Биолюминесценция реферат по биологии
Обновлено: 30.06.2024
Биолюминесценция (греч. βioç жизнь и лат. lumen — свет) —
способность живых организмов
светиться за счет собственных
белков или с помощью
симбиотическихбактерий.
Сегодня известно около 800 видов светящихся живых существ. Большинство из
них обитают в море. Это бактерии, одноклеточные жгутиконосные водоросли,
радиолярии, грибы, планктонные иприкрепленные кишечнополостные,
сифонофоры, морские перья, гребневики, иглокожие, черви, моллюски,
ракообразные, рыбы.
Брюхоногий моллюск Bullina
lineata
В море светятся и бактерии, в основномродов Photobacterium и
Vibrio, и многоклеточные планктонные организмы
На уровне микромира очень слабое свечение, которое мы можем
зарегистрировать только с помощью высокочувствительных фотометров,
— этопобочный эффект нейтрализации ферментами активных форм
кислорода, необходимых, но токсичных для клеток, — участников
процесса окисления глюкозы. Они же поставляют энергию, необходимую
для хемилюминесценции,различным люминофорным белкам.
Хемилюминесценция в
природе
У бактерий люминофорные белки рассеяны по всей клетке, у одноклеточных
эукариотических (имеющих клеточное ядро)организмов они находятся в
окруженных мембраной пузырьках в цитоплазме. У многоклеточных
животных свет обычно излучают специальные клетки — фотоциты, часто
сгруппированные в особые органы — фотофоры. Кромевнутриклеточного, у
глубоководных креветок, осьминогов, каракатиц и кальмаров встречается
свечение секреторного типа: смесь продуктов секреции двух разных желез
выбрасывается из мантии или из-под панциряи расплывается в воде как
сияющее облако, ослепляя противника.
Другой классический пример биолюминесценции — древесные гнилушки.
Светится в них не само дерево, а мицелий обыкновенного опенка. А увысших грибов рода Mycena, тоже растущих на гниющем дереве, но в
теплых краях вроде Бразилии и Японии, светятся плодовые тела — то, что
обычно называют грибами (хотя.
Функция "чтения" служит для ознакомления с работой. Разметка, таблицы и картинки документа могут отображаться неверно или не в полном объёме!
Биолюминесценция
Биолюминесценция, видимое свечение некоторых живых организмов. Биолюминесценция – результат биохимической реакции, в которой химическая энергия возбуждает специфическую молекулу и та излучает свет.
Происхождение. Особенностью биолюминесцентных систем является то, что они не закреплялись в филогенезе (т.е. эволюционно). Большинство из них возникло у разных животных независимо, и потому они сильно различаются как с биологической, так и с химической точки зрения. Таким образом, в противоположность многим структурным белкам и ферментам (таким, как гистоны, цитохромы или мышечные белки), сходным у филогенетически далеких форм, субстраты и ферменты биолюминесцентных систем у разных животных, способных к светоизлучению, совершенно различны.
Известно по крайней мере 30 случаев возникновения биолюминесценции в процессе эволюции. И хотя каждая из биолюминесцентных систем формировалась самостоятельно, имеются примеры сходства между ними. Некоторые из таких примеров могут объясняться общностью факторов питания, другие – латеральным переносом генов или конвергенцией (совпадением) независимо развившихся признаков.
Физика и химия. Некоторые физические и химические особенности являются общими для всех биолюминесцентных реакций. Излучаемый свет не зависит от света или другой энергии, непосредственно поглощаемой организмом. Он также не связан с термическим возбуждением при высокой температуре.
Биолюминесценция – это хемилюминесцентная реакция, в которой химическая энергия превращается в световую. В ходе реакции субстрат (люциферин) окисляется под действием фермента (люциферазы). Люциферины и люциферазы у разных организмов химически различаются, однако все хемилюминесцентные реакции требуют молекулярного кислорода и протекают с образованием промежуточных комплексов – органических пероксидных соединений. При распаде этих комплексов высвобождается энергия, возбуждающая молекулы вещества, ответственного за светоизлучение.
От энергии светового кванта (фотона) зависит частота испускаемого света (т.е. его цвет). Поскольку люциферины у животных разные, излучаемый свет варьирует от синего (у морских водорослей динофлагеллат) до зеленого (у медузы), желтого (у светляков) и красного (у личинки южно-американского жука Phrixothrix). Соответствующие этим цветам энергии фотонов составляют от 70 (для голубого света) до 40 (для красного) килокалорий (ккал) на 1 эйнштейн (61023 фотонов). Такая энергия, высвобождаемая одноактно, значительно превышает энергию большинства биохимических реакций, в том числе распад высокоэнергетической молекулы аденозинтрифосфата (АТФ, 7 ккал).
Организмы, светоизлучение и биохимия. Люминесценция встречается у эволюционно разнородных групп организмов, в том числе у некоторых бактерий, грибов, водорослей, кишечнополостных, червей, моллюсков, насекомых и даже рыб, но не наблюдается у более высокоорганизованных животных. Проявление и регуляторные механизмы люминесценции у этих организмов разнятся, как различны по характеру и фотофоры (структуры) и фотоциты (клеточные типы), ответственные за эти процессы. Существует 30 типов биолюминесцентных систем, из них детально изучены менее десяти. Пять таких типов описаны ниже.
Обзор
Сибирский биолюминесцентный червь Fridericia heliota и структура люциферина F. heliota
Авторы
Редакторы
Рисунок 1. Многообразие биолюминесцентных организмов
Особенность биолюминесцентных систем в том, что они не закреплялись эволюционно, а формировались в каждом случае независимо. Известно около 30 различных механизмов, обеспечивающих свечение [1]. В отличие от многих структурных белков и ферментов (гистонов, цитохромов, мышечных белков), сходных у филогенетически далеких форм, компоненты биолюминесцентных систем у родственных животных могут быть различны. Считается, что биолюминесценция впервые возникла на стадии перехода от анаэробных форм жизни к аэробным, хотя общего мнения по этому вопросу нет [2].
Сущность явления
От суеверных страхов к знанию
О загадочном свечении морских вод, рыб и некоторых грибов писал еще Аристотель (384–322 гг. до н.э.). Мореплаватели приписывали этому явлению мистические свойства, считая его источником огонь из преисподней. Однако если в начале нашей эры свечение моря пытались объяснить эффектом бомбардировки частиц воды солью (по аналогии с искрой из-под кремня, ударяющего о сталь), а свечение рыб — содержащимся в их чешуе фосфором, то сегодня эти предположения могут вызвать лишь снисходительную улыбку.
Научные основы биолюминесценции заложил Роберт Бойль (1627–1691), знаменитый и известный всем со школьной скамьи (закон Бойля—Мариотта) английский физик, один из учредителей Лондонского королевского общества. Он показал абсурдность предрассудков и суеверий, порожденных этим явлением, обнаружив его сходство с горением — простой химической реакцией, которая прекращается в отсутствие кислорода. Откачивая воздух из сосуда с куском светящегося (из-за грибов) дерева, он наблюдал, как излучение, постепенно ослабевая, исчезает совсем, но возобновляется, когда в сосуд опять попадает кислород. Изучение механизмов органического свечения продолжил Рафаэль Дюбуа (1849–1929). Из экстрактов люминесцирующих жуков Pyrophorus он выделил две фракции, ответственные за возникновение света в присутствии кислорода. Белковую составляющую, которая теряла активность при нагревании (как ферменты), он назвал люциферазой, а термоустойчивую низкомолекулярную — люциферином.
С тех пор было сделано множество открытий, связанных с природой биолюминесценции. Однако в 2006 г. нобелевский лауреат Осаму Шимомура [4], посвятивший более 50 лет своей жизни исследованию этого завораживающего явления, с сожалением отметил, что значительный прогресс, достигнутый в этой области, сменился упадком [1]. На сегодняшний день известны структуры только семи природных люциферинов. Если в третьей четверти XX в. были определены пять из них, то в последней четверти — только два. К тому же последняя структура нового люциферина из динофлагеллят (простейших организмов, составляющих значительную часть морского планктона и светящихся от движения водных масс) была охарактеризована уже четверть века назад [5].
Долгожданный прорыв
Недавно в таежных районах юга Красноярского края был открыт новый люминесцирующий вид кольчатых червей семейства энхитреид. Один из авторов этой статьи (В.Н. Петушков), специалист по люминесценции бактерий, еще студентом, работая ночью на биостанции Красноярского университета, заметил, что его следы на земле светятся. Источником голубоватого излучения оказались мелкие черви. Тогда эта находка не показалась важной, и о сибирских светящихся червях забыли на много лет. А в конце 1980-х годов В.Н. Петушков с коллегой Н.С. Родионовой вернулся на биостанцию, чтобы попытаться определить вид этих существ. Выяснилось, что миру они неизвестны. С помощью Н.Т. Залесской, специалиста по беспозвоночным из московского Института проблем эволюционной морфологиии и экологии животных им. А.Н. Северцова РАН, было сделано первое краткое описание нового вида олигохет, названного Fridericia heliota (рис. 2) [6].
Рисунок 2. Свечение червя Fridericia heliota
фото А.А. Семенова
Небольшие (длина взрослой особи 15–20 мм, диаметр 0.5 мм, масса 2 мг) бело-желтые черви F. heliota живут в лесных сибирских почвах. Они испускают зеленовато-голубой свет (максимум спектра излучения приходится на 478 нм), который после механического, химического или электрического раздражения постепенно, в течение примерно 10 минут, затухает. Светящиеся точки расположены на теле червя, а целомическая жидкость (заполняющая вторичную полость тела) не излучает. Считалось, что люминесценция всех земляных червей имеет единый характер. 12 видов из шести родов олигохет (Diplocardia, Diplotrema, Fletcherodrilus, Octochaetus, Pontodrilus и Spenceriella) выделяют целомическую жидкость, в клетках которой содержится биолюминесцентная система, включающая перекись водорода [7]. Наиболее полно механизм свечения изучен у крупных (длина около 60 см, масса 7 г) червей Diplocardia longa, обитающих в песчаных почвах на юге штата Джорджии (США). Люциферин D.longa, алифатический альдегид N-изовалерил-З-амино-1-пропаналь, служит субстратом для люцифераз всех других светящихся олигохет. Более того, люцифераза D. longa активна в кросс-реакциях (когда два взаимодействующих вещества берут от двух разных видов животных) с люциферинами других червей [8]. Но сибирский червь F. heliota оказался уникальным — кросс-реакции с люциферинами и люциферазами любых других организмов дали отрицательный результат. Это подразумевало, что механизм биолюминесценции у F. heliota и других видов отличается. В 2003 г. совместно с итальянским специалистом по систематике червей Э. Рота было опубликовано подробное описание светящегося червя из сибирской тайги [9].
Трудный путь к свету
В 2003–2007 гг. группа Петушкова провела первые исследования свойств биолюминесцентной системы F. heliota и выявила ее необходимые компоненты — новые люциферин и люциферазу, кислород, АТФ и ионы магния. Люциферин и люциферазу очистили, получили ультрафиолетовый спектр (зависимость поглощения от длины волны в ультрафиолетовом диапазоне) люциферина, исследовали рН- и температурную зависимости скорости реакции in vitro, влияние на нее солей и детергентов [10–12]. Эта работа требовала непрерывного поступления биомассы червей, которых ежегодно с тоннами земли в летне-осенний период и днем, и ночью добывали в лесах. В 2011 г. Шимомура возглавил новую лабораторию биолюминесцентных биотехнологий в Сибирском федеральном университете, и работы по изучению механизма испускания света F. heliota продолжились.
Чтобы установить структуру природного вещества, сначала его надо выделить в чистом виде. С люциферином F. heliota возникли серьезные затруднения из-за ограниченности биомассы червей (ручной сбор давал около 30 г в год, а в лабораторных условиях эти черви не хотят размножаться) и низкого содержания люциферина (приблизительно 0.1 мкг на 1 г необработанной биомассы) [12]. Ценой огромных усилий группе Петушкова за несколько лет из 90 г биомассы червей удалось выделить всего 5 мкг люциферина. Помимо него, экстракт F. heliota содержал несколько соединений неустановленного состава, которые похожи на люциферин по своим спектральным и хроматографическим свойствам. Они флуоресцируют так же, как и настоящий люциферин, но им самим не являются. Петушков предположил, что эти соединения — неактивные аналоги люциферина (его предшественники или продукты деградации). Значит, они должны иметь схожую с люциферином структуру. Одним из основных компонентов экстракта червя (его содержание в 30 раз больше, чем люциферина) было соединение, названное CompX. Выделенного количества (около 150 мкг) вполне хватило, чтобы получить всю информацию о его структуре [13].
Основной метод определения состава и строения вещества в современной органической химии — спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [14]. Его важный частный случай — протонный магнитный резонанс. Ядро атома водорода, 1 Н, во внешнем магнитном поле может находиться в двух энергетических состояниях: его собственный магнитный момент (важно, что он ненулевой) может ориентироваться по направлению поля и против него. Переход с нижнего энергетического уровня на верхний сопровождается поглощением энергии (ΔE = hn, где E, h и n — энергия, постоянная Планка и частота излучения соответственно), которое регистрируется ЯМР-спектрометром. Ампулу с растворенным исследуемым веществом помещают в сильное магнитное поле и подвергают воздействию импульсов радиочастотного излучения. При определенных частотах протоны резонируют — частота импульса оказывается равной частоте переходов между энергетическими уровнями. При возникновении таких переходов образцом поглощается энергия внешнего поля. Частота ЯМР зависит от напряженности магнитного поля, а при заданном его значении — от магнитного момента исследуемого типа ядер. Однако частота резонанса для ядер одного химического элемента чрезвычайно чувствительна к их химическому окружению. Электронные оболочки атомов и молекул реагируют на внешнее магнитное поле, частично экранируя его, что приводит к изменению частоты резонанса — химическому сдвигу. Его величина зависит от окружения исследуемого ядра, взаимного расположения соседних атомов в пространстве, связи между ними. Часто в образце содержится несколько типов молекул, или в сложных органических молекулах резонирующие ядра находятся в разных атомных группах. Тогда даже для похожих атомов в близком окружении спектр ЯМР покажет разные сигналы, если атомы химически различны. Положение сигнала в спектре характеризует строение атомных групп, окружающих исследуемое ядро, а соотношение амплитуд пиков дает информацию об относительном количестве ядер с разным химическим окружением. Более того, из-за взаимодействия магнитных моментов разных ядер сигнал резонансного поглощения каждого из них может представлять собой сложный мультиплет (эффект спин-спинового взаимодействия), число и интенсивность компонент которого тоже однозначно связаны со строением молекулы исследуемого вещества. Так, спектр ЯМР позволяет расшифровать химическое строение и структуру сложнейших органических соединений.
Итак, по данным ЯМР- и масс-спектроскопии (метода исследования вещества, требующего его ионизации и основанного на определении соотношения массы и заряда образующихся ионов) М.А. Дубинный и К.Д. Надеждин из Института биоорганической химии предложили структуру соединения CompX. Оно оказалось необычным (такой молекулы в природе еще не находили) производным аминокислоты тирозина, получаемым в результате трех модификаций: дезаминирования до кетокислоты, метилирования енола и карбоксилирования ароматического кольца. Для установления конфигурации двойной связи А.С. Царькова и М.С. Баранов (из ИБХ) синтезировали и сравнили спектральные данные обоих изомеров (рис. 3). Z-изомер оказался идентичен природному образцу. Тогда как E-изомер обладал значимо отличными спектральными свойствами, в том числе отсутствием флуоресценции.
Z от нем. zusammen — вместе; когда старшие заместители у каждого из атомов углерода, образующих двойную связь, расположены по одну сторону от нее.
E от нем. entgegen — против; старшие заместители у атомов углерода из пары — по разные стороны от двойной связи.
Рисунок 3. Структуры CompX (а) и его неприродного изомера (б)
Рисунок 4. Структуры четырех пептидных изомеров люциферина F. heliota
Чтобы выяснить, какой из четырех пептидных изомеров отражает строение люциферина, пришлось провести их полный синтез, а затем сравнить ЯМР-спектры синтетических и природного соединений. Из четырех синтезированных только вещество 1 (рис. 4) по всем спектральным характеристикам оказалось идентичным природному люциферину (рис. 5). И только оно обладало способностью испускать свет при добавлении белкового экстракта F. heliota в присутствии АТФ и MgSO4 (рис. 6). Более того, спектр люминесценции и зависимость интенсивности свечения от концентрации вещества у синтетического и природного люциферинов были идентичны [16].
Рисунок 5. Спектры люминесценции червей F. heliota in vivo, природного и синтетического люциферинов
Рисунок 6. Люминесценция синтетического люциферина в присутствии экстракта червей F. heliota, АТФ, кислорода O2 и ионов магния Mg 2+
Открытие и расшифровка структуры компонента новой биолюминесцентной системы помимо чисто научного имеет и важное прикладное значение. Явление биолюминесценции очень широко применяется. Светящиеся метки используют для проведения анализов в медицине и фармацевтике, в лабораторных исследованиях — для визуализации различных физиологических процессов и активности генов, измерения концентрации АТФ. В экологии биолюминесценцию применяют для мониторинга окружающей среды. В тест-системах для поиска лекарств люциферин-люциферазные системы служат своего рода лампочкой, помогающей определить, есть ли в электрической цепи напряжение. Люциферин Fridericia heliota непременно займет свою нишу в прикладной биолюминесценции. Он прост в химическом синтезе, исключительно стабилен в течение месяцев (а не часов, как самый используемый сегодня люциферин — светлячковый) и нетоксичен (в отличие от люциферина бактерий).
Авторы
Илья Викторович Ямпольский, кандидат химических наук, старший научный сотрудник Института биоорганической химии (ИБХ) им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Область научных исследований —установление структур и механизмов биосинтеза природных соединений, их полный синтез и применение.
Александра Сергеевна Царькова, младший научный сотрудник того же института. Область научных интересов — органический синтез.
Максим Анатольевич Дубинный, кандидат физико-математических наук, научный сотрудник того же института. Занимается биомолекулярной спектроскопией ядерного магнитного резонанса.
Валентин Николаевич Петушков, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института биофизики (ИБФ) Сибирского отделения РАН. Научные интересы связаны с биохимией, фотобиологией, изучением новых биолюминесцентных систем.
Наталья Сергеевна Родионова, кандидат биологических наук, научный сотрудник того же института. Специализируется на изучении биолюминесцентных систем.
Илья Викторович Ямпольский — кандидат химических наук, старший научный сотрудник Института биоорганической химии (ИБХ) им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. Область научных интересов — установление структур и механизмов биосинтеза природных соединений, их полный синтез и применение.
Александра Сергеевна Царькова — младший научный сотрудник того же института. Область научных исследований — органический синтез.
Максим Анатольевич Дубинный — кандидат физико-математических наук, научный сотрудник того же института. Занимается биомолекулярной спектроскопией ядерного магнитного резонанса.
Валентин Николаевич Петушков — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института биофизики (ИБФ) Сибирского отделения РАН. Научные интересы связаны с биохимией, фотобиологией, изучением новых биолюминесцентных систем.
Наталья Сергеевна Родионова — кандидат биологических наук, научный сотрудник того же института. Специализируется на изучении биолюминесцентных систем.
Многообразие биолюминесцентных организмов [1]
Особенность биолюминесцентных систем в том, что они не закреплялись эволюционно, а формировались в каждом случае независимо. Известно около 30 различных механизмов, обеспечивающих свечение [2]. В отличие от многих структурных белков и ферментов (гистонов, цитохромов, мышечных белков), сходных у филогенетически далеких форм, компоненты биолюминесцентных систем у родственных животных могут быть различны. Считается, что биолюминесценция впервые возникла на стадии перехода от анаэробных форм жизни к аэробным, хотя общего мнения по этому вопросу нет * .
Сущность явления
От суеверных страхов к знанию
О загадочном свечении морских вод, рыб и некоторых грибов писал еще Аристотель (384–322 гг. до н. э.). Мореплаватели приписывали этому явлению мистические свойства, считая его источником огонь из преисподней. Однако если в начале нашей эры свечение моря пытались объяснить эффектом бомбардировки частиц воды солью (по аналогии с искрой из-под кремня, ударяющего о сталь), а свечение рыб — содержащимся в их чешуе фосфором, то сегодня эти предположения могут вызвать лишь снисходительную улыбку.
Научные основы биолюминесценции заложил Роберт Бойль (1627–1691), знаменитый и известный всем со школьной скамьи (закон Бойля — Мариотта) английский физик, один из учредителей Лондонского королевского общества. Он показал абсурдность предрассудков и суеверий, порожденных этим явлением, обнаружив его сходство с горением — простой химической реакцией, которая прекращается в отсутствие кислорода. Откачивая воздух из сосуда с куском светящегося (из-за грибов) дерева, он наблюдал, как излучение, постепенно ослабевая, исчезает совсем, но возобновляется, когда в сосуд опять попадает кислород. Изучение механизмов органического свечения продолжил Рафаэль Дюбуа (1849–1929). Из экстрактов люминесцирующих жуков Pyrophorus он выделил две фракции, ответственные за возникновение света в присутствии кислорода. Белковую составляющую, которая теряла активность при нагревании (как ферменты), он назвал люциферазой, а термоустойчивую низкомолекулярную — люциферином.
С тех пор было сделано множество открытий, связанных с природой биолюминесценции. Однако в 2006 г. нобелевский лауреат Осаму Шимомура, посвятивший более 50 лет своей жизни исследованию этого завораживающего явления, с сожалением отметил, что значительный прогресс, достигнутый в этой области, сменился упадком [2]. На сегодняшний день известны структуры только семи природных люциферинов. Если в третьей четверти XX в. были определены пять из них, то в последней четверти — только два. К тому же последняя структура нового люциферина из динофлагеллят (простейших организмов, составляющих значительную часть морского планктона и светящихся от движения водных масс) была охарактеризована уже четверть века назад [3].
Долгожданный прорыв
Недавно в таежных районах юга Красноярского края был открыт новый люминесцирующий вид кольчатых червей семейства энхитреид. Один из авторов статьи (В. Н. Петушков), специалист по люминесценции бактерий, еще студентом, работая ночью на биостанции Красноярского университета, заметил, что его следы на земле светятся. Источником голубоватого излучения оказались мелкие черви. Тогда эта находка не показалась важной, и о сибирских светящихся червях забыли на много лет. А в конце 1980-х годов В. Н. Петушков с коллегой Н. С. Родионовой вернулся на биостанцию, чтобы попытаться определить вид этих существ. Выяснилось, что миру они неизвестны. С помощью Н. Т. Залесской, специалиста по беспозвоночным из московского Института проблем эволюционной морфологии и экологии животных им. А. Н. Северцова РАН, было сделано первое краткое описание нового вида олигохет, названного Fridericia heliota [4].
Свечение червя Fridericia heliota. Фото А. А. Семенова
Небольшие (длина взрослой особи 15–20 мм, диаметр 0,5 мм, масса 2 мг) бело-желтые черви F. heliota живут в лесных сибирских почвах. Они испускают зеленовато-голубой свет (максимум спектра излучения приходится на 478 нм), который после механического, химического или электрического раздражения постепенно в течение примерно 10 минут затухает. Светящиеся точки расположены на теле червя, а целомическая жидкость (заполняющая вторичную полость тела) не излучает. Считалось, что люминесценция всех земляных червей имеет единый характер. 12 видов из шести родов олигохет (Diplocardia, Diplotrema, Fletcherodrilus, Octochaetus, Pontodrilus и Spenceriella) выделяют целомическую жидкость, в клетках которой содержится биолюминесцентная система, включающая перекись водорода [5]. Наиболее полно механизм свечения изучен у крупных (длина около 60 см, масса 7 г) червей Diplocardia longa, обитающих в песчаных почвах на юге штата Джорджии (США). Люциферин D. longa, алифатический альдегид N-изовалерил-Замино-1-пропаналь, служит субстратом для люцифераз всех других светящихся олигохет. Более того, люцифераза D. longa активна в кросс-реакциях (когда пару взаимодействующих веществ берут от двух разных видов животных) с люциферинами других червей [6]. Но сибирский червь F. heliota оказался уникальным — кросс-реакции с люциферинами и люциферазами любых других организмов дали отрицательный результат. Это подразумевало, что механизм биолюминесценции у F. heliota и других видов отличается. В 2003 г. совместно с итальянским специалистом по систематике червей Э. Рота было опубликовано подробное описание светящегося червя из сибирской тайги [7].
Трудный путь к свету
В 2003–2007 гг. группа Петушкова провела первые исследования свойств биолюминесцентной системы F. heliota и выявила ее необходимые компоненты — новые люциферин и люциферазу, кислород, АТФ и ионы магния. Люциферин и люциферазу очистили, получили ультрафиолетовый спектр (зависимость поглощения от длины волны в ультрафиолетовом диапазоне) люциферина, исследовали рН- и температурную зависимости скорости реакции in vitro, влияние на нее солей и детергентов [8–10]. Эта работа требовала непрерывного поступления биомассы червей, которых ежегодно с тоннами земли в летне-осенний период и днем, и ночью добывали в лесах. В 2011 г. Шимомура возглавил новую лабораторию биолюминесцентных биотехнологий в Сибирском федеральном университете, и работы по изучению механизма испускания света F. heliota продолжились.
Чтобы установить структуру природного вещества, сначала его надо выделить в чистом виде. С люциферином F. heliota возникли серьезные затруднения из-за ограниченности биомассы червей (ручной сбор давал около 30 г в год, а в лабораторных условиях эти черви не хотят размножаться) и низкого содержания люциферина (приблизительно 0,1 мкг на 1 г необработанной биомассы) [10]. Ценой огромных усилий группе Петушкова за несколько лет из 90 г биомассы червей удалось выделить всего 5 мкг люциферина. Помимо него, экстракт F. heliota содержал несколько соединений неустановленного состава, которые похожи на люциферин по своим спектральным и хроматографическим свойствам. Они флуоресцируют так же, как и настоящий люциферин, но им самим не являются. Петушков предположил, что эти соединения — неактивные аналоги люциферина (его предшественники или продукты деградации). Значит, они должны иметь схожую с люциферином структуру. Одним из основных компонентов экстракта червя (его содержание в 30 раз больше, чем люциферина) было соединение, названное CompX. Выделенного количества (около 150 мкг) вполне хватило, чтобы получить всю информацию о его структуре [11].
Основной метод определения состава и строения вещества в современной органической химии — спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) ** . Его важный частный случай — протонный магнитный резонанс. Ядро атома водорода, 1 Н, во внешнем магнитном поле может находиться в двух энергетических состояниях: его собственный магнитный момент (важно, что он ненулевой) может ориентироваться по направлению поля и против него. Переход с нижнего энергетического уровня на верхний сопровождается поглощением энергии (ΔE = hν, где E, h и ν — энергия, постоянная Планка и частота излучения соответственно), которое регистрируется ЯМР-спектрометром. Ампулу с растворенным исследуемым веществом помещают в сильное магнитное поле и подвергают воздействию импульсов радиочастотного излучения. При определенных частотах протоны резонируют — частота импульса оказывается равной частоте переходов между энергетическими уровнями. При возникновении таких переходов образцом поглощается энергия внешнего поля. Частота ЯМР зависит от напряженности магнитного поля, а при заданном его значении — от магнитного момента исследуемого типа ядер. Однако частота резонанса для ядер одного химического элемента чрезвычайно чувствительна к их химическому окружению. Электронные оболочки атомов и молекул реагируют на внешнее магнитное поле, частично экранируя его, что приводит к изменению частоты резонанса — химическому сдвигу. Его величина зависит от окружения исследуемого ядра, взаимного расположения соседних атомов в пространстве, связи между ними. Часто в образце содержится несколько типов молекул, или в сложных органических молекулах резонирующие ядра находятся в разных атомных группах. Тогда даже для похожих атомов в близком окружении спектр ЯМР покажет разные сигналы, если атомы химически различны. Положение сигнала в спектре характеризует строение атомных групп, окружающих исследуемое ядро, а соотношение амплитуд пиков дает информацию об относительном количестве ядер с разным химическим окружением. Более того, из-за взаимодействия магнитных моментов разных ядер сигнал резонансного поглощения каждого из них может представлять собой сложный мультиплет (эффект спин-спинового взаимодействия), число и интенсивность компонент которого тоже однозначно связаны со строением молекулы исследуемого вещества. Так спектр ЯМР позволяет расшифровать химическое строение и структуру сложнейших органических соединений.
Структуры CompX (а) и его неприродного изомера (б)
Итак, по данным ЯМР- и масс-спектроскопии (метода исследования вещества, требующего его ионизации и основанного на определении соотношения массы и заряда образующихся ионов) М. А. Дубинный и К. Д. Надеждин из Института биоорганической химии предложили структуру соединения CompX. Оно оказалось необычным (такой молекулы в природе еще не находили) производным аминокислоты тирозина, получаемым в результате трех модификаций: дезаминирования до кетокислоты, метилирования енола и карбоксилирования ароматического кольца. Для установления конфигурации двойной связи А. С. Царькова и М. С. Баранов (из ИБХ) синтезировали и сравнили спектральные данные обоих изомеров. Z-изомер (от нем. zusammen — ‘вместе’; когда старшие заместители у каждого из атомов углерода, образующих двойную связь, расположены по одну сторону от нее) оказался идентичен природному образцу. Тогда как E-изомер (от нем. entgegen — ‘против’; старшие заместители у атомов углерода из пары — по разные стороны от двойной связи) обладал значимо отличными спектральными свойствами, в том числе отсутствием флуоресценции.
Структуры четырех пептидных изомеров люциферина F. heliota
Чтобы выяснить, какой из четырех пептидных изомеров отражает строение люциферина, пришлось провести их полный синтез, а затем сравнить ЯМР-спектры синтетических и природного соединений. Из четырех синтезированных только вещество 1 по всем спектральным характеристикам оказалось идентичным природному люциферину. И только оно обладало способностью испускать свет при добавлении белкового экстракта F. heliota в присутствии АТФ и MgSO4. Более того, спектры люминесценции и зависимости интенсивности свечения от концентрации вещества у синтетического и природного люциферинов были идентичны [12].
Люминесценция синтетического люциферина в присутствии экстракта червей F. heliota, АТФ, кислорода O2 и ионов магния Mg 2+
Спектры люминесценции червей F. heliota in vivo, природного и синтетического люциферинов
Открытие и расшифровка структуры компонента новой биолюминесцентной системы, помимо чисто научного, имеет и важное прикладное значение. Явление биолюминесценции очень широко применяется. Светящиеся метки используют для проведения анализов в медицине и фармацевтике, в лабораторных исследованиях — для визуализации различных физиологических процессов и активности генов, измерения концентрации АТФ. В экологии биолюминесценцию применяют для мониторинга окружающей среды. В тест-системах для поиска лекарств люциферин-люциферазные реакции служат своего рода лампочкой, помогающей определить, есть ли в электрической цепи напряжение. Люциферин Fridericia heliota непременно займет свою нишу в прикладной биолюминесценции. Он прост в химическом синтезе, исключительно стабилен в течение месяцев (а не часов, как самый используемый сегодня люциферин — светлячковый) и нетоксичен (в отличие от люциферина бактерий).
Литература
1. Roura S., Galvez-Monton C., Bayes-Genis A. Bioluminescence imaging: a shining future for cardiac regeneration // J. Cell. Mol. Med. 2013. V. 17. № 6. P. 693–703.
2. Shimomura O. Bioluminescence: chemical principles and methods. Singapore, 2006.
3. Nakamura H., Kishi Y., Shimomura O. et al. Structure of dinoflagellate luciferin and its enzymic and nonenzymic air-oxidation products // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 7607–7611.
4. Залесская Н. Т., Петушков В. Н., Родионова Н. С. Светящиеся почвенные энхитреиды (Oligochaeta, Enchytraeidae) // Докл. АН СССР. 1990. Т. 310. № 2. C. 496–498.
5. Wampler J. E., Jamieson B. G. M. Earthworm bioluminescence: comparative physiology and biochemistry // Comp. Biochem. Physiol. 1980. V. 66B. P. 43–50.
6. Ohtsuka H., Rudie N. G., Wampler J. E. Structural identification and synthesis of luciferin from the bioluminescent earthworm, Diplocardia longa // Biochemistry. 1976. V. 15. № 5. P. 1001–1004.
7. Rota E., Zalesskaja N. T., Rodionova N. S. et al. Redescription of Fridericia heliota (Annelida, Clitellata: Enchytraeidae), a luminous worm from the Siberian taiga, with a review of bioluminescence in the Oligochaeta // J. Zool. 2003. V. 260. № 3. P. 291–299.
8. Petushkov V. N., Rodionova N. S., Bondar V. S. Study of the luminescence system of the soil enchytraeid Fridericia heliota (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) // Dokl. Biochem. Biophys. 2003. V. 391. P. 204–207.
9. Rodionova N. S., Bondar V. S., Petushkov V. N. ATP is a cosubstrate of the luciferase of the earthworm Fridericia heliota (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) // Dokl. Biochem. Biophys. 2003. V. 392. P. 253–255.
10. Petushkov V. N., Rodionova N. S. Purification and partial spectral characterization of a novel luciferin from the luminous enchytraeid Fridericia heliota // J. Photochem. Photobiol. 2007. V. 87. P. 130–136.
11. Petushkov V. N., Tsarkova A. S., Dubinnyi M. A. et al. CompX, a luciferin-related tyrosine derivative from the bioluminescent earthworm Fridericia heliota. Structure elucidation and total synthesis // Tetrahedron Lett. 2014. № 55. P. 460–462.
12. Petushkov V. N., Dubinnyi M. A., Tsarkova A. S. et al. A novel type of luciferin from Siberian luminous earthworm Fridericia heliota: structure elucidation by spectral studies and total synthesis // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2014. doi: 10.1002/anie.201400529.
* Подробнее см.: Лабас Ю. А., Гордеева А. В. Свет и цвет живых организмов // Природа. 2003. № 2. С. 25–31 (PDF, 4 Мб).
** Подробнее см.: Федин Э. И. ЯМР-интроскопия — новый метод изучения структуры биологических объектов // Природа. 1980. № 4. С. 77–81 (DjVu, 4 Мб).
Читайте также: