Ферменты в биотехнологии реферат

Обновлено: 03.07.2024

Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) вне клеток, поэтому их традиционно ши­роко применяют в практике. Биологические катализаторы неток­сичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье (в том числе и отходы), в связи с чем их применение в промышлен­ности выгодно с экономической и экологической точек зрения.

По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из более чем 2000 известных в настоя­щее время ферментов в промышленности используется около 30. Основная часть ферментов, поступающих на мировой рынок, прихо­дится на долю гидролаз, из которых 60 % составляют пептидогидролазы (в основном щелочные и нейтральные протеазы), исполь­зующиеся в качестве детергентов в производстве синтетических мою­щих средств, а 30 % — гликозидазы, применяющиеся в производ­стве кондитерских изделий, фруктовых и овощных соков. Фермен­ты находят применение в текстильной, кожевенной, целлюлозо-бумажной, медицинской, химической промышленности (табл. 4.1).

По прогнозам ученых, основным потребителем ферментов в ближайшем будущем остается пищевая промышленность. Главное место среди этих энзимов занимают глюкоизомераза и глюкоами- лаза, применяющиеся для приготовления обогащенных фрукто­зой кукурузных сиропов и составляющие около 50 % рынка пи­щевых энзиматических препаратов.

Все большее развитие получают технологические процессы с участием сложных энзиматических систем, включающих коферменты. Так, созданы ферментные мембранные реакторы, катали­зирующие непрерывные процессы с регенерацией НАДН (вос­становительное аминирование кетокислот, восстановление а-кетокислот в а-гидроксикислоты). Разработаны системы разделения рацематов посредством стереоспецифического активного транс­порта. Например, мембрана, содержащая гексокиназу и фосфатазу, функционирует как насос, избирательно прокачивающий лишь D-глюкозу. Применение сопряженных ферментативных реакций с участием алкогольоксидазы и катал азы дрожжей Hansenulla polimorpha и формальдегиддисмутазы бактерии Pseudomonas putidaпозволило осуществить окисление метанола в муравьиную кислоту с выхо­дом 88 — 94%. В промышленности большое будущее имеют фер­менты, способные катализировать химические реакции в органи­ческой фазе, в частности липазы. Существенно, что каталитичес­кая активность панкреатической липазы свиньи сохраняется при концентрации воды в реакционной среде, составляющей всего 0,015 %, и при температуре 100 “С. Препараты липазы используют для синтеза оптически чистых сложных эфиров и феромонов, при­меняющихся в парфюмерии и медицине.

Применение ферментов


Для деградации и модификации антропогенных органических соединений, поступающих в окружающую среду, используют фер­менты разных классов и в том числе лакказу, лигниназу, тирозиназу, монооксигеназу, диоксигеназу и др. Перспективна для очи­стки сточных вод новая технология, основанная на использова­нии реакции пластеинообразования, открытой А.Я. Данилевским в 1886 г. Сущность работ Данилевского состоит в эксперименталь­ном доказательстве обращения протеолиза и возможности синтеза белковоподобных веществ (пластеинов) под действием ряда протеолитических ферментов. Сточные воды содержат аминокислоты и пептиды, концентрация которых возрастает в результате гидролиза белковых компонентов отходов под воздействием пептидогидролаз микроорганизмов. Данная технология, активно внедряющаяся во

Франции, нацелена на производство в промышленных масштабах кормовых белков из аминокислот и пептидов сточных вод.

Важнейшую область применения ферментов в медицине со­ставляет энзимодиагностика — тестирование патологии того или иного органа человека по уровню активности фермента или соот­ношению его множественных форм и изоферментов. Так, аспартатаминотрансфераза, изоцитратдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа и альдолаза служат для выявления инфаркта миокарда; аланина- минотрансфераза, аспартатаминотрансфераза и лактатдегидроге­наза — для диагностики заболеваний печени; глутамилтрансфераза — для блокировки отторжения органов при их пересадке и т.д.

Таким образом, производство ферментных препаратов зани­мает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и отно­сится к тем ее отраслям, объем продукции которых постоянно растет, а сфера применения неуклонно расширяется. По объему производства ферментов доминируют страны Западной Европы. Резкий рост этой индустрии наблюдается в США и Японии.

4.2. ИСТОЧНИКИ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты присущи всем живым существам, однако для их выделения используют те природные объекты, в которых содер­жание искомого энзима составляет не менее 1 %. Для крупномас­штабного получения ферментов пригодны только некоторые рас­тительные организмы на определенной фазе их развития (проросшее зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зеленой массы ряда растений), а также отдельные ткани и органы живот­ных (поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочно-ки- шечното тракта, сычуг крупного рогатого скота, семенники по­ловозрелых животных). Практически неограниченный источник ферментов — микроорганизмы (бактерии, грибы, дрожжи), со­держащие набор большинства известных в настоящее время энзи­мов, количество которых можно повысить в десятки и сотни раз методами мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза.

4.3. ТЕХНОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ – ПРОДУЦЕНТОВ ФЕРМЕНТОВ

В зависимости от источника технология получения фермент­ных препаратов имеет свои особенности. При извлечении фер­ментов из растительного сырья и животных тканей технология сводится к экстракции энзимов и очистке их от сопутствующих балластных веществ. Технология ферментных препаратов микробного происхождения более сложная, так как дополнительно вклю­чает этапы культивирования микроорганизмов — продуцентов ферментов, в том числе этапы получения посевного материала и производственной культуры соответствующего микроорганизма.

Для производства посевного материала используют исходный штамм продуцентов, получаемый из лабораторных чистых культур, который выращивают разными способами на предварительно стерилизованной твердой или жидкой питательной среде до определенного возраста. Посевной материал консервируют (высушиванием или хра­нением при низких температурах) вплоть до дальнейшего использования. Производственные культуры продуцента получают, выра­щивая посевной материал микроорганизмов как на поверхности твердых или жидких сред, так и в глубине жидких питательных сред.,

Поверхностный метод выращивания продуцентов, предложенный И.Такамине еще в 1894 г., состоит в культивировании микроорга­низмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей, размещенных в кюветах, к которым иногда добавляют солодовые ростки, древесные опилки, свекловичный жом. Инкубацию микроорганизмов ведут в специальном термостатируемом цехе при постепенном контроле в нем температуры, влажности и подачи воздуха.

В последние 15 лет для выращивания продуцентов ферментов; чаще используют более экономный — глубинный метод культивирования (рис. 4.1). В промышленных условиях для этих целей применяют ферментеры из нержавеющей стали, снабженные приспособлениями для перемешивания и подачи в жидкую питательную среду стерильного воздуха. Сначала ферментер заполняют питательной средой, автоклавируют, а затем засевают чистой культурой, подаваемой из специального генератора. Для предотвращения инфекции в ферментере поддерживают повышенное давление наряду с оптимальными значениями рН, температуры, редокс-потенциала и другими условиями культивирования.


В настоящее время наиболее прогрессивным признан проточ­ный метод культивирования микроорганизмов, который обеспе­чивает непрерывную подачу в ферментер как питательной среды, так и посевного материала. Размножение микроорганизмов и био­синтез фермента регулируют при использовании этого метода по мере поступления питательной смеси в ферментер. Такой фер­ментер представляет собой вращающийся трубкообразный реак­тор, через один конец которого в него поступает питательная среда и культура микроорганизмов, а из другого — выводятся фермен­ты, продукты жизнедеятельности и бактериальная масса. Основ­ное достоинство метода — возможность длительное время под­держивать в автоматическом режиме рост культуры микроорга­низма. Например, культура ацетонобутиловых бактерий находи­лась в таком реакторе в состоянии непрерывного размножения в течение 200 суток (И.Д.Иерусалимский с сотр., 1986).

Важнейшим фактором эффективности технологии ферментных препаратов является качество питательной среды. Основное тре­бование к качеству питательной среды состоит в полноценности ее состава, обеспечивающей рост продуцента и биосинтез целево­го фермента. Микроорганизмы нуждаются прежде всего в соеди­нениях, содержащих углерод, азот, водород и кислород. К ним относятся органические вещества, соли аммония и вода. Кроме того, в состав питательной среды должны быть включены мине­ральные соединения, содержащие Mg, Са, Р, S, Fe, К и другие макро- и микроэлементы, витамины, ростовые вещества (биотин, инозит) и пр. Питательные среды в зависимости от состава делят­ся на синтетические и комплексные. Синтетическими считают те среды, которые состоят из определенного по качественному и коли­чественному составу набора индивидуальных веществ. В комплекс­ные среды входят различные природные продукты, часто отходы пищевых производств. К их числу относятся различные жмыхи, барда спиртовых заводов, картофельная мезга, кукурузный экст­ракт, меласса, отруби и прочие продукты. Благодаря использова­нию отходов комплексные питательные среды доступны, дешевы и обеспечивают безотходность биотехнологических производств.

4.4. ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Выделение и очистка фермента как из культуры микроорга­низма (выращенного любым способом), так и из других природ­ных источников весьма трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенно­го препарата, его не очищают. В промышленности широко приме­няют коммерческие препараты ферментов, чистота которых со­ставляет всего 0,1 % (т.е. 99,9 % составляют примеси). К таким от­раслям относятся спиртовая, кожевенная, текстильная промыш­ленность, а также сельское хозяйство, производство бытовой хи­мии. Например, ферментный препарат, употребляемый в пивова­рении, представляет собой высушенную биомассу плесневых гри­бов. В большинстве отраслей пищевой промышленности, практи­ке научных исследований и особенно в медицине используют толь­ко очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобожденные от балластных веществ и полностью охарактери­зованные в отношении их специфичности и физико-химических свойств. Исходным материалом для получения препаратов фер­ментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты различной степени очистки.

Неочищенные ферментные препараты получают путем высуши­вания в мягком режиме культуры микроорганизмов вместе с остатка­ми питательной среды. Такие препараты получают и путем упаривания экстракта из культуры продуцента, выращенного поверхностным способом, или из фильтрата культуральной жидкости (в случае глубинного выращивания микроорганизмов). Распространен так­же метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быст­ром обезвоживании при температуре не выше -10 °С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. Технические препараты ферментов представляют собой либо высушенные до порошко­образного состояния продукты, либо жидкие концентраты, обычно характеризующиеся 50 %-м содержанием сухой массы веществ.

Для успешного выделения ферментов из клеточного содержи­мого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индиви­дуальные ферменты. Для этого используют специальные мельни­цы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения фермен­тов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют не­большие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обра­батывают их энзимами — лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (ней­тральные значения рН, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений).

Пример, иллюстрирующий получение частично очищенного пре­парата (3-галактозидазы из мутанта Е. coli, представлен на рис. 4.2.


Схема очистки включает отделение клеток микроорганизма по выходе их из ферментера от культуральной жидкости посредством центрифугирования и последующее разрушение клеток в гомоге­низаторе высокого давления. Для освобождения белков от нуклеи­новых кислот полученный гомогенат обрабатывают сульфатом марганца до конечной концентрации этой соли в смеси, равной 0,05 М. Осадок нуклеиновых кислот отделяется с помощью рота­ционной вакуум-фильтрации, а в образовавшийся фильтрат до­бавляют сульфат аммония до 45 % от его насыщения. Возникший осадок белков, содержащий бетта-галактозидазу, собирают с помо­щью центрифугирования или вакуум-фильтрации. Вся процедура очистки энзима от момента подачи бактерий в систему до момен­та получения осадка (3-галактозидазы занимает всего 1 ч.

В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствую­щих ему балластных веществ при получении очищенных препара­тов ферментов комбинируют различные приемы и методы (рис. 4.3), такие, как термическое фракционирование, осаждение органи­ческими растворителями, солями и тяжелыми металлами, фильт­рация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография, элек­трофорез, изоэлектрофокусирование.

На заключительных этапах очистки часто используют аффин­ную хроматографию (биоспецифическая хроматография, хромато­графия по сродству), которая основана на способности фермен­тов избирательно связывать те или иные лиганды — субстраты, коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффек­торы и т.п. Такое связывание весьма специфично (Кs -4 М), что позволяет выделить тот или иной энзим из множества других бел­ков. Например, из желудочного сока человека методом одноэтапной аффинной хроматографии выделена кислая липаза, исполь­зующаяся в заместительной терапии при заболеваниях печени.

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфич­ности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) при­соединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрицей лиганд присоединяют к носителю через про­межуточное звено (вставку, ножку, спейсер). Присоединение лигандов к поперечносшитой агарозе — сефарозе обычно проводят, активируя ее бромцианом (см. с. 91). Связывание с сефарозой, ак­тивированной бромцианом, л-амино-бензилянтарной кислотой, используемой в качестве лиганда, обеспечивает взаимодействие сорбента с каталитическим центром только карбоксипептидаз бла­годаря сходству лиганда с субстратами карбоксипептидазы:



Сорбенты, содержащие цибакрон голубой и некоторые другие красители антрахинонового ряда, используют для аффинной хромато­графии НАД-зависимых дегидрогеназ, а носители, имеющие цикло- пептидный антибиотик грамицидин, — для протеолитических фер­ментов:


Таблица 4.2 Схема очистки глюкоамилазы из культуры Endomycopsisssp. 20-9 (по И.М.Грачевой, 1987)


В процессе выделения повышается доля фермента в массе тоталь­ных белков, т.е. увеличивается его удельная активность. В табл. 4.2 представлены данные, характеризующие процедуру очистки от сопутствующих ферментов и балластных белков глюкоамилазы из культуры Endomycopsis ssp. 20-9. Анализ таблицы показывает, что чистота глюкоамилазы в препарате возросла в 37 раз и в получен­ном препарате отсутствует активность двух ферментов углеводно­го обмена — гликозилтрансферазы и а-амилазы.

В производственных условиях активность получаемого фермент­ного препарата оценивается количеством субстрата, преобразо­ванного 1 мг (1кг) препарата при оптимальных условиях за 1 мин, и измеряется в Е/мг, моль/мг или каталах/кг белка.

Очищенные ферментные препараты хранят при низкой темпе­ратуре (до -80 °С). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. Ферментные препараты для промышленного применения стабилизируют, добавляя глицерин, моносахариды, дисахариды (глюкоза, сахароза, лактоза), HS-co- единения (цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, дитиотреитол и др.), отдельные аминокислоты, желатину и другие белки-напол­нители.

Существенно, что из 2003 включенных в список известных в настоящее время ферментов более 1500 выделено и в той или иной степени очищено; это служит не только базой для изучения физи­ко-химических основ ферментативного катализа, но и фундамен­том для совершенствования химического производства и промыш­ленности.

4.5. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ, ЕЕ ЗАДАЧИ

Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использова­ния. Принципиально новые перспективы открылись перед при­кладной энзимологией в 60-е годы XX в. в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли — инженерной энзи­мологии. Ее задачи заключаются в развитии прогрессивных мето­дов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужными свойствами и разра­ботке научных основ их применения.

В частности, методами белковой инженерии, сущность кото­рых состоит в изменении первичной структуры природной моле­кулы фермента посредством химической модификации самого; энзима или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра и его функцию, модулировать суб­стратную специфичность и физико-химические свойства фермен­та. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малатдегидрогеназу. Описанным способом получены термостабильные формы лизоцима Т-4 и субтилизина (каталитическая константа субтилизина изменена в 100 раз), созданы гибридные формы фер­ментной системы, ценной в иммуноферментном анализе, сочета­ющие в себе свойства бета-галактозидазы и бета-галактокиназы.

Многие проблемы технологии синтеза органических соедине­ний, пищевой и медицинской промышленности, мониторинга че­ловека и окружающей среды, защиты окружающей среды, энер­гетики не могут быть решены без использования методов совре­менной инженерной энзимологии.

Важным этапом развития инженерной энзимологии стала раз­работка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.

Читайте также: