Приготовление гистологических препаратов реферат
Обновлено: 05.07.2024
Содержание темы
В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.
Здесь рассматриваются лишь те, которые связаны со световой и электронной микроскопией мёртвых (фиксированных) клеток и тканей .
1.1. Световая микроскопия
1.1.1. Устройство микроскопа
1. Оптическая система включает объектив и окуляр.
а ) Объектив (1) - это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда - и название).
Обычные увеличения объектива:
8 , 20 , 40 (сухие объективы),
Схема - строение светового микроскопа.
б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением
7, 10, 15.
в) Результирующее увеличение микроскопа - произведение увеличений объектива и окуляра, например:
г) Таким образом, функция оптической системы -
формирование увеличенного изображения препарата на сетчатке глаза наблюдателя.
а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример - обычная настольная лампа).
Одна поверхность зеркала - плоская, вторая - вогнутая;
последняя используется при искусственном освещении.
в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.
г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.
Она ограничивает световой поток, падающий на препарат.
При использовании объективов с большим увеличением отверстие диафрагмы следует уменьшить - для ослабления сферической аберрации.
а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты .
Макровинт используется при работе на малом увеличении,
а микровинт - на большом.
источник света (4) зеркало (5) конденсор (6) диафрагма (7)
препарат объектив (1) тубус (2) окуляр (3) .
1.1.2. Приготовление гистологического препарата
а) срезы органов (толщиной 5-15 нм),
б) мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки),
в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты
Чаще всего используются срезы.
2. Приготовление препарата обычно включает 4 следующих этапа:
а) взятие и фиксация материала,
б) обезвоживание и уплотнение материала,
в) приготовление срезов,
г) окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду.
1.1.2.1. Взятие и фиксация материала
2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей.
Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков .
1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала
2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань).
а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов -
70 % , 80 % , 96 % , 100 % этанол -
по 24 часа в каждом спирте.
б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле.
3. Заливка : помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин
Дают парафину, остывая, затвердеть;
вырезают из него блок с заключённым образцом и
закрепляют на деревянном кубике.
1.1.2.3. Приготовление срезов
1. Кубики вставляют в специальный прибор - микротом , - служащий для приготовления срезов.
2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм).
б) А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины.
1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду
ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин)
(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)
2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами
помещают на короткое время в раствор красителя,
промывают водой,
обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и
вновь промывают водой.
3. Препарат
опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией),
а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски.
1.1.2.5. Мазки и тотальные препараты: особенности приготовления
2. В подобных случаях, а также при приготовлении мазков, из 4-х перечисленных в п. 1.1.2. этапов опускаются два -
уплотнение материала и
приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя).
фиксация,
окраска и
заключение в консервирующую среду.
В остальных же случаях (т.е. при получении срезов) приготовление гистологического препарата - весьма долгая и трудоёмкая процедура.
Но при правильном её выполнении полученный препарат может храниться неопределённо долгое время.
1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов
1.1.3.1. Типы красителей
Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-
эозин (искусственная краска; название - от греч. эос - заря);
гематоксилин
(точнее, продукт его окисления - гематеин);
Существует большое количество различных способов окраски.
Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже.
1.1.3.2. Общие методы окраски
б) Сочетает основной и кислый красители.
в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры.
2. Ядра пр иобретают сине-фиолетовый цвет,
цитоплазма - желтовато-розовый цвет.
предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами,
а потом обрабатывают гематоксилином.
2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет.
3. Хорошо выявляются
структуры ядра,
границы клеток,
мышечные волокна.
1.1.3.3. Выявление неклеточных структур соединительной ткани
а) Краситель - смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина.
1. Краситель является трёхцветным: это смесь
кислого фуксина,
анилинового синего,
оранжевогo G,
а также двух кислот.
2.а ) Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет ;
1. а) Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем - восстановителями.
б) В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани. –
Эластические волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-красный цвет ;
Эластические волокна окрашиваются пикриновой кислотой в жёлтый цвет ,
коллагеновые волокна - в красный цвет ,
1. Используется для окраски костей и дентина.
2. а) Предварительно кусочки материала
подвергают декальцинации (с помощью кислоты),
а затем выдерживают в растворе алюмокалиевых квасцов.
б) Краситель - раствор тионина.
3 . а) Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет;
1.1.3.4. Окраска клеток соединительной ткани и крови
б) Отличия же от приготовления срезов таковы:
фиксацию мазков проводят чистым метанолом ;
окрашивание продолжают всего 30-45 мин, а не 12-14 ч;
для заключения под покровное стекло используют кедровое масло, а не канадский бальзам.
2. Эритроциты приобретают бледко-красный цвет,
цитоплазма лейкоцитов - голубой или синий цвет,
1.1.3.5. Выявление элементов нервной системы
Фиксацию материала в формалине проводят не менее 7 дней .
Уплотнение образца осуществляют не путём заливки в парафин (или целлюлозу), а путём замораживания .
Срез готовят на специальном замораживающем микротоме.
2. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами
азотнокислого серебра,
формалина,
аммиачного серебра.
1.1.4. Гистохимические методы исследования
а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата.
б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива.
1. Реактив (как отмечалось, - смесь двух красителей:
метилового зелёного и пиронина.
2. а ) А. Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет .
Б. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет.
б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек) - зелёные .
1. Основной реактив - фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа).
1. Реактив - Ш ифф-пер и одная к ислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК ).
2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа.
1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия
- изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.
2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты аморфного вещества соединительной ткани - гликозамингликаны
(являющиеся, как известно, гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов).
1.1.5. Просмотр препаратов
1.1.5.1. Срез; окраска гематоксилин-эозином
1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками ( 1).
2. а) Ядра клеток (2) - базофильны и окрашены гематоксилином в фиолетовый цвет.
1.1.5.2. Тотальный препарат: окраска судан III - гематоксилином
1. а) Препарат является тотальным.
б) Это означает, что перед нами - не срез органа, а участок сальника, растянутого на предметном стекле.
1.1.5.3. Срез после декальцинации; окраска по Шморлю
1. В процессе изготовления препарата костный материал подвергнут декальцинации (п. 1.1.3.3).
2. Применённый метод окраски позволяет выявить
стенки костных полостей (1) и канальцев (2) , окрашивающиеся в тёмно-коричневый цвет благодаря высокому содержанию здесь коллагеновых волокон.
1.1.5.4. Срез; окраска по Маллори
1. В методе Маллори используются 3 красителя (п. 11.3.3), что делает картину многоцветной.
2. На снимке - женская половая клетка (ооцит), находящаяся в фолликуле яичника.
3. Цитоплазма (1) клетки окрашена в розовый ,
окружающая её блестящая оболочка (2 ) - в голубой ,
1.2. Электронная микроскопия
Если в световом микроскопе увеличение составляет 100-1000 раз,
то в электронном микроскопе - 10.000 –100.000 раз (и выше), т.е. примерно в 100 раз больше .
1.2.1. Принцип работы электронного микроскопа
1.2.1.1. Особенности:
электронная волна, электромагнитные "линзы"
Длина же электронной волны значительно меньше, чем световой.
Соответственно, такая волна “чувствует” меньшие препятствия: разрешающая способность микроскопа оказывается выше.
1.2.1.2. Ход лучей
1. а) Источником электронов служит катод (1) ,
а движущей силой - разность потенциалов между катодом и анодом (2).
б) Анод расположен вблизи катода и имеет отверстие посередине, через которое проскакивают электроны.
б) вторая катушка (5) - в качестве объектива (принимает лучи, расходящиеся от образца),
1.2.2. Особенности приготовления препарата
вначале глутаральдегидом (стабилизация белков),
затем - четырёхокисью осмия ( стабилизация фосфолипидов и контрастирование ткани).
Читайте также: