные, опухолевые),

4) по способу выращивания (монослойные, суспензионные, на микроносителях и т. п.).

Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной дезагрегации

Образованиепостоянной клеточной культурыотражается на комплексе морфофизиологических особенностях клеток: уменьшение размеров клеток, падение адгезивности клеток, округление клеток, увеличение ядерно/цитоплазматического отношения, увеличение времени удвоения клеток с 3 часов до 12 часов

Суспензионное культивирование

Первые суспензионные культуры клеток животных, как правило, основывались на клетках злокачественных тканей. Это — клетки HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют.

Но если некоторые клетки культивировать во вращающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу (0,1-0,2%), предотвращающую агрегацию клеток, можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы.

для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния с последующим длительным периодом адаптации, сопровождающимся различными манипуляциями, предотвращающими возврат к монослою.

Перемешивание осуществляют лопастными магнитными мешалками (100-200 об/мин) и круговыми качалками (15-40 об/мин).

Для предотвращения оседания клеток на стенки сосудов производят их силиконирование, поскольку силиконовое покрытие в силу своей гидрофобности препятствует прикреплению клеток.

такие манипуляции при введении клеток в суспезию необходимы не во всех случаях. Некоторые клетки (трансформированные клетки, кроветворные клетки и асцитные опухоли) способны расти как на субстрате, так и в суспензии в зависимости от солевого состава среды культивирования.

А культуры лимфоцитов вообще не обнаруживают тенденции к адгезии к поверхности субстрата и выживают на дне культивационного сосуда под тонким слоем среды.

Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток

Максимальный рост клеток в суспензии наблюдают при рН 7,0-7,2.

Суспензионные культуры широко используется в вирусологических исследованиях и для накопления больших количеств вируссодержащего материала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов.

58. Получение трансгенных организмов.

59. Производство белка одноклеточных организмов.Биотехнология производства одноклеточного белка.

БОО - это высококачественный продукт, т.к. содержание белка может достигать 60% от сухой массы. При этом такой продукт содержит определенное количество углеводов, витаминов, микро- и макроэлементов. Отсутствие посевных площадей. Процесс не зависит от погоды, климата, поддается точному планированию и автоматизации. Получаемые продукты стандартны, возможна утилизация промышленных отходов. Для микробного белка придумано специальное название — белок одноклеточных организмов (БОО). Производство его связано с крупномасштабным выращиванием определенных микроорганизмов, которые собирают и перерабатывают в пищевые продукты. В основе лежит технология ферментации — ветвь бродильной промышленности и производства антибиотиков. Чтобы осуществить возможно более полное превращение субстрата в биомассу микробов, требуется многосторонний подход. Выращивание микробов в пищевых целях представляет интерес по двум причинам. Во-первых, они растут гораздо быстрее, чем растения или животные: время удвоения их численности измеряется часами. Это сокращает сроки, нужные для производства определенного количества пищи. Во-вторых, в зависимости от выращиваемых микроорганизмов в качестве субстратов могут использоваться разнообразные виды сырья. Что касается субстратов, то здесь можно идти по двум главным направлениям: перерабатывать низкокачественные бросовые продукты или ориентироваться на легкодоступные углеводы и получать за их счет микробную биомассу, содержащую высококачественный белок. И в том и в другом случае технология ферментации играет ключевую роль. Здесь важно подобрать оптимальный состав среды, создать определенные условия для роста, разработать конструкции ферментеров, правила их эксплуатации и системы контроля, выработать методы отделения биомассы от культуральной среды. Промышленное производство белка одноклеточных организмов всегда осуществляется методом глубинного культивирования в жидких средах; применяются как одноэтапное, так и непрерывное культивирование. Непрерывное культивирование сложнее, чем одноэтапное, но более экономично: производительность ферментеров выше. Именно этот метод был избран для промышленного производства БОО.

60. Биотехнология и медицина..

Биотехнология и медицина.

Молекулярная медицина

Область науки, которая занимается диагностикой, лечением и профилактикой наследственных болезней на генном уровне. Использует различные фармацевтические технологии и методы генной терапии, направленные на устранение определенных поражений организмов на молекулярном уровне, а также устранение молекулярных дефектов в биологических системах. Проводит исследование новых молекул, с позиций их эффективности при лечении различных заболеваний и безопасности для организма.

Геном человека имеет огромное значение в области биомедицинских исследований и клинической медицины.

Каждое заболевание имеет генетический компонент.

Изучение генома человека имеет огромное значение в области биомедицинских исследований и клинической медицины. Каждое заболевание имеет генетический компонент.

Оно может быть наследственным (имеется около 3000-4000 наследственных заболеваний) или результатом воздействия

окружающей среды на организм человека, приводящим к

изменениям в геноме (рак, сердечно-сосудистые заболевания,

Определение генома человека означает, что теперь мы можем искать гены, которые непосредственно связаны с различными болезнями и яснее понимать их основу. Знание молекулярного механизма болезни позволит лучше и эффективнее лечить и даже предупреждать возникновение болезни.

Для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры. Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют. Но если некоторые клетки культивировать во вра-щающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу, предотвращающую агрегацию клеток, можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы. Иногда этого бывает достаточно для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния. Суспензионные культуры также можно получать путем обработки отобранной для пересева монослойной клеточной культуры 0,02 % раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА с последующим длительным периодом адаптации, сопро-вождающимся различными манипуляциями, предотвращающими возврат к монослою.

Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд наполнен средой наполовину. Для обеспечения этих условий необходимо каждый день или (в случае медленно растущих культур) через день, удалять половину суспензии через боковое горлышко и добавлять равный объем свежей среды. Некоторые клетки (трансформированные и кроветворные клетки, асцитные опухоли) способны расти как на субстрате, так и в суспензии в зависимости от солевого состава среды культивирования.

Культуры лимфоцитов не обнаруживают тенденции к адгезии к поверхности стекла или пластика и выживают на дне культивационного сосуда под тонким слоем среды. Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых клеточных линий проводят в роллерных установках, где создаются благоприятные для клеток условия постоянного перемешивания жидкой и газовой

фаз, общий объем среды при этом снижается вдвое по сравнению со стационарными условиями.

Суспензионное культивирование клеток также можно проводить в ферментерах, предназначенных для суспензионного культивирования микроорганизмов, в которых постоянное перемешивание клеток в среде осуществляется магнитными или механическими мешалками в колбах с высокой скоростью вращения, препятствующей прикреплению клеток к стенкам сосудов.

Суспензионное культивирование дает, по меньшей мере, 2−3-кратную экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорогостоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы.

Для учеников 1-11 классов и дошкольников
Бесплатные сертификаты учителям и участникам

Описание презентации по отдельным слайдам:

высокая чувствительность крупных, вакуолизированных растительных клеток к физико-механическим воздействиям;
высокие требования к обеспечению асептических условий вследствие большой продолжительности ростового цикла и относительно низкой скорости роста (в сравнении с микробными и животными клетками);
необходимость обеспечения равномерного перемешивания вследствие высокой скорости седиментации клеточных агрегатов и возрастания вязкости суспензий при высоких концентрациях клеточной биомассы;
интенсивное пенообразование и адгезия клеточной биомассы к стенкам культивационных сосудов;
сложность механизмов регуляции роста клеток и биосинтеза целевых продуктов.
Особенности выращивания суспензионных культур клеток высших растений:
Высокие требования к выбору систем культивирования и систем контроля процесса выращивания

Системы выращивания культур клеток высших растений
Колбы на качалке
Роллеры
Аппаратное культивирование (биореакторы).

Преимущества биореакторов:
- возможность контролировать процесс (рН, рО2, рСО2, to, ионы, плотность)

- возможность управлять процессом

Выращивание суспензионных культур клеток в колбах на качалке и биореакторах

Особенности аппаратного глубинного выращивания растительных клеток:
Культивирование в биореакторе:
дозированное поступление в аппарат определенных потоков (инокулята, воздуха или газовых смесей, питательных компонентов, пеногасителей, и т.д.);
отвод из него тепла, отработанного воздуха, культуральной жидкости, клеточной биомассы;
измерение и стабилизация основных параметров процесса на оптимальном для развития продуцента и образования целевого продукта уровне.

Основные типы биореакторов:
Главные задачи при выборе биореакторов:
стерильность процесса культивирования,
обеспечение необходимой для клеток скорости растворения кислорода,
подвод к клеткам других компонентов питания и отвод продуктов метаболизма,
равномерное распределение биомассы в рабочем объеме,
сведение к минимуму повреждающих воздействий на клетки,
регулируемость газового режима и температуры,
асептический отбор средней пробы биомассы.
Без механических перемешивающих устройств:
барботажные, эрлифтные
с выраженным циркуляционным контуром
С механическим перемешиванием

Общий признак – аэрация и перемешивание клеточной суспензии осуществляется сжатым воздухом, подаваемым в биореактор под определенным давлением.
Характеризуются достаточно простой конструкцией (отсутствуют трущиеся, движущиеся узлы) и высокой эксплуатационной надежностью.
Обладают относительно невысокими массообменными характеристиками (коэффициент массопередачи по кислороду редко превышает 4 кг/ м3ч), и, следовательно, не могут быть рекомендованы для выращивания культур клеток с высокой вязкостью или повышенными конечными концентрациями клеточной биомассы

Биореакторы без механического перемешивания

Обычно-цилиндрическая емкость, снабженная механическими перемешивающими устройствами, а также барботером, который устанавливается, как правило, под нижним ярусом мешалки.
В таких ферментерах можно в очень широких пределах изменять интенсивность массообмена
Основная проблема – высокая чувствительность клеток к механическому перемешиванию
Биореакторы с механическим перемешиванием

Кривые роста культуры клеток Polyscias filicifolia в биореакторах разных типов и объема
Выбор оптимальной конструкции биореактора зависит от индивидуальных особенностей конкретного штамма-продуцента
Сравнительная характеристика роста суспензионной культуры Dioscorea deltoidea Wall (штамм ИФР ДМ-0,5) в разных системах выращивания

Изменение накопления биомассы и жизнеспособности при культивировании в различных системах
3 штаммов суспензионной культуры клеток St. Glabra:
Барботажный биореактор (20 л)
С механическим перемешиванием (75 л)
Колбы на качалке

Прочие типы биореакторов:

Использование биореакторов для крупномасштабного выращивания суспензионных культур растительных клеток
Колбы (2 L)
Лабораторный барботажный биореактор(20 L)
Биореактор с механическим перемешивнием (75 L)
Промышленный барботажный биореактор (630 L)
Для проведения экспериментов по масштабированию выращивания- используют стратегию, типичную для микробных культур:
предварительные эксперименты в лабораторных биореакторах (объем 2 – 15 литров) по оптимизации роста культуры;
выращивание в пилотных установках (объемом до 100 литров) и проверка выбранных режимов;
масштабирование выращивания до полупромышленных и коммерческих биореакторов (объемом 500 литров и более)

Биореакторы промышленного объема и получаемая биомасса культуры клеток женьшеня

для каждого конкретного используемого штамма определяют:
оптимальные условия непрерывной аэрации;
оптимальные условия непрерывного перемешивания;
оптимальный режим культивирования
Масштабирование процесса аппаратного культивирования растительных клеток
При глубинном аппаратном культивировании – необходимо обеспечивать высокую интенсивность массообмена клеток со средой
основные функции :
осуществление массопереноса между различными фазами клеточной суспензии (газовой, жидкой и твердой);
поддержание гомогенных химических и физических условий в системе для равномерного распределения питательных компонентов и газов, транспорта тепла, диспергирования клеточной биомассы.

при аппаратном выращивании:
механическое перемешивание
перемешивание за счет подачи диспергируемого воздуха
комбинированные системы

Снижение жизнеспособности
Снижение содержания внутриклеточных метаболитов
Изменения метаболизма (изменение скорости поглощения О2, дыхательной активности, содержания АТФ, состава клеточных стенок)
Морфологические изменения (изменения размеров клеточных агрегатов)
Влияние гидродинамического стресса:
Минимизация стрессового эффекта:
индивидуальный подбор мешалок и газораспределительных устройств
индивидуальный подбор условий перемешивания (подбор скорости вращения мешалок и скорости подачи воздуха)
подбор либо создание штаммов, устойчивых к стрессовым воздействиям (с сохранением высокой продуктивности)
индивидуальная оптимизация конструкций биореакторов

Непрерывная аэрация:
непрерывная аэрация суспензионных культур растительных клеток
необходима:
для обеспечения аэробных условий выращивания
для отвода избытка тепла, образующегося в результате жизнедеятельности клеточной популяции
общая скорость поглощения O2 для растительных клеток варьирует в
пределах 10-4 г O2/г сухой биомассы*мин и зависит от:
индивидуальных особенностей клеточных линий
условий культивирования
фаз ростового цикла и т.д.

В настоящее время для аэрации суспензионных культур растительных
клеток при выращивании в биореакторах используют:
точечные газораспределяющие устройства
кольцевые газораспределяющие устройства
решетчатые и т.п.

Непрерывная аэрация:
Для каждого конкретного процесса подбор конструкции
барботера индивидуален.
Требования:
обеспечение наиболее оптимального тока воздуха
исключение возникновения слишком интенсивных турбулентных потоков
обеспечение массообмена по всему рабочему объему аппарата
Для предотвращения лимитации роста клеточных суспензий кислородом, концентрацию растворенного кислорода (dO2) в культуральной жидкости обычно поддерживают на уровне не ниже 10-15 % от насыщения.
Измерение общей скорости поглощения кислорода - распространенный метод контроля метаболической активности растительных клеток in vitro, адекватно отражает реакцию культур клеток на изменение условий выращивания (изменение температуры, рН, осмотический стресс, ингибирование, дефицит питания, взаимодействие с патогенами и т.д.)

При разработке эффективного аппаратурного культивирования - необходим подбор режима выращивания, оптимального для максимальной ростовой и биосинтетической активности суспензионной культуры клеток с учетом ее особенностей.

Вариант закрытого
культивирования – содержит
ограниченное первоначальное
количество питательного субстрата
и инокулята.
Периодический метод выращивания
После лаг-фазы – максимальная скорость роста, затем рост замедляется и прекращается (недостаток источников питания, накопление ингибирующих продуктов). При достижении максимума роста – наступление стационарной фазы (количество биомассы – const) с последующей деградацией.

Особенности:
пониженный риск контаминации и возникновения клеточных мутаций вследствие относительно короткого цикла выращивания;
высокая степень утилизации субстрата;
относительно низкая стоимость (в сравнении с затратами на обеспечение непрерывного проточного культивирования)
простота реализации
Периодический метод выращивания
Недостатки:
для многих объектов показано снижение уровня накопления биомассы и вторичных метаболитов (из-за выделения ингибирующих продуктов клеточного метаболизма и истощения субстрата в системе);
низкая продуктивность процесса в целом (большие временные затраты на подготовку оборудования (очистка, заполнение, стерилизация) и выращивание инокулята к каждому новому циклу);
дополнительный риск контаминации при внесении больших доз инокулята для промышленных объемов

Кривые роста
суспензионной
культуры
клеток
P.japonicus var.
repens при
выращивании
в 20 л
биореакторе
на средах с
разным
составом
ауксинов
Периодический метод выращивания
Оптимальное применение - проведение предварительных экспериментов в колбах или биореакторах по выявлению факторов окружающей среды, влияющих на продуктивность различных клеточных культур
(варьирование питательных компонентов, газового состава, интенсивности аэрации и скорости вращения перемешивающего устройства, проч.)

Проточные (непрерывные) методы выращивания.

Гомогенно-проточные способы (системы полного смешения).
Вариант открытого культивирования – в систему при полном перемешивании с постоянной скоростью непрерывно подают свежую среду, при этом общий объем клеточной суспензии поддерживают на постоянном уровне за счет непрерывного отлива с той же скоростью части культуры (V = const)
позволяет создавать во всем объеме аппарата одинаковые стационарные условия и стабилизировать продуцент в практически любом требуемом состоянии

Проточные (непрерывные) методы выращивания.

Гомогенно-проточные способы (системы полного смешения).
Особенности:
возможность получать определенное количество целевого продукта с заданными и воспроизводимыми характеристиками (условия процесса const);
возможность варьировать состав популяции клеток и их метаболическую активность за счет изменения концентраций поступающего кислорода и питательных компонентов;
возможность менять скорость протока среды позволяет в регулировать скорость роста культуры и концентрацию клеточной биомассы.
Недостатки:
нельзя контролировать получение вторичных метаболитов, биосинтез которых не ассоциирован с ростом клеточной популяции;
трудности в обеспечении стационарных условий для культур клеток с большой степенью агрегированности и высокой вязкостью;
риск потери штамма-продуцента за счет мутации клеток (отбора клеток с высокой скоростью пролиферации);
высокая стоимость и сложность систем контроля и автоматизации;
повышенный риск контаминации за счет увеличения продолжительности цикла культивирования

Рост клеток с глубоким лимитированием (модель сформировавшейся популяции).
Основан на измерении и регуляции входящих потоков.
Для исследований популяций растительных клеток впервые был опробован Вильсоном с соавт.(1971)
Проточные (непрерывные) методы выращивания.
Гомогенно-проточные способы (системы полного смешения).

ХЕМОСТАТ.
Концентрацию кислорода или одного из компонентов питательной среды на входе в ферментер фиксируют так, чтобы другие компоненты субстрата находились в избытке
Скорость размножения клеток в культуре ограничена лимитирующей концентрацией задающегося элемента субстрата

3 возможных результата в хемостатной культуре:
(Скорость прироста биомассы (Х) ограничена
концентрацией (S) лимитирующего субстрата)
0 – добавления среды не происходит: рост как в периодической культуре;
При поступлении среды (момент времени tr):
1 – скорость разбавления (D) больше удельной скорости роста μmax: концентрация биомассы падает, концентрация лимитирующего субстрата стремится к Sr;

2 – Dнач. = μmax:
стационарное состояние при максимальной удельной скорости роста культуры; концентрация биомассы и лимитирующего субстрата = const (Stady state);

Читайте также: