Поверхностное культивирование микроорганизмов реферат

Обновлено: 02.07.2024

Название работы: Способы культивирования микроорганизмов

Предметная область: Биология и генетика

Описание: Поверхностное культивирование заключается в выращивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. Осуществляется поверхностное культивирование в специальных ваннах кюветах. Глубинное культивирование проводится на жидких питательных средах в которых микроорганизмы развиваются во всем объеме питательной среды. Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах ферментаторах снабженных мешалками и системой подвода стерильного воздуха для обеспечения роста аэробных микроорганизмов.

Дата добавления: 2015-03-17

Размер файла: 33.61 KB

Работу скачали: 19 чел.

Способы культивирования микроорганизмов

Способ культивирования зависит от конечной цели культивирования (целью является либо накопление биомассы, либо получение определенного продукта жизнедеятельности метаболита).

При периодическом культивировании весь объем питательной среды засевают чистой культурой, которую выращивают в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Следует отметить, что, так как культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), то клетки все время находятся в меняющихся условиях. Таким образом, периодическую систему можно рассматривать как замкнутую систему.

При непрерывном культивировании культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает питательная среда и откуда с такой же скоростью отводится культуральная жидкость. Для микроорганизма создаются неизменные условия среды, поэтому непрерывную систему можно рассматривать как открытую систему.

Поверхностное культивирование может быть только периодическим, в то время как глубинное культивирование может осуществляться и периодическим, и непрерывным способом.

Культивирование микроорганизмов – это один из основных приемов в микробиологии. Для роста и развития микроорганизмов в природе и в лабораторных условиях необходимо наличие питательных веществ для энергетических и конструктивных реакций. Требования разных групп микроорганизмов к источникам энергии и химическим элементам определяются их метаболическими возможностями. Выращивание и поддержание микробных культур в лаборатории основано на моделировании естественных условий обитания данного организма в лаборатории, а также на знании особенностей обмена веществ.

Содержание

Требование микроорганизмов к питательным средам………………………..3
Типы сред………………………………………………….. ……………………5
Способы культивирования микрооганизмов…………………………………..7
Смешанные и чистые культуры микроорганизмов. Накопительные культуры. Способы получения чистых культур…………………………………………. 9

Вложенные файлы: 1 файл

Реферат. Культивирование микроорганизмов..docx

Новосибирский Аграрный Техникум

Выполнила: Утина А.А.

Проверил: Вострокнутова И.В.

с. Раздольное 2014 г.

Требование микроорганизмов к питательным средам………………………..3
Типы сред………………………………………………….. ……………………5
Способы культивирования микрооганизмов…………………………………..7
Смешанные и чистые культуры микроорганизмов. Накопительные культуры. Способы получения чистых культур…………………………………………. 9

1. Требования микроорганизмов к питательным веществам

Основными биогенными элементами являются углерод, азот, фосфор, кислород, водород, сера. Это компоненты белков, углеводов и жиров, а также нуклеиновых кислот. Эти элементы требуются в значительных количествах (г/л) и поэтому их называют макроэлементами. К макроэлементам также относятся ионы калия, магния, натрия, кальция и железа. Они выполняют в клетке разнообразные функции. Например, К+ необходим для активности большого числа ферментов и в частности ферментов белкового синтеза. Са2+ определяет устойчивость бактериальных эндоспор к нагреванию. Mg2+стабилизирует рибосомы, многие ферменты и клеточные мембраны. Fe2+ и Fe3+ являются частью цитохромов и кофакторами электронпереносящих белков.

Микроэлементы, необходимые в микромолярных количествах, - это ионы таких металлов, как хром, кобальт, медь, молибден, марганец, никель, селен, вольфрам, ванадий, цинк, обычно входящие в состав ферментов и кофакторов. Например, Со2+является компонентом витамина В12, Cu2+ входит в состав цитохромоксидазы и купредоксинов, Mn2+ активирует ферменты, катализирующие перенос фосфатных групп, Мо2+ входит в состав нитрогеназы и нитратредуктазы, Ni2+ является компонентом уреазы, гидрогеназы, кофактора F430, Zn2+ входит в состав карбоангидразы, ДНК- и РНК-полимераз и т.д. Необходимые для микроорганизмов количества микроэлементов содержатся в обычной водопроводной воде. При работе на дистиллированной воде микроэлементы добавляют специально в виде растворов их минеральных солей. Некоторые группы микроорганизмов проявляют специфические потребности. Так, диатомовые водоросли, включающие в свои клеточные стенки значительные количества соединений кремния, требуют добавления их в среду в высокой концентрации.

Биогенные элементы должны присутствовать в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Как правило, ионы металлов, сера, фосфор и микроэлементы добавляют в среду в виде минеральных солей. Минеральная основа среды (минеральный фон) практически одинакова для большинства микроорганизмов.

Источники углерода и азота в среде могут быть как неорганическими соединениями (СО2, N2, карбонаты, нитриты, нитраты, аммонийные соли), так и органическими веществами разной степени сложности и окисленности (сахара, спирты, органические кислоты и аминокислоты, олигосахариды, пептиды и т.д.). Если микроорганизму требуется набор источников углерода или азота, и тогда применяют различные экстракты и гидролизаты смеси белков и полисахаридов неопределенного состава (сусло, гидролизат молочного белка, пептон и др.).

У некоторых микроорганизмов спектр потребляемых органических веществ очень широк (например, у Pseudomonas,Actinomyces), у других – достаточно узок (например, у облигатных метилотрофов). В то же время, можно найти микроорганизмы, способные использовать сложные неприродные соединения типа пластиков, красителей, пестицидов. У некоторых микроорганизмов потребности в питании так сложны, что они растут только внутри живого организма (например, внутриклеточные паразиты риккетсии и хламидии).

Как правило, лабораторные среды содержат питательные вещества в более высоких концентрациях, чем это присуще природным местообитаниям. Для разных микроорганизмов границы значений физико-химических факторов, в которых может происходить рост, существенно отличаются. Поэтому важным условием успешного культивирования является поддержание оптимальных значений таких параметров, как рН, температура, освещенность, аэрация и т.д.

2. Типы сред и способы культивирования микроорганизмов

Разнообразные питательные среды, используемые в микробиологической практике для культивирования микроорганизмов, подразделяются по составу, физическому состоянию и назначению.

По составу среды делятся на натуральные и синтетические. Синтетические среды применяют для изучения обмена веществ у микроорганизмов. Они имеют определенный химический состав с точным указанием концентрации каждого соединения. Натуральные среды применяют для накопления биомассы микроорганизмов и широко используют для первичного выделения из естественных субстратов, поскольку их состав позволяет удовлетворить питательные потребности многих групп микроорганизмов. В них содержатся богатые различными органическими веществами продукты животного или растительного происхождения, имеющие сложный и непостоянный состав. Часто натуральные среды готовят на основе мясо-пептонного бульона (МПБ) и солодового сусла. МПБ – это прокипяченный экстракт мясного фарша с добавлением пептона и поваренной соли. Он богат азотсодержащими органическими соединениями, но обеднен углеводами. Солодовое сусло, напротив, содержит преимущественно углеводы. Его получают путем настаивания размолотого солода в водопроводной воде при постепенном нагревании. Солодом называют пророщенные и высушенные зерна ячменя. В процессе приготовления сусла происходит гидролиз крахмала ячменя и экстракция сахаров в воду. В зависимости от партии зерна концентрация сахаров в сусле может быть разной. Ее выражают в градусах Баллинга (оБ), что примерно соответствуют процентному содержанию сахаров в растворе. Сусло с разной концентрацией сахаров применяют для выращивания разных групп микроорганизмов.

Жидкие среды представляют собой растворы или суспензии ингредиентов в воде. В качестве сыпучих сред применяют наборы длительно хранящихся сухих компонентов, которые перед работой растворяют или смачивают водой. Это могут быть зерно, отруби, твердые отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности. В настоящее время получили широкое распространение порошкообразные синтетические и натуральные среды. Для получения твердых сред в жидкую основу добавляют уплотняющие агенты. Наиболее известными отвердителями являются желатин, агар и силикагель. Желатин – это белок из соединительной ткани животных, образующий гель при 25оС. Неудобство его применения заключается в том, что температура роста многих микроорганизмов выше, чем температура плавления желатина. Наличие протеолитических ферментов у многих микроорганизмов приводит к расщеплению и разжижению желатина. Более удобен как уплотнитель сложный полисахарид агар, получаемый из морских бурых водорослей, так как большинство микроорганизмов не использует его для питания. Агар может многократно плавиться при 100оС и застывать при 45оС. Добавлением 2% агара в жидкую основу получают широко применяемые мясо-пептонный агар (МПА), сусло-агар (СА) и бульон-сусло-агар (БСА). В качестве твердой основы для синтетических сред часто используют неорганическое соединение кремния силикагель.

По назначению среды подразделяются на универсальные, элективные и индикаторные. Универсальные среды используют для накопления микробных клеток и первоначального выявления видового разнообразия микроорганизмов в смешанных популяциях. Они позволяют поддерживать рост значительного числа микроорганизмов. В то же время следует помнить, что не существует одной среды, универсальной для всех микробных культур. Элективные среды используют для получения накопительных культур как первого этапа при выделении чистой культуры из природных местообитаний. Создание условий, благоприятных для определенной группы микроорганизмов (элективных условий), приводит к преобладанию в смешанной популяции желаемых микроорганизмов. Рост и размножение других микроорганизмов в этих условиях не значительны. Для быстрого выявления определенных групп микроорганизмов или особенностей их метаболизма применяют индикаторные среды, содержащие вещество-индикатор, реагирующий изменением цвета на проявление какого-либо свойства организма. Индикаторные среды наиболее часто используют в санитарной и медицинской микробиологии.

3. Способы культивирования микроорганизмов

Особенности роста микроорганизма (культуральные свойства) иногда служат одним из критериев при определении его систематического положения. Микробные клетки в зависимости от условий могут расти в виде суспензии, микроколоний или обрастаний в жидких средах и образовывать колонии, штрихи или газон на твердых средах. Глубинные колонииформируются в толще агаризованных сред в виде чечевичек, тонких пленок или пучков ваты. Из-за выделения газов микроорганизмами при глубинном росте могут наблюдаться разрывы агаризованной среды. Поверхностные колонии отличаются большим разнообразием формы, размера, цвета, профиля. Колония может быть прозрачной, плотной, мягкой, хрупкой, врастать в агар, сниматься целиком в виде пленки, тянуться за петлей и т.д. Ее поверхность может быть блестящей или матовой, гладкой или шероховатой, иметь различные выпуклости, исчерченность и т.д. Различия в форме края и структуре колоний можно увидеть при малом увеличении микроскопа. Морфология колоний может значительно изменяться в зависимости от состава среды, возраста культуры и температуры культивирования. При посеве штрихом (прямой линией по агару) рост бывает обильный или скудный, сплошной или в виде цепочек очень мелких колоний, перистый, древовидный с различной формой края. При развитии культуры в жидких средах развитие микроорганизма может приводить к окрашиванию среды и появлению запаха, образованию пены и пузырьков, появлению помутнения, пленки на поверхности среды или осадка на дне сосуда.

Непрерывное (проточное) культивирование позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Этого добиваются постоянным прибавлением новой питательной среды в сосуд для выращивания и одновременным удалением такого же количества среды с клетками. Простейшая схема организации протока представлена на рис. 45. Подача свежей среды и удаление части суспензии (проток) происходит с той же скоростью, с какой растет культура. В этом случае устанавливается динамическое равновесие.

Некоторые микроорганизмы способны к пребыванию в особом физиологическом состоянии, при котором живые клетки не дают колоний на пригодных для них лабораторных средах, но под микроскопом наблюдаются как живые. Такое некультивируемое состояние (некультивируемая форма) присуще ряду микроорганизмов в природных местообитаниях, например, возбудителям сальмонеллеза и холеры, находящимся вне организма человека. Механизм перехода в некультивируемую форму и обратно не изучен, но есть данные о том, что этот процесс запрограммирован в геноме микроорганизмов и запускается недостатком питательных веществ в природных эконишах. В природных образцах такие микроорганизмы изучают путем прямого наблюдения и с помощью методов молекулярного анализа состава нуклеиновых кислот образца.

4. Смешанные и чистые культуры микроорганизмов. Накопительные культуры. Способы получения чистых культур

В качестве субстратов, используемых для культивирования микроорганизмов на твердых питательных средах, применяют, как правило, нестандартное сырье - различные отходы пищевой промышленности. Среди них наиболее часто используют пшеничные отруби, свекловичный жом, проросшие ячменные зерна (солод), шелуха от некоторых сельско- хозяйственных культур (риса, гречихи, подсолнуха). В качестве разрыхлителя субстрата часто используют древесные опилки. Все эти виды субстратов отличает низкое содержание азотсодержащих веществ, поэтому в качестве добавок к ним добавляют такие азотсодержащие соли, как сульфат аммония и различные добавки микроэлементов и ростовых факторов.

Перед использованием готовый субстрат подвергают тщательной стерили-зации, чтобы обеспечить максимально возможное подавление посторонней микрофлоры. Микробиологический контроль при этом обычно ведут по наличию спор бактерий, так как именно они наиболее устойчивы к различным методам стерилизации. Наиболее часто стерилизацию проводят обработкой острым паром (более 120 С). Однако это часто приводит к комкованию среды, что резко ухудшает процесс стерилизации таких комков на всю глубину, и кроме того, этот процесс является весьма длительным, энерго- и материалоемким. Поэтому на ряде производств в последнее время стали использовать для стерилизации принципиально другие методы, например уничтожение микроорганизмов γ- или рентгеновскими лучами.

Поскольку практически все продуценты культивируемые поверх- ностным способом являются аэробами, то им для дыхания необходим интенсивный подвод воздуха.

Очистка используемого воздуха и его стерилизация осуществляется с использованием волокнистых фильтрах. Перед растительными камерами всегда устанавливают кондиционеры для поддержания необходимой температуры и влажности. В связи с использованием воздуха в качестве теплоносителя расход его достигает значительной величины. Поэтому практически любая технологическая схема подготовки и циркуляции воздушного потока предусматривает его рецикл, в котором участвует до 90% воздуха. При этом циркулирующий воздух проходит через воздухоохладитель, а часть отработанного воздуха очищается на фильтрах от пыли и микробных клеток, а затем выбрасывается в атмосферу.

Решение проблемы теплообмена существенно упрощается благодаря тому, что так же неравномерно в ходе культивирования происходит и потребление кислорода (воздуха), при этом максимум потребления кислорода совпадает с максимумом тепловыделения. В конце культивирования потребление кислорода становится минимальным, одновременно уменьшается и выделение тепла. Это позволяет использовать холодный воздух, подаваемый в ферментер для съема и отвода выделяющегося в ходе культивирования тепла.

Поверхностное культивирование заключается в выращивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. При этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании на жидких средах микроорганизмы растут в виде пленок. Осуществляется поверхностное культивирование в специальных ваннах – кюветах. Поверхностное культивирование может быть только периодическим, в то время как глубинное культивирование может осуществляться и периодическим, и непрерывным способом.

Методы долива и пленок применяют при производстве лимонной кислоты при поверхностном культивировании.

Поверхностный способ реализуется на твердой сыпучей среде и в жидкой фазе. При жидкофазной поверхностной ферментации питательную среду разливают в кюветы слоем от 8 до 18 см. Кюветы размещают на стеллажах в предварительно простерилизованной парами формалина бродильной камере. Через специальные воздуховоды с током стерильного воздуха поверхность среды засевают исходной музейной культурой. В качестве посевного материала используют предварительно полученные также в условиях поверхностной культуры и высушенные споры (конидии) из расчета 50–75 мг конидий на 1 м2 площади кювет.

При использовании метода пленок через 7 суток после завершения кислотообразования сброженный раствор мелассы сливают из кювет, мицелий промывают стерильной водой и в кюветы заливают новую среду.

Бессменный способ с доливом характеризуется дробными добавками мелассы под пленку гриба на стадии кислотообразования (30–35 % от исходного объема), так называемый режим с подпиткой субстратом. Это позволяет повысить выход лимонной кислоты на 15–20 % с единицы поверхности при сокращении затрат сахаров на 10–15 % по сравнению сдругими методами.

Глубинное культивирование проводится на жидких питательных средах, в которых микроорганизмы развиваются во всем объеме питательной среды. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах – ферментаторах, снабженных мешалками и системой подвода стерильного воздуха для обеспечения роста аэробных микроорганизмов. Аэрирование – продувание стерильного воздуха через культуральную жидкость. Глубинный способ является более выгодным для промышленности по сравнению с поверхностным способом, так как позволяет осуществлять полную механизацию и автоматизацию процесса, избегать инфицирования технологического процесса посторонней микрофлорой.

Начиная с 1950 года, промышленные процессы получения лимонной кислоты стали переводить в условия глубинной культуры. Стабильный процесс возможен при его организации в две стадии: рост мицелия на полной среде в ходе первой стадии и на второй (при отсутствии фосфора в среде) – образование лимонной кислоты. Глубинная ферментация проводится в аппаратах емкостью 50 м3 с заполнением на 70–75 %. В качестве посевного материала используют мицелий, подрощенный также в условиях глубинной культуры. В производственном аппарате, куда подрощенный мицелий передается по стерильной посевной линии, питательная среда содержит 12–15 % сахаров. Ферментацию проводят при 31–32 °С при непрерывном перемешивании. В ходе процесса кислотообразования (5–7 суток) реализуют интенсивный режим аэрации (до 800–1000 м3/ч) с дробным добавлением сахаров, 2–3 подкормки. Выход лимонной кислоты составляет от 5 до 12 %, остаточная концентрация сахаров – 0.2–1.5 %, доля цитрата – 80–98 % от суммы всех органических кислот.

Среды для получения органических кислот.

Разнообразны и субстраты, используемые в производстве органических кислот. Применяемые в начале века глюкоза и сахароза со временем стали заменять более доступными комплексными средами (мелассой, гидролизным крахмалом); в 60-е годы были разработаны новые процессы получения органических кислот на жидких парафинах нефти.

Питательные среды для культивирования продуцентов лимонной кислоты в качестве источника углерода содержат дешевое углеводное сырье: мелассу, крахмал и глюкозный сироп. Гриб Acetobacter niger чаще всего выращивают на мелассе. Гриб Trichoderma viride синтезирует значительные количества цитрата из глюкозы, что позволяет использовать для этого процесса целлюлозу. Предложены штаммы бактерий и дрожжей рода Candida, осуществляющие процесс на основе н-парафинов (С₉-С₃₀), которые пока широко не внедрены в промышленность.

В качестве сырья при промышленном производстве молочной кислоты используют сахарную и тростниковую мелассу и гидролизаты крахмала, при этом концентрация сахаров в исходной среде в зависимости от характера брожения составляет примерно от 5 до 20 %. Используют восстановленные формы азота, сульфаты или фосфаты аммония, а также солод и кукурузный экстракт в качестве источника факторов роста. Возможно использование сульфитного щелока.

При получении пропионовой кислоты в качестве субстрата брожения бактерии используют различные сахара (лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, органические кислоты – яблочную и молочную).

При производстве итаконовой кислоты среды содержат высокие концентрации сахаров, обычно используют мелассу, при дефиците фосфора и железа. Особенностью процесса получения данной кислоты является высокая потребность продуцента в солях цинка, магния и меди.

© 2014-2022 — Студопедия.Нет — Информационный студенческий ресурс. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав (0.003)

Для успешного культивирования микроорганизмов важно не только правильно подобрать питательную среду и правильно произвести посев, но еще необходимо создать и оптимальные условия: обеспечить соответствующую температуру, влажность, аэрацию. Как правило, успешное культивирование микроорганизмов в лаборатории удается только при тщательном воспроизведении условий природной для них среды.

Оптимальную температуру при культивировании большинства патогенных для теплокровных (в том числе и человека) микроорганизмов (37 градусов) создают в термостате.

Термостат представляет собой прибор с двойными стенками, между которыми находится воздух или вода. Подогрев воды осуществляется при помощи электрического тока. Термостат снабжен терморегулятором, автоматически поддерживающим нужную температуру, и термометром для контроля за температурой.

Пробирки с посевами устанавливают в штативах на полках термостата. Чашки в термостате должны стоять вверх дном.

Чтобы воздух в термостате свободно циркулировал и нагрев был равномерным, полки в термостате делают с прорезами и при работе плотно не загружают.

Чтобы не охладить культуры, термостат надолго не оставляют открытым.

Жизнь микроорганизмов возможна только во влажных условиях. Для микробов необходима капельно – жидкая среда – вода, так как питательные вещества проникают в клетку только в растворенном состоянии. Минимальное содержание свободной воды, при котором еще возможно развитие, для большинства микроорганизмов равно примерно 20%.

При культивировании в жидких питательных средах проблемы поддержания влажности не существует.

Свежеприготовленные агаризированные среды всегда содержат некоторое количество капельно – жидкой воды. Она бывает заметна в виде более или менее обильного конденсата, Однако при длительном хранении культур на плотных средах при комнатной температуре и даже в холодильнике среды подсыхают, что может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому необходимо производить регулярные своевременные пересевы культур, не допуская подсыхания сред. Если предполагается длительное культивирование в термостате, то чашки или пробирки лучше всего поместить во влажную камеру, т.е в закрытый сосуд, где имеется емкость с водой. Некоторые грибы могут расти на плотных субстратах без капельно – жидкой среды, но во влажной атмосфере.

В день посева плотные питательные среды, основу которых составляет агар – агар, расплавляют на водяной бане и в жидком состоянии стерильно разливают в чашки Петри. После застывания агара и подсушивания конденсационной воды в термостате, можно производить посев на пластинчатый агар. Скашивать плотные питательные среды в пробирках также лучше в день посева. При культивировании микробов особенно чувствительных к отсутствию влаги (например, гонококков) в термостат ставят открытый сосуд с водой.

Подавляющему большинству микробов, в том числе и патогенным, свет не нужен. Прямые солнечные лучи отрицательно влияют на развитие многих микроорганизмов, поэтому их культивируют в неосвещенных термостатах. Однако, для изучения пигментообразования, которое происходит активнее при рассеянном свете, культуры после термостата выдерживают 2 – 3 дня при комнатном освещении.

Микроорганизмы, использующие в процессах обмена веществ энергию света, выращиваются при освещении. Для освещения обычно применяют лампы накаливания мощностью 75 – 100 вт. При культивировании водорослей можно использовать и люминесцентные лампы.

Большинство патогенных микробов культивируют 18 – 24 часа, но есть виды, развивающиеся значительно быстрее (холерный вибрион 8 – 10 часов) или медленнее (бруцеллы 5 – 27 дней, туберкулезные бактерии 4 – 6 недель и т.д.).

Продолжительность культивирования микроорганизмов зависит от скорости их размножения. Чтобы сохранить влагу в пробирках при длительном культивировании микробов, ватные пробки после посева заменяют стерильными резиновыми или надевают на них резиновые колпачки.

По потребности микробов в свободном кислороде их делят на облигатные аэробы (возбудители холеры, чумы, туберкулеза), анаэробы (возбудители столбняка, ботулизма, газовой раневой инфекции, бактероиды) и факультативные анаэробы (возбудители брюшного тифа, дизентерии, стафилококки и др.). Эти группы требуют различных условий культивирования.

При культивировании аэробов и факультативных анаэробов поступление необходимого кислорода осуществляется при пассивной и активной аэрации.

Пассивная аэрация – это культивирование микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах, закрытых ватными или ватно – марлевыми пробками, а также на плотных питательных средах в чашках Петри. В этом случае микроорганизмы развиваются на поверхности среды и получают кислород непосредственно из воздуха пробирки или чашки Петри. Поэтому при поверхностном культивировании микроорганизмов стараются увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. Для этого среды наливают тонким слоем в посуду с широким дном (чашки Петри, колбы Виноградского, матрацы).

На жидких средах аэробные микроорганизмы растут в виде пленок, обычно достаточно плотных. Факультативные анаэробы развиваются также и в толще жидкой среды, образуя более или менее равномерное помутнение или хлопья. Для них характерны менее плотные пленки, чем для облигатных аэробов.

Поверхностное культивирование микроорганизмов применяют в лабораториях и в промышленности.

Активную аэрацию применяют при глубинном культивировании микробов, когда их выращивают в больших объемах среды. Чтобы достаточно снабдить кислородом такие культуры, их помещают в специальные качалки – постоянное перемешивание культуры обеспечивает соприкосновение ее с воздухом. При культивировании микробов в объемах жидкости, достигающих десятков и сотен литров, используются приборы, называемые реакторами или ферменторами. Воздух продувают через культуру при помощи специальных устройств.

Культивирование анаэробов сложнее, чем аэробов, так как их необходимо лишить доступа свободного кислорода воздуха. Для этого из питательной среды удаляют воздух, применяя различные способы:
1. Удаление кислорода механическим путем. Анаэробные микроорганизмы можно культивировать в обычных чашках Петри, помещая их сразу после засева в анаэростат, из которого затем откачивается воздух. Анаэростаты – это вакуумные металлические или стеклянные эксикаторы. Металлические анаэростаты имеют герметически закрывающуюся крышку и снабжены манометром. Они способны сохранять высокое разряжение в течение длительного времени. Стеклянные вакуумные эксикаторы имеют пришлифованную крышку с краном на шлифах для откачивания воздуха. Пришлифованные поверхности эксикатора во избежание проникновения в него воздуха покрывают специальной вакуумной смазкой.
2. Замещение воздуха в анаэростате азотом, аргоном, водородом или смесью азота с углекислым газом.
3. Культивирование в высоком столбике агара с глюкозой. При этом способе микроорганизмы растут на дне, защищенные от воздуха высоким слоем среды.
4. Удаление кислорода химическим способом достигается при его окислении различных веществ кислородом, содержащимся в среде и сосудах для культивирования.
5. Метод Виньяля – Вейона заключается в том, что посев производят в пробирку с расплавленным и остуженным до 45 градусов агаром. Содержимое пробирки перемешивают и набирают в пастеровскую пипетку при помощи груши, заполняя пипетку до самого верха. Необходимо следить, чтобы в пипетку не попали пузырьки воздуха. Тонкий конец пипетки запаивают и пипетку помещают в термостат. В толще агара вырастают изолированные колонии анаэробов.
6. Добавление в среду редуцирующих (окисляющих) веществ. Используют среду Китт – Тароцци, содержащую в качестве редуцирующих веществ 0,5% раствор глюкозы, кусочки печени или яичного белка. Перед посевом среду кипятят 20 минут на водяной бане для удаления из нее растворенного кислорода. Перед посевом в пробирку на поверхность питательной среды наливают стерильное масло слоем 0,5 – 1,0 см для защиты анаэробов от проникновения кислорода.
7. Биологический метод Фортнера. В чашку Петри наливают толстым слоем агар с 5% крови. Чтобы культуры не смешивались, по диаметру чашки делают желобок в агаре. На одну половину питательной среды засевают аэробы, на другую – анаэробы. Края чашки тщательно заливают парафином. Посевы ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, а после поглощения ими кислорода, находящегося в чашке, начнут развиваться анаэробы.

Культивирование актиномицетов, грибов, микоплазм, L-форм, спирохет и простейших принципиально сходно с культивированием бактерий. Для них разработаны специальные среды и подобраны режимы, соответствующие их потребностям.

По типу питания грибы являются гетеротрофами. В качестве источника углерода грибы могут использовать большинство органических веществ. Однако, некоторые грибы лучше используют глюкозу, другие – фруктозу или пентозу. В качестве источника азота грибы могут использовать такие органические соединения как белки, пептон, пептиды, аминокислоты, соли аммония, нитраты, азот атмосферы. Диапазон использования перечисленных источников азота у разных видов грибов неодинаков.

Для роста и жизнедеятельности грибов необходимы минеральные вещества. Кроме макроэлементов (углерода, кислорода, водорода, азота, серы, фосфора, калия, кальция, магния, железа) им необходимы и микроэлементы (марганец, цинк, медь, кобальт, никель и др.).

Важную роль в физиологии грибов играют витамины. Потребность в витаминах у грибов зависит от ростовой реакции.

В отношении питательных сред большинство грибов крайне непритязательны. Они хорошо растут на самых разнообразных субстратах: картофеле, моркови, сахарном агаре, глицериновом агаре. Оптимальный рост грибов происходит при температуре 26 – 28 градусов. В зависимости от состава питательной среды особенности культуральных чвойств того или иного гриба могут варьировать.

Грибы культивируют с разными целями – для поддержания в жизнеспособном состоянии без потери функций и особенностей строения, для идентификации, получения продуктов метаболизма грибов, сохранения посевных культур и т.д. Подбор среды для культивирования грибов зависит от цели исследования и биологических особенностей микроорганизма.

Среды для культивирования грибов по составу ингредиентов бывают: 1. Природные – разнообразные субстраты растительного и животного происхождения (корнеплоды, зерно злаков, листья, стебли растений, органы и ткани животных).
2. Полусинтетические – это комбинированные среды из природных субстратов и химически известных компонентов.
3. Синтетические – состоящие из ингредиентов известного состава. Различные комбинации ингредиентов в синтетических средах и их концентраций практически не ограничены и могут служить для выяснения разнообразных процессов жизнедеятельности грибов, связанных с их ростом, размножением и физиологической активностью.

Для актиномицетов наиболее подходящими питательными средами являются щелочной глицериновый агар, картофель, сывороточные, мясные и асцитические среды, а также агар Сабуро. Посевы культивируют в аэробных и анаэробных условиях при 35 – 37 градусах не менее двух недель.

Культивирование кишечных простейших на специальных питательных средах является биологическим методом обогащения, позволяющим из единичных экземпляров паразитов получить достаточное их количество. Увеличение количества экземпляров в результате их размножения на питательной среде облегчает обнаружение и изучение паразитов.

Для культивирования кишечных амеб применяется среда, в состав которой входят четыре яйца и среда Локка (1000 мл дистиллированной воды, NaHCOз – 0,2г, хлористый кальций – 0,2г, KCl – 0,4г, NaCl – 9,0г, глюкозы – 2,5г, рН среды – 7,4). Для получения скошенной поверхности среды, пробирки в наклонном положении помещают в аппарат для свертывания и выдерживают при 70 градусах до затвердевания. Перед посевом в пробирку с плотной питательной средой добавляется несколько капель инактивированной человеческой или лошадиной сыворотки и 1 – 2 петли стерильного рисового отвара.

Для культивирования жгутиконосцев к 200 мл среды Локка добавляется одно яйцо, и полученная смесь подогревается на водяной бане в течение 15 минут. Затем смесь фильтруется через марлю, разливается по 5 – 6 мл в пробирки и стерилизуется в автоклаве под давлением в течение 20 минут.

При культивировании балантидий может быть использована среда Френкеля (4,0г аспарагина, 6,0г ammonium lacticum, 2,0г двухзамещенного фосфорнокислого калия, 5,0г NaCl, 1000 мл дистиллированной воды). Среда стерилизуется в автоклаве в течение 20 минут при 120 градусах, 1 атм. Затем к ней добавляются стерильные лошадиная сыворотка в разведении 1:10 и 2 – 3 капли крахмала (рН среды 7,2 – 7,4).

Культивирование простейших осуществляется в термостате при 37 градусах. Пересевы проводятся через день.

Риккетсии, хламидии и вирусы, являющиеся строгими внутриклеточными паразитами, совершенно не культивируются на искусственных питательных средах, используемых для культивирования бактерий, грибов, микоплазм и простейших.

Риккетсии обладают собственным метаболизмом, однако являются полностью энергетически зависимыми от тканевой клетки, поэтому риккетсии и являются внутриклеточными паразитами.. В клетке хозяина каждый вид риккетсий размножается только в определенных местах: в цитоплазме, ядре или вакуолях клеток. Риккетсии культивируются в кишечнике платяных вшей, желточном мешке развивающегося куриного эмбриона, в клетках легких белых мышей, в клетках неперевиваемых культур тканей.

У хламидий наблюдается не только энергетическая зависимость от клетки ткани, но и слабо выражена метаболическая активность. Поэтому хламидии можно культивировать только в желточном мешке развивающегося куриного эмбриона или в клетках культур тканей.

Культивирование вирусов проводится для их выделения и накопления с диагностическими целями, для последующего их изучения, для получения биологических препаратов, для изучения вирусного онкогенеза и патогенеза вирусных инфекций.

Вирусы являются строгими внутриклеточными паразитами и для их культивирования применяются (при строгом контроле) три метода:
1) в организме восприимчивого животного;
2) в развивающемся курином эмбрионе;
3) в культуре клеток.

В вирусологической практике для культивирования вирусов используют преимущественно новорожденных животных, поскольку они более чувствительны к вирусам. Этот метод имеет ограниченное применение, поскольку вирусы обладают очень выраженным специфическим тропизмом.

Куриные эмбрионы используются для культивирования только некоторых вирусов – гриппа, герпеса, натуральной и обезьяней оспы, паротита.

Наиболее широко в вирусологической практике для культивирования вирусов используются клетки культур тканей. Эти клетки по числу жизнеспособных генераций можно подразделить на три группы:
1. Первичные;
2. Перевиваемые;
3. Полуперевиваемые.

К первичным культурам относятся культуры клеток, способные выдерживать не более 5 – 10 пассажей. Их готовят преимущественно из эмбриональных тканей: почечной ткани эмбриона человека и обезьян, амниона человека, куриного эмбриона, эмбриона мышей, а также из почек взрослых обезьян.

К полуперевиваемым культурам клеток относятся культуры диплоидных клеток, получаемых из фибробластов человеческого эмбриона. Эти клетки выдерживают до 150 генераций, сохраняя исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки нашли широкое применение в вирусологии.

Перевиваемые культуры получают преимущественно из опухолевых клеток одного типа, хорошо размножающихся in vitro в течение длительного времени. К таким клеткам относятся линии, ведущие свое начало от карцином человека (HeLa, Hep -2 и др.). Основное преимущество перевиваемых линий перед первичной культурой клеток состоит в их способности размножаться в лабораторных условиях в течение длительного срока в многочисленных генерациях.

Для выращивания культур клеток любого типа необходимы питательные среды. Наиболее широкое применение нашла среда 199. В состав этой среды входят минеральные соли, глюкоза, аминокислоты, витамины, ко – ферменты и многие другие компоненты. Кроме того, в питательную среду обязательно вносят сыворотку крови и буферные растворы для поддержания стабильного рН. Чтобы предотвратить бактериальное загрязнение, в среду добавляют антибиотики.

Читайте также: