История изучения строения биологических мембран реферат

Обновлено: 05.07.2024

Первая модель строения биологических мембран была предложена в 1902 г. Было замечено, что через мембраны лучше всего проникают вещества, хорошо растворимые в липидах, и на основании этого было сделано предположение, что биологические мембраны состоят из тонкого слоя фосфолипидов. На самом деле, на поверхности раздела полярной и неполярной среды (например, воды и воздуха) молекулы фосфолипидов образуют мономолекулярный (одномолекулярный) слой. Их полярные "головы" погружены в полярную среду, а неполярные "хвосты" ориентированы в сторону неполярной среды (рис.2). Поэтому и можно было предположить, что биологические мембраны построены из монослоя липидов.

В 1925 г. Гортер и Грендел показали, что площадь монослоя липидов, экстрагированных из мембран эритроцитов, в два раза больше суммарной площади эритроцитов. Гортер и Грендел экстрагировали липиды из гемолизированных эритроцитов ацетоном, затем выпаривали раствор на поверхности воды и измеряли площадь образовавшейся мономолекулярной пленки липидов. На основании результатов этих исследований была высказана идея, что липиды в мембране располагаются в виде бимолекулярного слоя

Эту гипотезу подтвердили исследования электрических параметров биологических мембран (Коул и Кертис, 1935 г.): высокое электрическое сопротивление ≈ 107 Ом*м2 и большая емкость ~ 0,5*10-2 Ф/м2.

Биологическую мембрану можно рассматривать как электрический конденсатор, в котором пластинами являются электролиты наружного и внутреннего растворов (внеклеточного и цитоплазмы) с погруженными в них головами липидных молекул. Проводники разделены диэлектрическим слоем, образованным неполярной частью липидных молекул - двойным слоем их хвостов. Для плоского конденсатора можно найти расстояние между пластинами, соответствующее толщине липидной части мембраны и ≈3,5 нм. Это как раз соответствует по порядку величины толщине неполярной части бимолекулярного слоя липидов, сложенных определенным образом.

Однако мембрана - это не только липидный бислой. Имелись экспериментальные данные, которые свидетельствовали о том, что биологическая мембрана состоит и из белковых молекул. Например, при измерении поверхностного натяжения клеточных мембран было обнаружено, что измеренные значения коэффициента поверхностного натяжения значительно ближе к коэффициенту поверхностного натяжения на границе раздела белок-вода (около 10-4 Н/м), нежели на границе раздела липид-вода (около 10-2 Н/м). Эти противоречия экспериментальным результатам были устранены Даниели и Девсоном, предложившими в 1935 г. так называемую бутербродную модель строения биологических мембран, которая с некоторыми несущественными изменениями продержалась в мембранологии в течение почти 40 лет. Согласно этой модели мембрана - трехслойная. Она образована двумя расположенными по краям слоями белковых молекул с липидным бислоем посередине; образуется нечто вроде бутерброда: липиды, наподобие масла, между двумя "ломтями" белка (рис.4).

Функции мембраны

Три основные функции биологических мембран:

барьерная- обеспечивает селективный, регулируемый, пассивный и активный обмен веществом с окружающей средой (селективный - значит, избирательный: одни вещества переносятся через биологическую мембрану, другие - нет; регулируемый - проницаемость мембраны для определенных веществ меняется в зависимости от генома и функционального состояния клетки); Т.е. создание биомембраной препятствий для свободного переноса веществ через нее. Для одних агентов БМ является непреодолимым препятствием, другие легко проходят сквозь нее, причем, как правило, только в определенном направлении, как того требуют векторные свойства мембраны.. Мембраны не только отделяют клетки друг от друга, но также разделяют цитоплазму на ряд замкнутых отсеков (компартментов), каждый из которых выполняет свою специфическую задачу.

матричная– обеспечивает определенное взаимное расположение и ориентацию мембранных белков, обеспечивает их оптимальное взаимодействие (например, оптимальное взаимодействие мембранных ферментов);

механическая- обеспечивает прочность и автономность клетки, внутриклеточных структур. Т.е. заключается в поддержании морфологической целостности и относительной автономности как клетки в целом, так и внутриклеточных органоидов. Она основана прежде всего на механических свойствах мембранных структур.

Кроме того, биологические мембраны выполняют и другие функции:

энергетическую- синтез АТФ на внутренних мембранах митохондрий и фотосинтез в мембранах хлоропластов;

генерацию и проведение биопотенциалов;

рецепторную (механическая, акустическая, обонятельная, зрительная, химическая, терморецепция - мембранные процессы) и многие другие функции.

История развитий модели мембраны

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Биологические мембраны (лат. membrana — кожица, оболочка, перепонка) — структуры, ограничивающие клетки (клеточные, или плазматические, мембраны) и внутриклеточные органоиды (мембраны митохондрий, хлоропластов, лизосом, эвдоплазматического ретикулума и др.). Мембраны содержат белки, липиды, углеводы, различные макромолекулы (гликопротеиды, гликолипиды), а также в небольших количествах коферменты, нуклеиновые кислоты, антаоксиданты, неорганические ионы и т. д.

Файлы: 1 файл

Глава I.doc

Глава I. Биологические мембраны. История открытия

Биологические мембраны состоят из нескольких молекулярных слоев, суммарная толщина которых обычно не превышает 10 нм.

Рассмотрим подробнее плазматическую мембрану. ПМ играют важную роль в осуществлении следующих клеточных функций:

механическая — обеспечивают прочность и автономность клетки;
барьерная — благодаря полупроницаемости обеспечивают селективный транспорт и распределение ионов между клеткой и средой;
генерация и проведение возбуждения — содержат каналы, об-менники и насосы, обеспечивающие транспорт ионов;
энергетическая — обеспечивают синтез АТФ в мембранах митохондрий и хлоропластов;
матричная — обеспечивают расположение и ориентацию белков и их взаимодействие;
адгезивная — обеспечивают межклеточные взаимодействия;
двигательная — обеспечивают процесс движения клетки;
секреторная — обеспечивают процесс экзо- и эндоцитоза.

Липиды ПМ подразделяют на фосфолипиды, гликолипиды, холестерин, триглицерол, стероиды и свободные жирные кислоты. Белки ПМ выполняют ряд функций (клеточное узнавание, рецепция, соединение отдельных комплексов и т. д.) и подразделяются на интегральные и периферические. Интегральные белки пронизывают липидный би-слой ПМ и связаны с фосфоинозитидами. Периферические белки локализованы на поверхности ПМ (ферменты; белки, координирующие форму цитоскелета; белки, связанные с гликокаликсом).

Для ПМ клетки характерно явление асимметрии, при котором распределение и состав липидов на цитоплазматической поверхности мембраны отличаются от распределения и состава на экстраклеточной. Явление асимметрии ПМ необходимо для:

поддержания исходной формы клетки;
фиксации белковой ориентации, способствующей максимальному проявлению их активности (фермент, канал);
распознавания антигенов;
регуляции вязкости ПМ;
обеспечения процесса выведения старых клеток.

В настоящее время рассматриваются несколько общих факторов, регулирующих состояние ПМ. К ним относят действие температуры, состав жирных кислот, содержание холестерина, контакт ПМ с цито-скелетом, действие детергентов, анестетиков и гормонов.

Особый интерес представляют данные о наличии в ПМ специализированных областей (доменов). Функциональное значение данных структурных модификаций ПМ заключается в определении различий между апикальной и базолатеральной поверхностями полярных клеток, создании барьеров между апикальной и базолатеральной мембранами, изменении характера процессов рецепции.

1.1. Методы исследования биологических мембран

В соответствии с задачами эксперимента при исследовании мембран применяются следующие методы.

1.1.1. Выделение и характеристика мембранных фракций

Для исследования молекулярного состава и структуры ПМ их выделяют из клеток путем разрушения (гомогенизации) и отделения центрифугированием. Известно, что в зависимости от плотности частицы осаждаются с разной скоростью и при постоянном центробежном ускорении скорость осаждения частиц пропорциональна их массе. Так, при ускорении 6 ООО g осаждаются ядра, затем митохондрии, а при 20 000 — 100 000 g — микросомы (фрагменты мембран ЭР) (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Разделение тканей на субклеточные фракции методом центрифугирования

Для более полного разделения центрифугирование проводят несколько раз. При получении фракций, содержащих в основном мембраны одного типа, субклеточные фракции центрифугируют в градиенте плотности сахарозы или фикола. С целью идентификации и проверки чистоты полученных субклеточных фракций проверяют наличие примесей с помощью светового и электронного микроскопов; анализируют липидный состав или активность маркерных ферментов. В процессе проведения указшшых операций некоторые (возможно, очень важные) компоненты нативиых мембран могут быть утрачены. Поэтому следует обращать внимание на разные виды контроля.

1.1.2. Исследование структурной организации мембран

При изучении структуры мембраны большое значение имеют методы фазово-контрастной микроскопии, основанной на том, что структурные элементы с разными показателями преломления имеют неодинаковую яркость. Различные детали клеток можно, таким образом, дифференцировать, но мембраны при этом не видны, так как световой микроскоп позволяет видеть объекты размером не менее 20 нм, а толщина биомембран, как уже упоминалось, не превышает 10 нм.

Разрешающая способность электронных микроскопов гораздо выше. При длине волны, используемой в электрошюй микроскопии (1—2 нм), можно различать объекты размером 0,5 — 1,0 нм, т. е. даже крупные молекулы. Элекпхмшая микроскопия позволяет связать данные о структуре объекта с результатами химического анализа. Однако этот метод имеет ряд существенных недостатков, которые необходимо учитывать при работе с биологическим материалом. Ведь предварительно исследуемый объект обезвоживают, фиксируют, затем контрастируют солями тяжелых металлов, что может привести к его искажению.

В последнее время в биофизике внедряется динамическая лазерная микроскопия, с помощью которой исследуются изменения формы живых объектов в трехмерном изображении.

Одним из наиболее точных методов исследования структуры молекул, составляющих мембрану клетки, является метод ренттеноструктур-ного анализа, основанный на дифракции рентгеновских лучей. Как правило, это явление наблюдается в тех случаях, когда на пути лучей встречаются препятствия, сравнимые по размеру с длиной волны луча. Если на исследуемый объект направляют параллельный пучок рентгеновских лучей, а за объектом помещают фотопленку, то на ней фиксируется дифракционная картина. На рентгенограмме наблюдается множество пятен (дифракционных максимумов), образующихся в результате интерференции лучей. Анализ рентгенограммы дает сведения о структуре объекта на молекулярном (и даже атомном) уровне. Ценность метода заключается в том, что появляется возможность, во-первых, изучить пространственное расположение молекул, точно измерить расстояние между ними, оценить их внутримолекулярную структуру, во-вторых, определить структуру молекулярных компонентов мембраны в нефиксировашгых клеточных препаратах.

В настоящее время имеются спектры ЯМР многих белков, что делает возможным наблюдение за структурными изменениями, сопровождающими их функционирование, а также изучение состояния воды в биологических мембранах. ЯМР на ядрах 31Р применяют при исследовании структуры и поведения фосфолипидов в модельных и природных мембранах. Достоинство метода заключается в том, что в этом случае получают сведения непосредственно от молекулы конкретного фосфолипида, а не от посредника, как, например, при работе со спиновыми зондами. К недостаткам метода относят то, что ЯМР-спектры сложны и часто плохо разрешимы, кроме того, он имеет относительно малую чувствительность (концентрация образца должна быть не ниже Ю-3 моль/л).

Метод электронного парамагнитного резонанса широко используется для исследований в области молекулярной и клеточной биофизики. Это явление было открыто русским физиком Е. К. Завойским в 1944 г. В дальнейшем оно послужило основой для создания метода спектроскопии ЭПР, который успешно применяют при изучении структуры молекул, содержащих парамагнитные частицы, а также кинетики изменений положения частицы при модификации конфор-мации самой молекулы или ее соседей. В биологических объектах наиболее распространенными парамагнитными частицами являются свободные радикалы и ионы. Парамагнитными бывают ионы переходных металлов — Ре, Со, №, Си, Мп. Метод ЭПР дает возможность наблюдать их окислительно-восстановительные превращения и судить об изменении конформации включающих их комплексов. С помощью ЭПР исследуют также триплетные состояния, возникающие, например, в ходе фотобиологических реакций. Очень большое значение для мем-бранологии имеет использование спиновых зондов и меток, когда в исследуемую систему (в данном случае в мембрану) вводят стабильные свободные радикалы, по изменению характеристик спектров ЭПР которых судят о структурно-динамическом состоянии молекул мембраны.

Результаты, получаемые с помощью метода ЭПР (используются магнитные свойства электронов) и ЯМР (используются магнитные свойства атомных ядер), дают возможность выяснить структурную организацию мембран и их изменения при фужционировании. Кроме того, они дополняют электронно-микроскопические данные об ультраструктурной организации мембран.

При изучении структурной организации мембран применяютс я и многие другие физические методы, например флуоресцентная спектроскопия. Известно, что флуоресценция в клетках сопровождается возникновением электронно-возбужденных состояний, когда электрон переходит из основного состояния в возбужденное. Полученная молекулой энергия может расходоваться в виде тепла или излучаться в виде света. Испускание света осуществляется более длительное время, чем поглощение.

При работе с биологическими объектами, в частности с клеточными мембранами, регистрируют либо собственную флуоресценцию отдельных молекул ПМ, либо флуоресценцию зондов или меток, специально связанных с макромолекулой и введенных в клетку. Различают флуоресцентные зонды, связывающиеся с молекулами мембраны неко-валентно, и флуоресцентные метки, образующие с молекулами мембраны химическую связь. При включении метки или зонда в мембрану их флуоресцентные свойства меняются, что дает информацию о структурных особенностях изучаемой системы.

Для исследования отдельных компонентов мембраны большой интерес представляют методы колебательной спектроскопии: инфракрасная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния.

Кроме описанных выше методов изучения биологических мембран важную роль играет моделирование — формирование искусственных моно- или бислойных липидных мембран и протеолипосом базирующееся на том, что амфипатические молекулы липидов способны образовывать на границе раздела вода — органический растворитель мономолекулярные пленки. В настоящее время широко используются методы получения моно- и бислойных липидных мембран, а также методы формирования замкнутых пузырьков — везикул, липосом (рис. 2.3, 2.4). В такие мембраны, как правило, вводят белки или мелкие фрагменты мембран, выделенных из клетки (протеолипосомы). Так как ли-пидный бислой — обязательный компонент биологической мембраны, результаты, полученные при исследовании физических характеристик модели мембраны и ее проводимости, имеют большое значение для понимания ряда процессов организации и функционирования натив-ных биологических мембран. Возможности такого рода моделирования еще более расширяются при формировании протеолипосом (рис. 2.5).

Плазматическая мембрана — это наиболее постоянная, основная, универсальная для всех клеток субсистема поверхностного аппарата. Главными химическими соединениями, образующими плазматическую мембрану, являются липиды и белки, количественное соотношение которых может варьировать в мембранах разных клеток в довольно широких пределах.

История изучения строения биологических мембран

Билипидная мембрана

В 1925 г. была опубликована работа Гортера и Гренделя, которые экстрагировали из теней эритроцитов липиды и определяли их количество, приходящееся на общую поверхность одного эритроцита. Величина поверхности эритроцита, по данным авторов, оказалась равной 90 мкм 2 , а количество липидов, содержавшееся в тенях эритроцитов, было таково, что его как раз хватало на образование сплошного билипидного слоя площадью 90 мкм 2 . Переисследование этого вопроса современными методами показало, что Гортер и Грендель допустили две ошибки. С помощью примененных ими методов экстракции они смогли извлечь лишь 70% мембранных липидов и, кроме того, неточно определили величину общей поверхности эритроцита: она равна не 90, а 145 мкм 2 . Однако эти довольно грубые ошибки, суммируясь, дали близкий к истине результат, и общая идея о существовании билипидного слоя, высказанная Гортером и Гренделем, оказалась справедливой. По их представлениям в основе организации клеточной мембраны лежит двойной слой липидных молекул, обращенных друг к другу гидрофобными цепями жирных кислот. На внутренней и внешней поверхностях мембраны расположены полярные гидрофильные головки липидных молекул. Идея о наличии липидной фазы, организованной на основе гидрофильных и гидрофобных взаимодействий, сохраняет свое значение до настоящего времени.

Бутербродная модель мембраны

Элементарная биологическая мембрана

Одной из первых универсальных клеточных структур, обнаруженных с помощью электронного микроскопа, оказались трехслойные мембраны толщиной до 10 нм. Они состояли из двух периферических электронно-плотных слоев и более толстого промежуточного светлого слоя.

Обзор

картинка в мраморе: Singer & Nicholson, 1972 [3]

Авторы

Редакторы

Краткая история исследования липидов и биомембран

где M_r — масcа 1 моля триолеина, N_A — число Аводгадро, S_пятна — площадь пятна, V_ложки — объем ложки, ρ_масла — плотность масла. В результате мы получим значение площади S_мол ≈ 1 нм 2 (на молекулу). Несложно оценить и толщину мономолекулярного слоя, равную размеру одной молекулы триолеина, разделив V_ложки на S_пятна — 2,5 нм.

Более ста лет спустя, Чарльз Овертон заметил, что через биомембраны сравнительно легко проникают вещества, хорошо растворимые в липидах, из чего он сделал заключение, что мембрана должна быть образована тонким липидным слоем. Так эксперименты Франклина оказались впереди современных биофизических изысканий. 1925-м годом датируется идея бислойности мембраны: Гортер и Грендель обнаружили, что монослой липидов, выделенных из мембран эритроцитов, ровно вдвое превосходит площадь поверхности самих клеток.

Текучесть липидной фазы мембраны обусловлена присутствием в углеводородных цепях большинства структурных фосфолипидов минимум одной ненасыщенной связи, понижающей температуру плавления липида. Проследить такое фазовое поведение достаточно просто на примере растительного масла и маргарина: первое при комнатной температуре жидкое (содержит жиры, включающие ненасыщенные жирные кислоты, — например, триолеин [T_{плавления} = 5 °C]), второй же, получаемый из растительного масла гидрированием, твердый (двойные связи ацильных цепей насыщены; для соответствующего насыщенного жира — стеарина — T_{плавления} = 55 °C (!)).

В данной статье мы постарались осветить современные представления о биофизике липидных компонентов биологических мембран, и в первую очередь, подробнее остановиться на способности липидов к самоорганизации, которая широко используется клетками в своих нуждах.

Многообразие биомембран

Другая важная особенность эукариот — холестерол (известный также как холестерин), отсутствующий в прокариотических мембранах. Вопреки своей дурной славе у обывателей [12], холестерол играет важнейшую и еще, видимо, не до конца осознанную роль в работе мембран наших клеток (не говоря уже о том, что он является предшественником половых гормонов). Вместе со сфинголипидами (такими как сфингомиелин) холестерол образует рафтовые структуры, придающую эукариотическим мембранам прочность и особую функциональную гетерогенность, о чем подробнее будет сказано ниже.

Из всего сказанного следует, что липидный состав мембран отнюдь не является чем-то выбранным раз и навсегда [15]: он претерпел существенные изменения в процессе эволюции. Даже в разные периоды жизни одного и того же организма состав мембран может существенно варьировать. По всей видимости, липидную организацию мембран эукариот можно считать эволюционно наиболее прогрессивной, поскольку она обеспечивает максимально гибкую адаптацию микроскопического окружения под нужды белковых молекул, создавая частично изолированные области в пределах одной, казалось бы, жидкой фазы. Далее мы остановимся на этих аспектах функционирования гетерогенной эукариотической мембраны подробнее.

Латеральная гетерогенность эукариотических мембран

Основной фосфолипид плазматических мембран эукариот — пальмитоилолеилфосфатидилхолин (ПОФХ) — содержит двойную связь в остатке олеиновой кислоты, и этого уже оказывается достаточно, чтобы температура плавления этого липида снизилась до −3 °C (по сравнению с его полностью насыщенным аналогом — дипальмитоилфосфатидилхолином (ДПФХ), — температура фазового перехода которого составляет 41,5 °C).

Равновесие между L_o/L_d фазами было давно показано на искусственных мембраноподобных системах (например, гигантских везикулах, изготовленных из липидов легочного сурфактанта) (рис. 3б), однако непосредственно в биологической мембране такого разделения (а, значит, и рафтов) пронаблюдать долгое время не удавалось. В чем же дело, если липидный состав искусственных мембран был подобран максимально похожим на мембраны настоящие?

На маленьком липидном плоту

Модель рафтовой гетерогенности показана на рис. 4.

Однако, несмотря на то, что определение рафтам дано, само их существование представлялось до недавнего времени довольно-таки спорным, то есть — не подтвержденным в прямом эксперименте. Как же понимать этот парадокс?

Метод	Что наблюдает	Пространственное / временное разрешение	Пояснение
Спектроскопия скоррелированной флуоресценции (FCS)	Подвижность флуорофора и латеральная гетерогенность	~250 нм / ~1 мкс	Чувствителен к кластеризации; использование нескольких цветов
Флуоресцентно-резонансный перенос энергии (FRET)	Сближенность донора и акцептора	~5–10 нм (расстояние между флуорофорами) / а ) нм / а ) нм /
a — Точность в определении центра изображения

Кластеризация липидов in silico

Рисунок 6. Мозаичная организация поверхности простейшей однокомпонентной мембраны. Слева представлена идеальная модель мембраны, справа — поверхность полноатомной мембраны (ДОФС), раскрашенной по гидрофобности.

Рисунок 7. Предпочтительная локализация трансмембранных пептидов WALP23 в L_d-фазе . Модельная мембрана состоит из липидов ДЛФХ , ДПФХ и холестерола .

Что ограничивает размер рафтов в биомембранах

В реальных экспериментальных системах наблюдается достаточно парадоксальный контраст с искусственными мембранами, разделение фаз L_o/L_d в которых наблюдали неоднократно и при разных условиях. В живой клетке это удалось сделать непосредственно лишь недавно, да и то — используя самые современные технологии субдифракционного наблюдения [21]. В чем же причина такого разительного отличия?

Анализ огромного массива биохимических и биофизических данных относительно липидных доменов в биомембранах, накопившихся за последние 15 лет, привел ученых к выводу, что состав липидного матрикса мембран эволюционно подобран, чтобы при физиологических условиях всегда находиться вблизи фазового перехода (рис. 8). Это способствует образованию в мембранах мезофазы (рафтов), которые, несмотря на свой малый размер и динамическую природу, играют важную (хотя не до конца еще изученную) роль. Какую? Читайте в заключительной части статьи.

Биологическая роль наноразмерных неоднородностей в мембране

Роль такого сложного фазового поведения липидного матрикса мембран еще только предстоит понять в полной мере. Впрочем, сегодня ясно главное — такие свойства позволяют группировать (сортировать) разные белки в частично изолированные области, что позволяет им выполнять предназначенные функции. Также эти свойства определяют то, каким образом мембраны делятся и сливаются, — а это и деление самих клеток, и везикулярный транспорт, и жизненный цикл вирусов, и способность многих токсинов проникать внутрь клеток. Рассмотрим несколько примеров биологической роли рафтов немного более подробно [20]:

Перспективы биофизического изучения мембран

История с изучением липидного матрикса мембран в очередной раз показывает, что живая материя устроена значительно сложнее, чем представлялось ранее, и изобретение новых высокоточных методик наблюдения лишь усугубляет эту сложность.

Словарик

Читайте также: