Криоконсервация и витрификация биологических объектов реферат

Обновлено: 04.07.2024

Криоконсерва́ция (от греч. κρύος — холод и лат. conservo — сохраняю) — низкотемпературное хранение живых биологических объектов с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания.

Содержание

Эффективность и объекты криоконсервации

В настоящее время разработаны и успешно применяются в медицине, сельском хозяйстве и научном эксперименте методы криоконсервации клеточных культур, тканей (кровь, сперма), ранних (преимплантационных) эмбрионов. Изолированные органы плохо переносят криоконсервацию, методы криоконсервации целых органов не разработаны, эффективность их низкая. Случаи успешной трансплантации криоконсервированных органов редки, как правило, в таких случаях речь может идти не о восстановлении после размораживания целого органа, а о присутствии в размороженном органе отдельных областей живой ткани. Другими словами, выживает после криоконсервации не орган как единое целое, а участки ткани, которые могут после трансплантации успешно прижиться (например, при трансплантации размороженной яичниковой ткани). Случаи успешной криоконсервации теплокровных животных (в том числе человека) до сих пор не зафиксированы. В настоящее время не существует методов, обеспечивающих выживание криоконсервированных людей, иных млекопитающих животных, а также птиц.

Температурный режим

Как правило, криоконсервацию осуществляют при температуре −196 °C, помещая капсулы с биологическими объектами в жидкий азот. Реже пользуются более высокими температурами (от −180 °C до −130 °C), которые создают электрифицированные морозильные камеры, но данный температурный режим менее надежен и подходит не для всех объектов. Использование температур выше −130 °C малоэффективно и используется редко (например, хранение на сухом льду при −79 °C). Сохранение живых объектов при температурах около нуля градусов традиционно не относят к криоконсервации. Использование низких температур обеспечивает остановку биохимических процессов в клетках, в том числе останавливается обмен веществ и энергией с внешней средой, благодаря этому живые объекты могут сохраняться сколь угодно долго.

Криоповреждения

Криопротекторы

Лишь некоторые клеточные культуры, а также бактерии могут быть эффективно криоконсервированы без предварительной подготовки. Для эффективной криоконсервации клетки замораживаемых объектов должны быть насыщены криопротекторами — веществами, уменьшающими криоповреждения. После размораживания необходимо удалить криопротекторы из клеток.

Соответствие термина в иностранных языках

Наиболее интригующая область приложения криобиологии – науки о влиянии низких и сверхнизких температур на биологические объекты – поиск возможностей сохранения живых организмов или отдельных органов в состоянии глубокой заморозки. Методика криосохранения отдельных клеток или, например, эмбрионов разработана неплохо, но обратимое (т.е. с сохранением жизнеспособности после размораживания) замораживание крупных объектов наталкивается на серьезные препятствия. Основная трудность состоит в том, что при больших объеме и массе трудно добиться равномерного охлаждения. Неравномерное же замерзание приводит к серьезным и необратимым повреждениям клеток и тканей. Между тем решение этой проблемы могло бы помочь, например, созданию банка органов для трансплантации и тем самым спасти жизнь тысячам больных. Еще более заманчивой выглядит возможность сохранения в состоянии глубокого охлаждения тяжелобольного – до тех пор, пока медицина не окажется в состоянии ему помочь, может быть, через десятилетия.

Наибольшую опасность при замораживании представляет механическое повреждение мембран клеток образующимися кристаллами льда. Образуясь как вне, так и – что гораздо опаснее – внутри клеток, они разрывают липидный бимолекулярный слой, формирующий эти мембраны.

Для защиты клеток от повреждения при замораживании используют специальные вещества – криопротекторы. Они делятся на две группы: проникающие внутрь клетки, или эндоцеллюлярные (диметилсульфоксид (ДМСО), ацетамид, пропиленгликоль, глицерин, этиленгликоль), и не проникающие или экзоцеллюлярные (полиэтиленгликоли и полиэтиленоксиды, фиколл, сахароза, трегалоза и др.), которые действуют снаружи, осмотически вытягивая из клетки воду.

Наиболее широкое применение нашли глицерин и ДМСО. При добавлении их к воде температура ее замерзания понижается, достигая низшего значения при соотношении примерно 2:1. Эта наиболее низкая температура называется эвтектической, или криогидратной. При дальнейшем же охлаждении таких смесей размеры образующихся кристаллов льда оказываются столь мелкими (сравнимыми с размером кристаллической ячейки), что они не наносят значительных повреждений структурам клеток.

Если бы можно было довести концентрацию криопротектора в живых тканях до эвтектической, это позволило бы полностью решить проблему повреждения тканей ледяными кристаллами. Однако при таких концентрациях любые известные криопротекторы оказываются токсичными.

На практике используют концентрации криопротекторов значительно меньшие, чем эвтектические, – и при этом часть воды все же замерзает. Так при использовании 27%-ного раствора глицерина 40% присутствующей в клетке воды образует с глицерином эвтектическую смесь, остальная же ее часть замерзает. Однако, как показали эксперименты, проведенные в 1954–1960 гг. английским криобиологом Одри Смит, золотистые хомячки способны выживать в ситуации, когда в лед превращалось до 50–60% воды, содержащейся в тканях их головного мозга!

Большое значение для решения проблемы обратимого замораживания имеет скорость охлаждения. При медленном охлаждении (в парах жидкого азота или в специальных программных замораживателях) кристаллы льда образуются в основном в межклеточном пространстве. По мере охлаждения они растут, оттягивая на себя воду из клеток. Как уже было сказано, это позволяет существенно уменьшить повреждения, наносимые кристаллами клеткам, – но и концентрация солей внутри клеток значительно возрастает, повышая риск денатурации белков.

К сожалению, оптимальные скорости понижения температуры, при которых достигается компромисс между повреждающими действиями кристаллов льда и высокими концентрациями растворенных веществ, для разных типов клеток сильно различаются. Различны также и оптимальные для них концентрации криопротекторов. Это сильно затрудняет криосохранение органов и тканей, включающих несколько различных типов клеток, а тем более – целых организмов.

При быстром охлаждении (например, опускании образца в жидкий азот) вода не успевает продиффундировать из клеток наружу; кристаллы образуются как вне, так и внутри клеток, но за счет более быстрого охлаждения они оказываются значительно мельче, чем в первом случае, и успевают образоваться не во всех клетках. Токсичных концентраций солей при этом удается избежать, а продолжительность их воздействия оказывается меньше, как и продолжительность вредного воздействия криопротекторов. Последнее позволяет использовать более высокие их концентрации.

При достаточно быстром охлаждении до 0 °С и несколько ниже вода замерзает (кристаллизуется) не сразу. Сначала образуется переохлажденная жидкость. В упомянутых экспериментах Смит ей в отдельных случаях удавалось охладить золотистых хомячков до –6 °С без образования кристаллов льда. При этом кожа и конечности животных оставались мягкими. А после согревания хомячки оживали без видимых вредных последствий. Беременные самки (если переохлаждение имело место в первой половине срока беременности) приносили нормальных детенышей.

Жидкости в организме начинают замерзать обычно при –1. –3 °С. Однако по мере того, как часть воды превращается в лед, концентрация растворенных веществ в оставшейся жидкости возрастает и температура замерзания этой жидкости продолжает снижаться.

Температура полного замерзания различных биологических жидкостей сильно варьирует, но в любом случае оказывается ниже –22. –24 °С.

Если удастся охладить клетки или ткани до температуры стеклования, они смогут сохраняться в таком состоянии неограниченно долго, а полученные при этом повреждения окажутся несравненно меньше, чем при охлаждении с кристаллизацией. Собственно, это и явилось бы решением проблемы сохранения биологических объектов в состоянии глубокой заморозки. Правда, при оттаивании клеток для их оживления придется снова проходить опасный участок температур.

При охлаждении крупных (по сравнению с клеткой – от 1 мм и больше) объектов внутри них возникают, как правило, значительные градиенты температуры. Сначала замерзают внешние слои, и формируется так называемый фронт кристаллизации, движущийся снаружи внутрь. Концентрация растворенных в воде солей и других веществ перед этим фронтом резко увеличивается. Это приводит к денатурации белков и повреждениям других макромолекул клетки. Другой проблемой оказывается растрескивание тканей. Его причина – неравномерное и неоднородное охлаждение, особенно в ситуации, когда наружные слои затвердевают раньше внутренних.

Еще в 60-е гг. ХХ в. была предложена идея использовать для управления кристаллизацией воды высокое давление. Идея эта основана на понижении температуры фазового перехода вода/лед при повышении давления. При 2045 атм. температура кристаллизации чистой воды составляет –22 °С. Бoльшего снижения температуры замерзания достичь таким образом не удается – при дальнейшем росте давления она начинает вновь повышаться.

Еще в 1967 г. американец М.Д. Персидски и его коллеги поставили эксперименты по замораживанию почек собаки. Исследователи подвергали почки перфузии 15%-ным раствором диметилсульфоксида (перфузия – введение веществ в биологический объект через систему кровеносных сосудов), после чего охлаждали их с одновременным повышением давления, так чтобы в каждый конкретный момент температура не была ниже точки замерзания, соответствующей данному давлению. Когда минимальное значение температуры (в данном случае, благодаря присутствию криопротектора оно составило около –25 °С) было достигнуто, давление снижали.

При быстром снятии давления переохлажденная до такой температуры жидкость может существовать не более нескольких секунд, после чего происходит спонтанная кристаллизация. Но кристаллы, образующиеся при этом, равномерно распределены по объему образца, и фронта кристаллизации не возникает, также как и неравномерного повышения концентрации солей. Кроме того, кристаллы, возникающие в этом случае, имеют малые размеры и зернистую форму и поэтому наносят клеткам сравнительно малые повреждения.

Однако в ходе процесса кристаллизации выделяется значительное количество тепла (скрытая теплота кристаллизации), в результате чего образец нагревается – в конечном счете до температуры кристаллизации, т.е. при снижении давления до атмосферного – примерно до 0 °С. После чего процесс замерзания, естественно, останавливается. В итоге при снятии давления кристаллизоваться успевало всего лишь около 28% воды, а остальная ее часть оставалась жидкой.

При оттаивании цикл повторяли в обратном порядке: почку разогревали до –28 °С, после чего повышали давление до 2000 атм. При этом происходило относительно равномерное по объему таяние ледяных кристаллов. Затем образец постепенно разогревали с одновременным снижением давления.

В дальнейшем техника замораживания при высоком давлении использовалась при подготовке биологических образцов для микроскопических исследований. Для того, чтобы сделать достаточно тонкий срез, образец нужно предварительно перевести в твердое состояние, однако при обычной заморозке структуры клеток при этом повреждаются настолько, что изучать оказывается практически нечего.

Давление в несколько тысяч атмосфер с успехом используется при замораживании продуктов в пищевой промышленности. При этом преследуются две цели. Во-первых, после долгого (а значит, при максимально низкой температуре) хранения вкус замороженного продукта должен как можно меньше отличаться от свежего. Для этого также важно, чтобы при заморозке не были разрушены клетки, что может быть в определенной степени достигнуто замораживанием при давлении около 2 тыс. атм. Другая цель – одновременная стерилизация продукта, которая достигается, напротив, разрушением клеток присутствующих в нем бактерий. Для этого необходимо уже гораздо более высокое давление – в 6 тыс. атм. и больше.

О новых же попытках использовать высокое давление для обратимого сохранения органов или целых организмов авторам неизвестно, а между тем этот путь кажется весьма перспективным. Разумеется, встает вопрос о повреждающем воздействии высокого давления. Известно, что при постепенном его повышении до примерно 500 атм. жизнеспособность клеток не снижается. При 6000 атм. и более практически все клетки погибают, а вот промежуточные значения могут оказывать различный эффект, в зависимости от типа и состояния клеток, содержания в них воды, солей и других веществ, температуры и т. д.

Однако можно рассчитывать, что постепенное повышение давления до необходимых 2 тыс. атм. не приведет к повреждению организма. Ведь в ходе подготовки к заморозке объект сначала охлаждается примерно до 0 °С (если это живое существо – оно перестает дышать) и помещается в заполненную жидкостью камеру. В 1961 г. американский исследователь С.Джейкоб в течение 30 минут подвергал давлению около 1000 атм. сердце собаки, только что вынутое из тела и продолжавшее сокращаться. После снятия давления сердцебиение возобновлялось.

К тому же, как показали эксперименты Смит с золотистыми хомячками, для обратимого криосохранения может оказаться достаточно витрификации всего около 40% воды (и кристаллизации остальной части).

Так что имеющиеся данные вполне позволяют надеяться на использование высоких давлений для управления кристаллизацией свободной воды и криосохранения крупных биологических объектов-органов и даже целых организмов. Работы в этом направлении ведутся в Институте биофизики клетки РАН (Лаборатория криоконсервации генетических ресурсов под руководством Э.Н. Гаховой) совместно с Институтом биомедицинских технологий и ГосНИИ ВТ им. С.А. Векшинского.

Эта статья ведущий раздел не адекватно подвести итог ключевые моменты его содержания. Пожалуйста, подумайте о расширении интереса до предоставить доступный обзор обо всех важных аспектах статьи. ( Июнь 2012 г. )

Криоконсервация или же криоконсервация это процесс, в котором органеллы, клетки, ткани, внеклеточный матрикс, органы, или любые другие биологические конструкции, чувствительные к повреждению, вызванному нерегулируемыми химическая кинетика сохраняются при охлаждении до очень слабого температуры [1] (обычно -80 ° C при использовании твердого углекислый газ или −196 ° C с использованием жидкий азот). При достаточно низких температурах любые ферментативный или химическая активность, которая могла бы вызвать повреждение рассматриваемого биологического материала, эффективно прекращается. Методы криоконсервации стремятся достичь низких температур, не вызывая дополнительных повреждений, вызванных образованием кристаллов льда во время замораживания. Традиционная криоконсервация основана на покрытии замораживаемого материала классом молекул, называемым криопротекторы. Новые методы исследуются из-за присущих токсичность многих криопротекторов. [2] Криоконсервация генетических ресурсов животных делается с целью сохранения породы.

Содержание

Естественная криоконсервация

Морозостойкость, у которых организмы переживают зиму, замораживая твердое тело и прекращая жизненные функции, известен у нескольких позвоночных: пяти видов лягушек (Rana sylvatica, Pseudacris triseriata, Хила крестоцветная, Hyla versicolor, Hyla chrysoscelis), одна из саламандр (Salamandrella keyserlingii), одна из змей (Тамнофис сирталис) и тройка черепах (Chrysemys picta, Террапен каролина, Террапен орната). [3] Щелкающие черепахи Челидра серпентина и настенные ящерицы Podarcis muralis также выдерживают номинальное замораживание, но не было установлено, что он способен к перезимовке. В случае Rana sylvatica один криоконсервант - обычная глюкоза, концентрация которой увеличивается примерно на 19 ммоль / л при медленном охлаждении лягушек. [3]

История

Один из первых теоретиков криоконсервации был Джеймс Лавлок. В 1953 году он предположил, что повреждение красные кровяные тельца во время замораживания произошло из-за осмотический стресс [4] и что увеличение концентрации соли в дегидратирующей ячейке может повредить ее. [5] [6] В середине 1950-х он экспериментировал с криоконсервацией грызунов, определив, что хомяков можно заморозить, если 60% воды в мозгу кристаллизовать в лед без каких-либо побочных эффектов; другие органы оказались подвержены повреждению. [7] Эта работа побудила других ученых попытаться к 1955 году кратковременно заморозить крыс, которые были полностью активны через 4-7 дней после оживления. [8]

Криоконсервация применялась к людям, начиная с 1954 г., после трех беременностей в результате оплодотворения предварительно замороженной спермой. [9] Сперма птицы была криоконсервирована в 1957 году группой ученых из Великобритании под руководством Кристофер Польдж. [10] В 1963 году Петер Мазур на Национальная лаборатория Окриджа в США продемонстрировали, что летального внутриклеточного замораживания можно избежать, если охлаждение будет достаточно медленным, чтобы позволить воде покинуть клетку во время постепенного замораживания внеклеточной жидкости. Эта скорость различается для клеток разного размера и водопроницаемости: типичная скорость охлаждения около 1 ° C / мин подходит для многих клеток млекопитающих после обработки криопротекторами, такими как глицерин или диметилсульфоксид, но эта скорость не является универсальным оптимумом. [11]

Первое человеческое тело, замороженное надеждой на будущее возрождение, было Джеймс Бедфордчерез несколько часов после его смерти от рака в 1967 году. [12] Бедфорд - единственный крионика пациент, замороженный до 1974 г., сохранился до наших дней. [13]

Температура

Предполагается, что хранение при очень низких температурах обеспечивает неопределенный срок службы клеток, хотя фактический эффективный срок службы довольно сложно доказать. Исследователи, экспериментирующие с высушенными семенами, обнаружили, что при хранении образцов при разных температурах наблюдалась заметная вариативность их ухудшения. сверхнизкие температуры. Температуры ниже точка стеклования (Тг) из полиолводные растворы России, около -136 ° C (137 K; -213 ° F), кажется принятым как диапазон, где биологическая активность очень существенно замедляется, и -196 ° C (77 K; -321 ° F) точка кипения жидкий азот, является предпочтительной температурой для хранения важных образцов. Пока холодильники, морозильники и морозильники сверххолодной заморозки используются для многих предметов, как правило, сверххолодный жидкий азот требуется для успешного сохранения более сложных биологических структур, чтобы фактически остановить всю биологическую активность.

Риски

Явления которые могут вызвать повреждение клеток во время криоконсервации, в основном возникают на стадии замораживания и включают: эффекты раствора, внеклеточный образование льда, обезвоживание и внутриклеточный образование льда. Многие из этих эффектов можно уменьшить, криопротекторы.Когда консервированный материал замерзнет, он относительно безопасен от дальнейшего повреждения. [14]

Эффекты решения Поскольку кристаллы льда растут в ледяной воде, растворенные вещества исключаются, что приводит к их концентрации в оставшейся жидкой воде. Высокие концентрации некоторых растворенных веществ могут быть очень опасными. Внеклеточное образование льда Когда ткани охлаждаются медленно, вода мигрирует из клетки и лед образуется во внеклеточном пространстве. Слишком много внеклеточного льда может вызвать механическое повреждение клеточной мембраны из-за раздавливания. Обезвоживание Миграция воды, вызывающая образование внеклеточного льда, также может вызывать клеточную дегидратацию. Связанные с этим напряжения в ячейке могут напрямую вызвать повреждение. Внутриклеточное образование льда Хотя некоторые организмы и ткани может терпеть внеклеточный лед, любой заметный внутриклеточный лед почти всегда фатален для клеток.

Основные методы предотвращения рисков

Основные методы предотвращения повреждений криоконсервации - это хорошо отработанная комбинация контролируемая скорость и медленное замораживание и более новый процесс мгновенного замораживания, известный как стеклование.

Медленное программируемое замораживание

Танк жидкий азот, используется для питания криогенного морозильника (для хранения лабораторных образцов при температуре около -150 ° C)

Смертельного внутриклеточного замораживания можно избежать, если охлаждение будет достаточно медленным, чтобы позволить воде покинуть клетку во время постепенного замораживания внеклеточной жидкости. Чтобы свести к минимуму рост внеклеточных кристаллов льда и перекристаллизацию, [17] биоматериалы Такие как альгинаты, поливиниловый спирт или же хитозан может использоваться для предотвращения роста кристаллов льда вместе с традиционными низкомолекулярными криопротекторами. [2] Эта скорость различается между ячейками разного размера и водой. проницаемость: типичная скорость охлаждения около 1 ° C / мин подходит для многих клеток млекопитающих после обработки криопротекторы Такие как глицерин или же диметилсульфоксид, но скорость не является универсальным оптимумом. Скорость 1 ° C / мин может быть достигнута с помощью таких устройств, как морозильная камера с регулируемой скоростью или переносной настольный морозильный контейнер. [18]

Витрификация

Исследователи Грег Фэхи и Уильям Ф. Ралл помог внедрить витрификацию в криоконсервацию репродуктивной системы в середине 1980-х годов. [19] По состоянию на 2000 год исследователи утверждают, что стеклование обеспечивает преимущества криоконсервации без повреждений из-за образования кристаллов льда. [20] Ситуация усложнилась с развитием тканевой инженерии, так как клетки и биоматериалы должны оставаться незамерзающими, чтобы сохранить высокую жизнеспособность и функции клеток, целостность конструкций и структуру биоматериалов. О витрификации тканеинженерных конструкций впервые сообщила Лилия Кулешова, [21] который также был первым ученым, достигшим витрификации ооциты, в результате чего в 1999 г. родились живые дети. [22] Для клинической криоконсервации витрификация обычно требует добавления криопротекторы перед охлаждением. Криопротекторы - это макромолекулы, добавляемые в замораживающую среду для защиты клеток от пагубного воздействия образования внутриклеточных кристаллов льда или от воздействия раствора во время процесса замораживания и оттаивания. Они позволяют повысить выживаемость клеток во время замораживания, снизить температуру замерзания и защитить клеточную мембрану от повреждений, связанных с замораживанием. Криопротекторы обладают высокой растворимостью, низкой токсичностью при высоких концентрациях, низкой молекулярной массой и способностью взаимодействовать с водой через водородные связи.

Стеклованию воды способствует быстрое охлаждение и может быть достигнуто без криопротекторов путем чрезвычайно быстрого снижения температуры (мегакельвинов в секунду). Скорость, необходимая для достижения стекловидности в чистой воде, считалась невозможной до 2005 года. [23]

Для стеклования обычно требуются два условия: повышение вязкости и снижение температуры замерзания. Многие растворенные вещества обладают и тем, и другим, но более крупные молекулы обычно оказывают большее влияние, особенно на вязкость. Быстрое охлаждение также способствует витрификации.

Согласно установленным методам криоконсервации растворенное вещество должно проникать через клеточную мембрану, чтобы достичь повышенной вязкости и снизить температуру замерзания внутри клетки. Сахара не проникают через мембрану. Те растворенные вещества, которые действуют, например диметилсульфоксид, обычный криопротектор, часто токсичен в высокой концентрации. Один из трудных компромиссов при застекловывании при криоконсервации касается ограничения ущерба, наносимого самим криопротектором из-за токсичности криопротектора. Смеси криопротекторов и использование блокаторов льда позволили Медицина XXI века компания застеклить кролик почка до -135 ° C с их запатентованной смесью для стеклования. После согревания почка была успешно трансплантирована кролику с полной функциональностью и жизнеспособностью, способной поддерживать кролика в качестве единственной функционирующей почки на неопределенный срок. [24]

Персуфляция

Замораживаемые салфетки

Как правило, криоконсервацию легче выполнять для тонких образцов и взвешенных клеток, потому что они могут охлаждаться быстрее и, следовательно, требуют меньших доз токсичный криопротекторы. Таким образом, криоконсервация человека печень и сердца для хранения и пересадить все еще непрактично.

Тем не менее подходящие комбинации криопротекторов и режимов охлаждения и ополаскивания во время нагревания часто позволяют успешно криоконсервировать биологические материалы, особенно суспензии клеток или образцы тонких тканей. Примеры включают:

Сторонники крионики утверждают, что криоконсервация с использованием современных технологий, особенно витрификации мозга, может быть достаточной для сохранения людей в "теоретическая информация"смысл так, чтобы их можно было возродить и объединить с помощью гипотетических чрезвычайно передовых технологий будущего.

Прямо сейчас ученые пытаются понять, жизнеспособна ли трансплантация криоконсервированных человеческих органов для трансплантации, если так, то это будет большим шагом вперед в возможности возрождения криоконсервированного человека. [30]

Эмбрионы

Криоконсервация эмбрионов используется для хранения эмбрионов, например, когда экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) привело к появлению большего количества эмбрионов, чем требуется в настоящее время.

Ткань яичника

Криоконсервация ткани яичников представляет интерес для женщин, которые хотят сохранить свою репродуктивную функцию сверх естественных пределов, или чей репродуктивный потенциал находится под угрозой из-за лечения рака. [34] например, при гематологических злокачественных новообразованиях или раке груди. [35] Процедура заключается в том, чтобы взять часть яичника и произвести медленное замораживание, прежде чем помещать его в жидкий азот на время терапии. Затем ткань может быть разморожена и имплантирована рядом с маточным слоем, либо ортотопическим (в естественном месте), либо гетеротопическим (на брюшной стенке), [35] где он начинает производить новые яйца, обеспечивая нормальное зачатие. [36] Ткань яичника также может быть трансплантирована мышам с ослабленным иммунитетом (Мыши SCID) избежать отторжение трансплантата, а ткань можно собирать позже, когда разовьются зрелые фолликулы. [37]

Ооциты

Криоконсервация человеческих ооцитов - это новая технология, при которой женские яйца (ооциты) извлекаются, замораживаются и хранятся. Позже, когда она будет готова забеременеть, яйца можно разморозить, оплодотворить и перенести в матку в виде эмбрионыС 1999 года, когда Кулешова и ее коллеги сообщили о рождении первого ребенка от эмбриона, полученного из застеклованных, нагретых женских яиц, в журнале Human Reproduction, [21] эта концепция получила признание и широкое распространение. Этот прорыв в достижении витрификации ооцитов женщины сделал важный шаг вперед в наших знаниях и практике процесса ЭКО, поскольку частота клинической беременности после витрификации ооцитов в четыре раза выше, чем после медленного замораживания. [38] Витрификация ооцитов жизненно важна для сохранения фертильности у молодых онкологических пациентов и для людей, подвергающихся ЭКО, которые по религиозным или этическим причинам возражают против практики замораживания эмбрионов.

Сперма

Ткань яичек

Криоконсервация незрелой ткани яичек - это развивающийся метод репродуктивной медицины мальчиков, которым требуется гонадотоксическая терапия. Данные на животных являются многообещающими, поскольку здоровое потомство было получено после трансплантации замороженных суспензий клеток яичка или кусочков ткани. Однако ни один из вариантов восстановления фертильности из замороженной ткани, то есть трансплантации суспензии клеток, трансплантация тканей и созревание in vitro (IVM) пока что доказал свою эффективность и безопасность для людей. [40]

Криоконсервация всего мох растения, особенно Physcomitrella patens, был разработан Ральф Рески и коллеги [41] и выполняется в Международный центр запаса мха. Этот биобанк собирает, сохраняет и раздает мох мутанты и мох экотипы. [42]

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК)

Сохранение микробиологических культур

Грибы

Грибы, особенно зигомицеты, аскомицеты и высшие базидиомицеты, независимо от споруляции, можно хранить в жидком азоте или в условиях глубокой заморозки. Криоконсервация - отличительный метод для грибов, которые не образуют споры (в противном случае можно использовать другие методы консервации спор с меньшими затратами и с легкостью), спорулят, но имеют нежные споры (большие или чувствительные к замораживанию), являются патогенными (опасны для сохранения метаболической активности гриб) или должны использоваться для генетических запасов (в идеале, чтобы иметь такой же состав, как и исходный депозит). Как и в случае со многими другими организмами, такие криопротекторы, как ДМСО или же глицерин (например, нитчатые грибы 10% глицерина или дрожжи 20% глицерина). Различия между выбором криопротекторов зависят от вида (или класса), но обычно для грибков наиболее эффективны проникающие криопротекторы, такие как ДМСО, глицерин или полиэтиленгликоль (другие непроникающие вещества включают сахара, маннит, сорбит, декстран и т. Д.). Повторение замораживания-оттаивания не рекомендуется, так как это может снизить жизнеспособность. Рекомендуются резервные морозильные камеры или места для хранения жидкого азота. Ниже приводится краткое описание нескольких протоколов замораживания (в каждом из них используются полипропиленовые криопробирки с завинчивающейся крышкой): [45]

Бактерии

Многие распространенные культивируемые лабораторные штаммы подвергаются глубокой заморозке для сохранения генетически и фенотипически стабильных долгосрочных запасов. Субкультивирование и длительное хранение образцов в холодильнике может привести к потере плазмиды (ей) или мутациям. Общие конечные процентные содержания глицерина составляют 15, 20 и 25. Из чашки со свежей культурой выбирают одну интересующую колонию и готовят жидкую культуру. Из жидкой культуры среду непосредственно смешивают с равным количеством глицерина; колонию следует проверить на наличие каких-либо дефектов, таких как мутации. Перед длительным хранением все антибиотики необходимо вымыть из культуры. Способы различаются, но перемешивание может осуществляться осторожно путем переворачивания или быстро путем завихрения, а охлаждение может варьироваться путем помещения криопробирки непосредственно при температуре от -50 до -95 ° C, шоковой заморозки в жидком азоте или постепенного охлаждения с последующим хранением при -80 °. C или охладитель (жидкий азот или пар жидкого азота). Извлечение бактерий также может варьироваться, а именно, если гранулы хранятся внутри пробирки, тогда несколько шариков можно использовать для тарелки, или замороженную массу можно соскоблить с помощью петли, а затем высеять, однако, поскольку требуется лишь небольшой запас, вся пробирка должна никогда не размораживать полностью, и следует избегать повторного замораживания-размораживания. 100% восстановление невозможно независимо от методологии. [46] [47] [48]

черви

Микроскопическая почва-жилище нематода круглые черви Панагролаймус детритофагус и Плектус парвус являются единственными эукариотическими организмами, жизнеспособность которых на сегодняшний день доказана после длительного криоконсервации. В данном случае сохранение было естественным, а не искусственным, поскольку вечная мерзлота.

Сохранение разнообразия форм жизни — важнейшая проблема, с которой столкнулось современное человечество. Еще Г. Ф. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Следовательно, сохранение биоразнообразия — один из важнейших механизмов стабильности жизни на Земле. Кроме того, для обеспечения питанием растущей численности населения нашей планеты необходимо выведение новых, более продуктивных сортов сельскохозяйственных растений, а для успешной селекции важен постоянный приток генов из новых источников. Традиционным источником генетического материала служат дикие виды растений. Однако в связи с увеличением числа городов, расширением сельскохозяйственных угодий, вырубкой лесов, ухудшением экологии эти виды постепенно вытесняются, а многие из них находятся на грани вымирания, поэтому их необходимо сохранить.

СПОСОБЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА

Существует несколько способов сохранения генофонда живых организмов: заповедники, национальные парки, зоопарки. Заповедники и национальные парки — наиболее совершенная форма резерватов. Основной недостаток этих формирований состоит в том, что они требуют значительных территорий. Для сохранения 90—95 % существующих видов живых организмов территория заповедников должна занимать около 30 % всей площади суши, отдать которые при современной плотности населения и потребности в сельскохозяйственных угодьях просто невозможно. Зоопарки и питомники требуют меньших территорий. Однако возвратить выращенных там животных в дикую природу удается достаточно редко. В последнее время большое внимание уделяется созданию и развитию новых способов: пересадочных коллекций каллусных клеток, депонированию культур клеток и, наконец, криосохранению, т.е. хранению объектов при очень низкой температуре, обычно это температура жидкого азота (-196 С).

Криосохранение имеет существенные преимущества по сравнению с остальными методами. При сохранении в глубоко замороженном состоянии полностью прекращается обмен веществ, отсутствуют значительные физико-химические молекулярные изменения не только в клетке, но и в окружающей водной среде. Таким образом, сохраняется генофонд, а следовательно, все свойства замороженного объекта.

В 1992 г. в Рио-де-Жанейро большинством государств мира была принята Медународная конвенция по сохранению биологического разнообразия, созданы Национальные программы по сохранению природных генетических ресурсов. Одно из обязательных условий этих программ — создание банков зародышевой плазмы: семян, меристем, пыльцы, зародышей, культур тканей, клеток и другого генетического материала. Такие банки долговременного хранения геномов позволяют:

собирать и сохранять редкие и исчезающие виды;
сохранять морфологическое, физиологическое и адаптационное разнообразие внутривидовой изменчивости по культурным и дикорастущим видам;
служить незаменимыми источниками материала для селекции культурных растений;
обеспечивать размножение редких и исчезающих видов дикорастущих растений и возвращение их в природу;
создавать искусственные популяции и фитоценозы.

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ СЕМЯН РАСТЕНИЙ

Семена всех растений в зависимости от продолжительности их жизни делят на три группы:

микробиотики, сохраняющие жизнеспособность до 3 лет;
мезобиотики — от 3 до 15 лет;
макробиотики — от 15 лет и более.

Для продления жизни семян разработано достаточно много технологий. В первую очередь это касается семян культурных растений. Время их жизни увеличивают благодаря снижению температуры хранения (низкие положительные температуры), снижению влажности окружающей среды, герметизации при хранении, применению искусственных газовых сред и, наконец, криосохранению. Очень важно разработать технологии долговременного хранения семян, относящихся к группе микробиотиков, среди которых немало хозяйственно важных (цитрусовые), декоративных (каштан, гербера) и лекарственных (дуб, каштан) растений.

В настоящее время для продления жизни семян любых растений чаще всего применяют хранение при пониженных температурах:

низкие положительные температуры (4 ± 1 С);
неглубокое замораживание (от -10 до -20 С);
глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 вС или в парах над ним -160 С.

Семена и некоторые другие элементы зародышевой плазы хранят, используя в большей или меньшей степени все три температурных режима, в специализированных банках, сеть которых за последнее время сильно увеличилась. Если в середине 70-х годов XX в. таких банков насчитывалось немногим более 50, то сейчас их более 1300. В банках хранится более 6 млн образцов: 48 % — новые сорта и селекционные линии; 30 % — старые сорта; 15 % — дикорастущие родичи культурных растений и сорные виды. Например, в Швейцарии, в 24 государственных и частных банках сохранено 17 тыс. образцов семян кормовых, плодовых, лекарственных и ароматических растений. Большое внимание сбору и хранению лекарственных растений уделяют в Австрии и Китае. Создаются специализированные банки зародышевой плазы по древесным видам.

Самым дешевым и экологически безопасным было признано хранение семян в шахтах в вечной мерзлоте. Такие эксперименты проводились в Якутске в подземной лаборатории Института мерзлотоведения Сибирского отделения РАН. Хранение в герметичных сосудах в течение трех лет семян пшеницы, ячменя, овса, ржи, овощных растений, кормовых трав при температуре -2,7 С не снижало их жизнеспособности. Однако вечная мерзлота есть не везде, поэтому глубокое замораживание и замораживание до сверхнизких температур (-200 °С и ниже) удобнее всего в техническом отношении. Кроме того, при этих температурах практически прекращаются все метаболитические процессы, что позволяет хранить растительный материал очень долго без существенных изменений. Сейчас изучена всхожесть семян после глубокого замораживания у более чем 400 видов растений, и уже эти результаты показывают, что устойчивость семян к низким и сверхнизким температурам видоспецифична, а также может зависеть от времени и места сбора. Разные растения неодинаково реагируют

на температурный фактор. Только недавно удалось добиться успешного криосохранения семян шести форм наземных и эпифитных тропических орхидей, что открывает возможность создания криобанка сеян этих исчезающих растений (Т. В. Никишина и др., 2001). Криоконсервация семян некоторых культурных бобовых растений рекомендуется для повышения их всхожести. Глубокое замораживание семян вишни и черешни запатентовано как способ их долговременного хранения. Реакция на низкие температуры у представителей семейства лилейных немного различалась: у ландыша после криосохранения увеличивалась частота хромосомных аберраций и снижалась жизнеспособность; у семян растений рода купена жизнеспособность также снижалась, но частота хромосомных аберраций не изменялась. У некоторых растений повышение частоты хромосомных аберраций наблюдалось даже при неглубоком замораживании. Семена таких растений, как жимолость, пиретрум, золотарник обыкновенный, частично погибают при любом замораживании (В. J1. Тихонова, 1999). Поэтому перед внедрением криоконсервации необходимо проводить всесторонние исследования ее всевозможных последствий, так как они могут быть весьма разнообразны.

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ

Сущность метода криосохранения сводится к замораживанию специально подготовленных растительных клеток при использовании криопротекторов — веществ, ослабляющих повреждения клеток при замораживании и оттаивании. В настоящее время известны два метода криосохранения: программное и сверхбыстрое замораживание. Программное замораживание изучалось уже давно, поэтому оно довольно широко применяется для сохранения животных и растительных клеток. Разработка сверхбыстрого замораживания началась сравнительно недавно, однако считается, что именно этот метод со временем станет наиболее перспективным.

Избежать кристаллизации льда помогла бы витрификация воды, т.е. затвердение ее в аморфном состоянии. Получить витрификацию чистой воды практически невозможно. Но в коллоидных растворах скорость образования центров кристаллизации и роста кристаллов льда снижается и повышается температура, при которой их рост прекращается. Все это облегчает витрификацию. Добавление криопротекторов также затрудняет кристаллизацию льда и способствует витрификации.

Наиболее известны такие криопротекторы, как диметилсульфоксид (ДМСО), различные сахара, глицерин, этиленгликоль и их производные. Действие криопротекторов состоит в снижении количества свободной воды, повышении вязкости раствора. Все криопротекторы делят на две группы: проникающие и непроникающие. Это разделение достаточно условно. Так, глицерин — первое вещество, определенное как криопротектор, может проникать в клетку, если его добавлять при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добавлять при температуре 0 С. Принято считать, что непроникающие криопротекторы специфически влияют на мембрану, повышая ее проницаемость. Применение сильных, проникающих в клетку криопротекторов ограничено их токсичностью. Обычно используют смеси криопротекторов, так как в них токсичность одного из веществ снижается за счет присутствия другого.

Жизнеспособность клеток после замораживания зависит не только от предупреждения образования льда, но и от их состояния. Крупные вакуолизированные клетки погибают гораздо чаще, чем мелкие меристемоидные. Поэтому на этапе подготовки культуры к замораживанию ее культивируют в условиях, способствующих образованию мелких клеток и синхронизации их деления. Кроме того, концентрирование клеток в культуре, т. е. увеличение ее плотности, способствует повышению выживаемости клеток после замораживания.

Таким образом, криосохранение достаточно надежно обеспечивает сохранение генофонда. Перспективность этого метода подтверждается возобновлением после хранения в жидком азоте суспензионных культур моркови, явора, кукурузы, риса, сахарного тростника; каллусных культур тополя, маршанции, сахарного тростника; андрогенных эмбриоидов — беладонны, табака и др. Из восстановленных после замораживания культур моркови и табака удалось регенерировать целые растения. После быстрого замораживания сохранили жизнеспособность меристемы земляники, малины, гвоздики, томатов, картофеля и ряда других растений. Однако для криосохранения требуется сложная работа по подбору условий, обеспечивающих выживание клеток и, следовательно, возможность последующей регенерации из них целых растений. Необходимо учитывать генетические и морфофизиологические особенности клеток, способность к закаливанию, уровень проницаемости клеточных мембран, подбор криопротекторов, скорость снижения температуры при замораживании, условия оттаивания.

Процесс, при котором биологическое вещество сохраняется за счет охлаждения до очень низких температур.

Ведущий раздел этой статьи может быть слишком коротким, чтобы адекватно резюмировать ее ключевые моменты . Пожалуйста, рассмотрите возможность расширения лид, чтобы предоставить доступный обзор всех важных аспектов статьи. ( Июнь 2012 г. )

Криоконсервация или криоконсервация - это процесс, при котором органеллы , клетки , ткани , внеклеточный матрикс , органы или любые другие биологические конструкции, чувствительные к повреждению, вызванному нерегулируемой химической кинетикой , сохраняются путем охлаждения до очень низких температур [1] (обычно -80 ° C с использованием твердого диоксида углерода или −196 ° C с использованием жидкого азота ). При достаточно низких температурах любые ферментные или химическая активность, которая может вызвать повреждение рассматриваемого биологического материала, эффективно прекращается. Методы криоконсервации стремятся достичь низких температур, не вызывая дополнительных повреждений, вызванных образованием кристаллов льда во время замораживания. Традиционная криоконсервация основана на покрытии замораживаемого материала классом молекул, называемых криопротекторами . Новые методы исследуются из-за токсичности, присущей многим криопротекторам. [2] Криоконсервация генетических ресурсов животных осуществляется с целью сохранения породы.

СОДЕРЖАНИЕ

Устойчивость к заморозкам , при которой организмы переживают зиму за счет замораживания твердых тел и прекращения жизненных функций, известна у нескольких позвоночных: пяти видов лягушек ( Rana sylvatica , Pseudacris triseriata , Hyla crucifer , Hyla versicolor , Hyla chrysoscelis ), одной из саламандр ( Salamandrella keyserlingii ), одна из змей ( Thamnophis sirtalis ) и три черепахи ( Chrysemys picta , Terrapene carolina , Terrapene ornata ). [3] Щелкающие черепахи Chelydra serpentina и настенные ящерицы Podarcis muralis. также выживают при номинальном замораживании, но не было установлено, что он способен к перезимовке. В случае Rana sylvatica одним из криоконсервантов является обычная глюкоза, концентрация которой увеличивается примерно на 19 ммоль / л при медленном охлаждении лягушек. [3]

Одним из первых теоретиков криоконсервации был Джеймс Лавлок . В 1953 году он предположил, что повреждение красных кровяных телец во время замораживания было вызвано осмотическим стрессом [4] и что увеличение концентрации соли в дегидратирующих клетках может повредить их. [5] [6] В середине 1950-х годов он экспериментировал с криоконсервацией грызунов, определив, что хомяков можно заморозить, если 60% воды в мозгу кристаллизовать в лед без каких-либо побочных эффектов; другие органы чувствительны к повреждениям. [7] Эта работа подтолкнула других ученых к попытке кратковременного замораживания крыс к 1955 году, которые были полностью активны через 4-7 дней после оживления. [8]

Криоконсервация применялась к людям, начиная с 1954 года, после трех беременностей в результате оплодотворения ранее замороженной спермой. [9] Сперма птицы была заморожена в 1957 году группой ученых из Великобритании под руководством Кристофера Полджа . [10] В 1963 году Питер Мазур из Окриджской национальной лаборатории. в США продемонстрировали, что летального внутриклеточного замораживания можно избежать, если охлаждение будет достаточно медленным, чтобы позволить достаточному количеству воды покинуть клетку во время постепенного замораживания внеклеточной жидкости. Эта скорость различается для клеток разного размера и водопроницаемости: типичная скорость охлаждения около 1 ° C / мин подходит для многих клеток млекопитающих после обработки криопротекторами, такими как глицерин или диметилсульфоксид, но эта скорость не является универсальным оптимумом. [11]

Первым человеческим телом, замороженным в надежде на будущее возрождение, было тело Джеймса Бедфорда , через несколько часов после его смерти от рака в 1967 году. [12] Бедфорд - единственный крионический пациент, замороженный до 1974 года, который сохранился до сих пор. [13]

Предполагается, что хранение при очень низких температурах обеспечивает неопределенный срок службы клеток, хотя фактический эффективный срок службы довольно трудно доказать. Исследователи, экспериментирующие с высушенными семенами, обнаружили, что при хранении образцов при разных температурах, даже при сверхнизких температурах , наблюдалась заметная вариативность их ухудшения . Температуры ниже точки стеклования (Tg) водных растворов полиола , около -136 ° C (137 K; -213 ° F), по-видимому, принимаются как диапазон, в котором биологическая активность очень существенно замедляется, и -196 ° C (77 K; -321 ° F), точка кипения жидкого азота , является предпочтительной температурой для хранения важных образцов. Пока холодильники , морозильники и морозильники сверххолодной заморозки используются для многих предметов, как правило, сверххолодный жидкий азот требуется для успешного сохранения более сложных биологических структур, чтобы фактически остановить всю биологическую активность.

Явления, которые могут вызвать повреждение клеток во время криоконсервации, в основном происходят на стадии замораживания и включают эффекты растворения, образование внеклеточного льда, обезвоживание и образование внутриклеточного льда. Многие из этих эффектов можно уменьшить с помощью криопротекторов . После того, как консервированный материал замерзнет, он относительно безопасен от дальнейшего повреждения. [14]

Эффекты решения Поскольку кристаллы льда растут в замерзающей воде, растворенные вещества исключаются, в результате чего они концентрируются в оставшейся жидкой воде. Высокие концентрации некоторых растворенных веществ могут быть очень опасными. Внеклеточное образование льда Когда ткани охлаждаются медленно, вода мигрирует из клеток, и во внеклеточном пространстве образуется лед . Слишком много внеклеточного льда может вызвать механическое повреждение клеточной мембраны из-за раздавливания. Обезвоживание Миграция воды, вызывающая образование внеклеточного льда, также может вызывать клеточное обезвоживание. Связанные с этим напряжения в ячейке могут непосредственно вызвать повреждение. Внутриклеточное образование льда Хотя некоторые организмы и ткани могут терпеть внеклеточный лед, любой заметный внутриклеточный лед почти всегда фатален для клеток.

Основные методы предотвращения повреждений при криоконсервации - это хорошо зарекомендовавшая себя комбинация контролируемой скорости и медленного замораживания, а также новый процесс мгновенного замораживания, известный как витрификация .

Резервуар с жидким азотом , используемый для питания криогенного морозильника (для хранения лабораторных образцов при температуре около -150 ° C)

Смертельного внутриклеточного замораживания можно избежать, если охлаждение будет достаточно медленным, чтобы позволить воде покинуть клетку во время постепенного замораживания внеклеточной жидкости. Чтобы свести к минимуму рост внеклеточных кристаллов льда и перекристаллизацию, [17] биоматериалы, такие как альгинаты , поливиниловый спирт или хитозан, могут использоваться для предотвращения роста кристаллов льда вместе с традиционными низкомолекулярными криопротекторами. [2] Эта скорость различается для клеток разного размера и водопроницаемости : типичная скорость охлаждения около 1 ° C / мин подходит для многих клеток млекопитающих после обработки криопротекторами, такими как глицерин. или диметилсульфоксид , но скорость не является универсальным оптимумом. Скорость 1 ° C / мин может быть достигнута с помощью таких устройств, как морозильная камера с регулируемой скоростью или переносной настольный морозильный контейнер. [18]

Исследователи Грег Фэхи и Уильям Ф. Ралл помогли внедрить витрификацию в репродуктивную криоконсервацию в середине 1980-х годов. [19] По состоянию на 2000 год исследователи утверждают, что стеклование обеспечивает преимущества криоконсервации без повреждений из-за образования кристаллов льда. [20] Ситуация усложнилась с развитием тканевой инженерии, поскольку клетки и биоматериалы должны оставаться незамерзающими, чтобы сохранить высокую жизнеспособность и функции клеток, целостность конструкций и структуру биоматериалов. Впервые о витрификации тканеинженерных конструкций сообщила Лилия Кулешова [21], которая также была первым ученым, добившимся витрификации ооцитов , в результате чего в 1999 г. произошли живорождения [22]. Для клинической криоконсервации витрификация обычно требует добавления криопротекторов перед охлаждением. Криопротекторы - это макромолекулы, добавляемые в среду замораживания для защиты клеток от пагубного воздействия образования внутриклеточных кристаллов льда или от воздействия раствора в процессе замораживания и оттаивания. Они позволяют повысить выживаемость клеток во время замораживания, снизить температуру замерзания и защитить клеточную мембрану от повреждений, связанных с замораживанием. Криопротекторы обладают высокой растворимостью, низкой токсичностью при высоких концентрациях, низкой молекулярной массой и способностью взаимодействовать с водой через водородные связи.

Согласно установленным методам криоконсервации растворенное вещество должно проникать через клеточную мембрану для достижения повышенной вязкости и снижения температуры замерзания внутри клетки. Сахар не проникает через мембрану. Те растворенные вещества, которые это делают, такие как диметилсульфоксид , обычный криопротектор, часто токсичны в высокой концентрации. Один из сложных компромиссов при застекловывании при криоконсервации касается ограничения ущерба, наносимого самим криопротектором из-за токсичности криопротектора. Смеси криопротекторов и блокаторы льда позволили компании Twenty-First Century Medicine витрифицировать почку кролика. до −135 ° C с их запатентованной смесью для стеклования. После согревания почка была успешно трансплантирована кролику с полной функциональностью и жизнеспособностью, способной поддерживать кролика в качестве единственной функционирующей почки на неопределенный срок. [24]

Как правило, криоконсервацию легче проводить для тонких образцов и взвешенных клеток, поскольку они могут охлаждаться быстрее и, следовательно, требуют меньших доз токсичных криопротекторов. Поэтому криоконсервация печени и сердца человека для хранения и трансплантации по-прежнему нецелесообразна.

Тем не менее, подходящие комбинации криопротекторов и режимов охлаждения и ополаскивания во время нагревания часто позволяют успешно криоконсервировать биологические материалы, особенно суспензии клеток или образцы тонких тканей. Примеры включают:

Специальные клетки для переливания, такие как тромбоциты (тромбосомы от Cellphire) . Оптимален при высокой концентрации синтетической сыворотки, ступенчатом уравновешивании и медленном охлаждении. [29] в банке пуповинной крови

Криоконсервация эмбрионов используется для хранения эмбрионов, например, когда в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) было получено больше эмбрионов, чем требуется в настоящее время.

Криоконсервация ткани яичников представляет интерес для женщин, которые хотят сохранить свою репродуктивную функцию сверх естественных пределов или чей репродуктивный потенциал находится под угрозой из-за лечения рака [34], например, при гематологических злокачественных новообразованиях или раке груди. [35] Процедура заключается в том, чтобы взять часть яичника и произвести медленное замораживание, прежде чем помещать его в жидкий азот на время терапии. Затем ткань может быть разморожена и имплантирована рядом с маточным участком, ортотопической (в естественном месте) или гетеротопической (на брюшной стенке) [35], где она начинает производить новые яйца, что позволяет осуществить нормальное зачатие. [36] Ткань яичников также может быть трансплантирована мышам с ослабленным иммунитетом ( мыши SCID ), чтобы избежать отторжения трансплантата , а ткань можно будет забрать позже, когда разовьются зрелые фолликулы. [37]

Криоконсервация человеческих ооцитов - это новая технология, при которой женские яйцеклетки ( ооциты ) извлекаются, замораживаются и хранятся. Позже, когда она будет готова забеременеть, яйца можно разморозить, оплодотворить и перенести в матку в виде эмбрионов . С 1999 года, когда Кулешова и ее коллеги сообщили о рождении первого ребенка от эмбриона, полученного из застеклованных, нагретых женских яиц, в журнале Human Reproduction [21], эта концепция получила признание и широкое распространение. Этот прорыв в достижении витрификации ооцитов женщины сделал важный шаг вперед в наших знаниях и практике процесса ЭКО, поскольку частота клинической беременности после витрификации ооцитов в четыре раза выше, чем после медленного замораживания. [38] Витрификация ооцитов жизненно важна для сохранения фертильности у молодых онкологических пациентов и для людей, подвергающихся ЭКО, которые по религиозным или этическим причинам возражают против практики замораживания эмбрионов.

Криоконсервация незрелой ткани яичек - это развивающийся метод репродуктивной помощи мальчикам, которым необходима гонадотоксическая терапия. Данные на животных являются многообещающими, поскольку после трансплантации замороженных суспензий клеток яичек или кусочков ткани было получено здоровое потомство. Однако ни один из вариантов восстановления фертильности из замороженной ткани, то есть трансплантация клеточной суспензии, трансплантация ткани и созревание in vitro (IVM), пока не доказал свою эффективность и безопасность для людей. [40]

Криоконсервация целых растений мха , особенно Physcomitrella patens , была разработана Ральфом Рески с сотрудниками [41] и проводится в Международном центре запаса мха . Этот биобанк собирает, сохраняет и распространяет мутанты мхов и экотипы мхов . [42]

Грибы, особенно зигомицеты, аскомицеты и высшие базидиомицеты, независимо от споруляции, можно хранить в жидком азоте или в условиях глубокой заморозки. Криоконсервация - отличительный метод для грибов, которые не образуют споры (в противном случае можно использовать другие методы консервации спор с меньшими затратами и с легкостью), спорулят, но имеют нежные споры (большие или чувствительные к замораживанию), являются патогенными (опасны для сохранения метаболической активности. гриб) или должны использоваться для генетических запасов (в идеале, чтобы иметь такой же состав, как и исходное месторождение). Как и в случае со многими другими организмами, криопротекторы, такие как ДМСО или глицерин (например, нитчатые грибы используют 10% глицерина или дрожжи 20% глицерина). Различия между выбором криопротекторов зависят от вида (или класса), но обычно для грибков наиболее эффективны проникающие криопротекторы, такие как ДМСО, глицерин или полиэтиленгликоль (другие непроникающие вещества включают сахара, маннит, сорбит, декстран и т. Д.). Повторение замораживания-оттаивания не рекомендуется, так как это может снизить жизнеспособность. Рекомендуются резервные морозильные камеры или места для хранения жидкого азота. Ниже приводится краткое описание нескольких протоколов замораживания (в каждом используются полипропиленовые криопробирки с завинчивающейся крышкой): [45]

Многие обычные культивируемые лабораторные штаммы подвергаются глубокой заморозке для сохранения генетически и фенотипически стабильных долгосрочных запасов. [46] Субкультивирование и длительное хранение образцов в холодильнике может привести к потере плазмиды (ей) или мутациям. Общие конечные процентные содержания глицерина составляют 15, 20 и 25. Из чашки со свежей культурой выбирают одну интересующую колонию и готовят жидкую культуру. Из жидкой культуры среду непосредственно смешивают с равным количеством глицерина; колонию следует проверить на наличие каких-либо дефектов, таких как мутации. Перед длительным хранением все антибиотики необходимо вымыть из культуры. Способы различаются, но перемешивание может осуществляться осторожно путем переворачивания или быстро путем вихря, а охлаждение может варьироваться путем помещения криопробирки непосредственно при температуре от -50 до -95 ° C, шоковой заморозки в жидком азоте или постепенного охлаждения с последующим хранением при -80 °. C или охладитель (жидкий азот или пар жидкого азота). Восстановление бактерий также может варьироваться,а именно, если гранулы хранятся внутри пробирки, то несколько шариков можно использовать для пластин или замороженный продукт можно соскрести петлей, а затем покрыть пластиной, однако, поскольку требуется лишь небольшой запас, всю пробирку нельзя полностью размораживать и повторно замораживать. - следует избегать оттепели. 100% восстановление невозможно независимо от методологии. [47] [48] [49]

Микроскопические обитающие в почве нематоды круглые черви Panagrolaimus detritophagus и Plectus parvus - единственные эукариотические организмы, жизнеспособность которых на сегодняшний день доказана после длительного криоконсервации. В данном случае сохранение было естественным, а не искусственным из-за вечной мерзлоты .

Было доказано, что некоторые виды животных, в том числе рыбы, земноводные и рептилии, переносят замораживание. Эти виды включают по крайней мере четыре вида лягушек ( Pseudacris crucifer , Hyla versicolor , Pseudacris triseriata , Lithobates sylvaticus ) и несколько видов черепах ( Terrapene carolina , вылупившиеся Chrysemys picta ), ящерицы и змеи устойчивы к замораживанию и имеют развитую адаптацию к выживанию. . В то время как некоторые лягушки впадают в спячку под землей или в воде, температура тела все еще опускается до −5–7 ° C, из-за чего они замерзают. Вуд лягушка (Lithobates sylvaticus) может выдерживать многократное замораживание, во время которого около 65% внеклеточной жидкости превращается в лед. [46]

Читайте также: