Трансмиссионная электронная микроскопия кратко

Обновлено: 05.07.2024

Наилучшее разрешение в микроскопии может быть достигнуто с электронными микроскопами просвечивающего типа (трансмиссионными). Для формирования изображения в ТЭМ применяется монокинетический пучок быстрых электронов, ускоренный высоким напряжением (50-100 кВ или даже 1 MB), которые фокусируются электронными линзами (электрическим или магнитным полем). Изображение объекта проецируется на флуоресцирующий экран или фотопластинку. Ход лучей в просвечивающем электронном и оптическом микроскопе практически идентичен, высокое разрешение ТЭМ достигается исключительно за счет короткой длины волны электронного луча. Чтобы электронный пучок прошел в микроскопе весь путь (до 100 см) без соударений, в колонне микроскопа применяется высокий вакуум (Ю^-Ю7 мм рт. ст.).

В формировании изображения в электронном просвечивающем микроскопе принимают участие только те электроны, которые при прохождении через объект рассеиваются на сравнительно малые углы; электроны, которые рассеиваются на большие углы, задерживаются апертурной диафрагмой и не принимают участия в формировании изображения. Поэтому важным условием для наблюдения в ТЭМ является толщина объекта, которая не может превышать 100 нм, а обычно составляет от 20 до 30 нм.

В электронном микроскопе рассматривают либо слой полимера толщиной 10-20 нм, либо слепок с его поверхности, так называемую реплику. В первом случае используют тонкие пленки, которые получают выливанием и испарением разбавленного раствора полимера на поверхность воды, ртути и т. п., или тонкие срезы, полученные с помощью ультратома.

Для получения реплики полимерный материал разрушают таким образом, чтобы можно было не опасаться изменения его структуры в процессе разрушения. Обычно для этого замороженный полимер разрушают ударом. На образовавшуюся при разрушении поверхность с помощью специальных установок напыляют слой угля или кварца. Возникновение контраста на электронно-микроскопических снимках обусловлено различной рассеивающей способностью ядер разных атомов по отношению к электронному пучку. Поэтому полимеры, состоящие из легких ядер, часто дают неотчетливые снимки; чтобы изображение, видимое в электронный микроскоп, было более рельефным, на них под некоторым углом, меньше 90°, напыляют тяжелые металлы (платину, золото, палладий, хром). Полимер растворяют и удаляют, а полученную реплику рассматривают в электронный микроскоп. Если растворение полимера затруднено, то на образовавшуюся при механическом разрушении поверхность полимера наносят слой желатина. Затем пленку желатина отрывают, и напыление ведут на нее для получения обратной или негативной реплики.

Разработанные в последние годы высоковольтные электронные микроскопы (ускоряющий потенциал порядка 200 кВ) дают возможность исследовать относительно толстые образцы толщиной 1 мкм и более. При изучении этим методом двухфазных полимерных систем удается различить контраст между полимерными фазами при различии в их плотности более 10-15 %.

Тот факт, что в полимерных смесях и в блоксополимерах происходит фазовое расслоение двух компонентов, уже давно был известен, так же, как и важность этого явления для проявления характерных механических свойств. Но изучение структуры таких смесей стало возможным только благодаря ТЭМ, хотя при этом остается серьезная проблема достижения контраста между двумя фазами. Эта сложность была преодолена в 1965 году Като, который обнаружил, что тетраоксид осмия избирательно окрашивает макромолекулы, содержащие двойные углерод-углеродные связи, например молекулы полибутадиена и полиизопрена. Кроме того, тетраоксид осмия способствует увеличению жесткости эластомерной фазы, что позволяет получать ультратомированием образцы толщиной до 50 нм. Для окрашивания образец выдерживают в парах тетраоксида осмия в течение недели или в его 1 %-ном водном растворе 12 часов.

Важным итогом исследований методом ТЭМ [91 образцов из смесей полимеров явился вывод о том, что почти все промышленные полимерные смеси, блок - и привитые сополимеры претерпевают фазовое расслоение, причем для каждого характерна своя тонкая структура.

Возможно исследование этим методом вулканизованных эластомеров, однако для этого необходимо применять специальные методики. Например, при изучении структуры вулканизованного изо - пренового каучука методом ТЭМ образцы растворяют или подвергают набуханию в стироле с последующей его полимеризацией. После контрастирования образцов тетраоксидом осмия наблюдается сетчатая структура с размером ячейки, хорошо согласующимся со среднеквадратичной длиной фрагмента каучука между узлами сшивания. По данным распределения по размерам можно построить кривую распределения плотности сшивания. В образцах, полученных из раствора, наблюдаются сферические частицы с диаметром, соответствующим ассоциатам из 10 макромолекул.

К числу недостатков просвечивающей электронной микроскопии следует отнести сложность приготовления образцов и возможность ошибок ("артефактов") в определении структуры.

Трансмиссионный электронный микроскоп (Просвечивающий электронный микроскоп, ТЭМ — TEM — англ. Transmission Electron Microscope) — вид электронного микроскопа который позволяет получать прямое изображение объекта с помощью электронного луча. Техника просвещение электронами (трансмиссии) тонких объектов позволяет получать разделение до 0,08 нм, а при использовании техники электронного корректировки аберрации — ТЕАМ (Transmission Electron Aberration-corrected Microscope) получать разрешения и 0,05 нм.

Теоретические основы

По правилу Аббе предел разделения двух точек в оптическом микроскопе зависит от длины волны света, значение показателя преломления и половины угла открывания объектива:.

где NA = n sin a.

где h, e, m 0, и E = m ₀ c 2 = 511 кэВ являются соответственно постоянная Планка, заряд, масса и энергия покоя электрона. Итак по этой формуле можно найти длину волны электрона относительно рабочего напряжения:

U (кВ)	v / c	(пм)
100	0,548	3,70
3 часа	0,776	1,97
10 часов	0,941	0,87

Принцип работы

В трансмиссионном электронном микроскопе электроны проходят через объект, который для этого исследования должно быть достаточно тонким. Часто достаточна толщина от нескольких нанометров до микрометра, что зависит от порядкового номера атомов, входящих в состав объекта и величины напряжения для ускорения электронов. В камере микроскопа должен быть высокий вакуум (10 -7 мбар), для устранения взаимодействия электронов с молекулами воздуха. Для устранения примесей и создания высокого вакуума камеру дополнительно оборудуют сосудом охлажденной жидким азотом, как для конденсации примесей так и для охлаждения детектора анализа спектра рентгеновского излучения. Типичные напряжения составляют от 80 кВ до 400кВ, хотя напряжения ниже 200кВ используют для биологических объектов. Чем ниже напряжение и выше порядковое число атомов, тем тоньше должен быть объект. Пучок электронов выходит из источника катода — электронной пушки (как правило LaB _{6) и} ускоряется высоким напряжением, при этом для управления пучком используется система магнито-электрических конденсором-линз таким образом, чтобы он попадал параллельно на выбранный участок объекта.

При попадании на объект часть электронов рассеивается в зависимости от порядкового номера элемента или его окружение в кристаллические структуре. С помощью диафрагмы пропускаются НЕ рассеяны электроны и на экране (также на фотопленке или CCD сенсоре по определенной техникой) получается прямое изображение реальной структуры, которое можно использовать для интерпретации или расчетов.

Анализируя энергетический спектр эмиссии рентгеновского излучения (англ. Energy Dispersive X-ray Spectroscopy, EDX), образующийся при взаимодействии электронного пучка и атомов объекта, дополнительно изучают также и его состав.

Изменяя фокусное плоскость объектива линз получают картину электронной дифракции участки кристаллического тела, что позволяет определять его кристаллическую структуру.

Трансмиссионный электронный микроскоп состоит из:

электронной пушки (источника электронов)
системы магнитных линз
системы детектирования электронов

Формирование изображения

Формирование изображения (контрастное изображение) в значительной степени зависит от режима работы тему. Комплекс методов визуализации, которые используют уникальную возможность смены изображения линзы или возможность отключения объектива, разрешена для многих режимов работы. Эти режимы могут быть использованы для получения информации, которая представляет особый интерес для исследователя.

Изображения в светлом поле

Самым распространенным режимом работы ТЭМ является светлый режим визуализации поля. В этом режиме особенностью является то, если их рассматривать классически, что изображение формируется непосредственно с закупорки и поглощения электронов в образце. Толще регионы образца, или регионы с большим атомным номером появятся темными, в то время как регионы, без образца в направлении прохождения луча появятся ярким (светлым) — отсюда и термин "светлом поле". Изображение, по сути считается простой двумерной проекцией образца к оптической оси, и в первом приближении может быть смоделирована с помощью закона Бэра, сложный анализ вимагаюе моделирования образца включая фазовую информацию.

Изображение в темном поле

Образцы могут проявлять дифракционный контраст, при котором пучок электронов испытывает Бреговская рассеяния, в случае кристаллического образца, рассеивает электроны на отдельные места в задней фокальной плоскости. Если разместить отверстия в задней фокальной плоскости, то есть апертура объекта, желательно Бреговская отображения может быть выбрано (или исключено), таким образом только та часть образца вызывающей рассеяния электронов на соответствующие изображения будет отображаться (проецировать изображение) на экран. Если изображение взятых не включают нерассеянных лучей (которые появятся в в фокусе объектива), то изображение будет выглядеть темным там где не происходит рассеяния на образце по отношению к выбранному пика. Это называется изображением в темном поле.

Биологические объекты

Для биологических объектов необходимо проводить специальную подготовку, которая зависит от поставленных задач:

Трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия основаны на взаимодействии между электронами и компонентами тканей.

Трансмиссионная электронная микроскопия. Трансмиссионный электронный микроскоп — это система визуализации изображения, которая теоретически обеспечивает очень высокое разрешение (0,1 нм). На практике, однако, разрешение, получаемое большинством хороших приборов, составляет около 3 нм.

Такое высокое разрешение делает возможным изучение деталей при увеличении вплоть до 400 000 раз. К сожалению, этот уровень увеличения применим только к изолированным молекулам или частицам. Очень тонкие тканевые срезы можно детально изучать при увеличениях примерно до 120 000 раз.

В основе действия трансмиссионного электронного микроскопа лежит принцип, согласно которому электромагнитные поля способны отклонять пучок электронов таким же образом, что и стеклянные линзы, отклоняющие свет. В электронном микроскопе электроны испускаются в результате нагревания в вакууме очень тонкой металлической (обычно вольфрамовой) нити (катода).

Испускаемые электроны далее попадают в условия разницы потенциалов порядка 60—120 кВ между катодом и анодом, представляющим собой металлическую пластинку с отверстием в центре. Электроны, таким образом, привлекаются к аноду и разгоняются до высоких скоростей. Они проходят через центральное отверстие в аноде, формируя постоянный поток (или пучок) электронов, который проникает в колонну микроскопа.

Пучок проходит внутри электрических катушек и отклоняется примерно так же, как и свет в оптических линзах, поскольку электроны изменяют свой ход под действием электромагнитных полей. По этой причине электрические катушки электронных микроскопов называются электромагнитными линзами.

Устройство электронного микроскопа очень сходно с конструкцией оптического микроскопа, хотя оптика электронного микроскопа обычно располагается в обратном порядке. Первая линза — это конденсор, который фокусирует пучок электронов на срезе. Некоторые электроны взаимодействуют с атомами в срезе и продолжают свой ход, тогда как другие просто проходят сквозь образец без взаимодействия.

Большая часть электронов достигает линзы объектива, которая образует увеличенное изображение, далее проецирующееся через другие увеличивающие линзы. Поскольку глаз человека не воспринимает электроны, изображение в конечном итоге проецируется на флюоресцентный экран или регистрируется на фотопластинках или в камере прибора с зарядовой связью.

Так как большая часть изображения в трансмиссионном электронном микроскопе образуется в результате баланса между электронами, которые попадают на флюоресцентный экран (или фотопластинку), и электронами, которые остались в колонне микроскопа, получающееся изображение всегда черно-белое. Темные участки электронных микрофотографий обычно называют электронно-плотными, тогда как светлые участки именуют электронно-прозрачными.

Чтобы создать хорошее взаимодействие между образцом и электронами, в электронной микроскопии используют очень тонкие срезы (40—90 нм), поэтому заливку производят в смолу, которая очень сильно затвердевает. Полученные блоки настолько твердые, что для изготовления срезов требуются стеклянные или алмазные ножи. Чрезвычайно тонкие срезы помещают на маленькие металлические сетки и помещают внутрь микроскопа для изучения.

Метод замораживания позволяет исследовать ткани с помощью электронной микроскопии, при этом необходимость в фиксации и заливке отсутствует. Метод дает меньше артефактов, чем стандартная подготовка тканей, хотя он обычно отличается трудоемкостью. Можно получить срезы замороженных тканей с их последующим исследованием методами цитохимии или иммуноцитохимии, или эти ткани подвергнуть скалыванию (криофрактографии, замораживанию-скалыванию) для выявления деталей внутренней структуры мембран.

Общий вид трансмиссионного электронного микроскопа JEM-1230. Трансмиссионный электронный микроскоп. Схема показывает его линзы и ход электронного луча. ПЗС — прибор с зарядовой связью.

Просве́чивающий (трансмиссио́нный) электро́нный микроско́п (ПЭМ, англ, TEM — Transmission electron microscopy) — устройство для получения изображения с помощью проходящего через образец пучка электронов.

Отличается от других типов электронных микроскопов тем, что электронный пучок просвечивает образец, неоднородное поглощение электронов разными участками образца дает двумерную картину распределения плотности прошедшего электронного потока. Прошедший через образец поток затем фокусируется на регистрирующей поверхности магнитными электронными линзами (электронной оптикой) в увеличенном размере. В качестве регистрирующей поверхности применяют флуоресцентные экраны, покрытые слоем люминофора, фотоплёнку или фотопластинку, или приборы с зарядовой связью (на ПЗС-матрице). Например, на слое люминофора образуется светящееся видимое изображение.

Так как поток электронов сильно поглощается веществом, изучаемые образцы должны иметь очень маленькую толщину, так называемые ультратонкие образцы. Ультратонким считается образец толщиной менее 0,1 мкм .

электронная микроскопия.

Трансмиссионная сканирующая (растровая)

Общие требования к исследуемому материалу в сканирующей электронной микроскопии по сути те же, что и в трансмиссионной микроскопии. Однако в трансмиссионной микроскопии важна сохранность архитектоники самого объекта и его внутриклеточных органелл. В методе СЭМ все внимание обращено на поверхность изучаемого объекта и ее сохранность при специальной обработке.

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ).

Основы конструкции электронного микроскопа. Принцип работы электронного микроскопа.

Уже в 1924г. стало известно, что волновые свойства присущи также и электронам и что длина волны электрона обратно пропорциональна его скорости. Вскоре после этого было установлено, что электронный луч можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Эти два свойства электронного луча послужили основой создания электронного микроскопа, в котором при особых условиях может быть достигнуто минимальное разрешение 2 Å (0,0002 мкм). Основная часть электронного микроскопа представляет собой металлический ряд магнитных линз, люминисцирующий экран и фотографическую пластинку.

К вольфрамовой нити прилагается высокое отрицательное напряжение, которое и обуславливает большую разницу потенциалов между нитью и заземленной пластиной анода. Напряжение, которое используется в для ускорения электронов, достигает 50 000 – 100 000 В (в микроскопах лаборатории Электронной микроскопии – 80 000 В). Разница потенциалов ускоряет движение электронов по направлению к аноду. Часть электронов проходит через отверстие в центре анода (центральную апертуру) и образует электронный луч, направляющийся вниз по колонне микроскопа.

Далее электронный луч фокусируется первой магнитной линзой – конденсорной. Основа магнитной линзы – несколько тысяч витков проволоки, через которую пропускают ток силой 1 А или меньше. Проходящий через катушку ток, создает магнитное поле, которое отклоняет попадающие в него электроны. Для того, чтобы избежать необходимости использовать токи большей силы и создать концентрированное магнитное поле, наружные и внутренние витки катушки упаковываются в железный панцирь, на внутренней стороне которого имеется небольшая кольцевидная щель. Таким образом, все магнитное поле концентрируется внутри этой щели. Электрон, попадающий в магнитное поле, движется по спирали вследствие сложения двух сил: 1) разности потенциалов между катодом и анодом, которая толкает электрон вниз по прямой линии, и 2) магнитного поля, которое заставляет электрон двигаться по окружности под прямым углом к электронно-микроскопической оси. В результате электрон двигается по спирали.

Электронный луч, сфокусированный конденсорной магнитной линзой, освещает объект. Большая часть электронов проходит через объект без отклонения, однако часть электронов рассеивается тяжелыми атомами объекта и выбивается из общего электронного луча. В результате формируется такая структура выходящего луча, которая при повторной фокусировке преобразуется в изображение объекта.

Электроны, прошедшие через объект, фокусируются второй магнитной линзой - объективной, которая формирует увеличенное изображение объекта. Для того, чтобы добиться еще большей концентрации поля, в канал объективной линзы помещают железные полюсные наконечники, что позволяет сузить как сам канал, так и кольцевую щель, в которой собственно и происходит концентрация магнитного поля.

Полученное изображение в дальнейшем снова увеличивается третьей магнитной линзой – проекционной – и проецируется на люминесцентный экран. Люминесценция – это способность к электромагнитному излучению под влиянием бомбардировки электромагнитными или электронными лучами. Некоторые вещества при этом излучают видимый свет. Явление люминесценции используют в электронной микроскопии для того, чтобы сделать видимым электронное изображение. С этой целью на пути луча и ставят люминесцентный экран, покрытый люминесцентным веществом, например, сернистым цинком. Под воздействием электронов экран излучает видимый свет. Естественно, что электроны, вышедшие из состава луча, не достигают экрана и те места экрана, которые не подвергаются бомбардировке, остаются темными. Светлые (люминесцирующие) области экрана показывают те места, где электроны смогли пройти сквозь объект и вызвать свечение вещества, покрывающего люминисцентный экран.

Разрешение люминесцентного экрана ограничивается размерами частиц люминесцирующего вещества приблизительно до 70-100 мкм, а также рассеиванием света в слое этого вещества. Изображение можно сфотографировать, если поднять люминесцентный экран с тем, чтобы луч попал на фотографическую пластинку. При фотографировании объектов следует использовать фотопластинки с мелкозернистой эмульсией, которые обеспечивают фиксацию всех деталей электронного изображения.

Следует отметить, что в большинстве современных просвечивающих микроскопах используется две конденсорные линзы (обозначаемые К1 и К2), с тем чтобы получить очень небольшую область интенсивного освещения объекта для работы при больших увеличениях. Функция К1 заключается в том, чтобы уменьшить диаметр изображения эффективного источника электронов с 40-50 до 1 мкм или менее. Такое уменьшенное изображение проецируется затем на объект с помощью второй конденсорной линзы К2. Это дает возможность по желанию освещать очень небольшие участки объекта и избежать тем самым повреждения лучом других его частей. Размеры проецируемого изображения источника электронов можно произвольно изменять, увеличивая или уменьшая силу тока в катушке конденсорной линзы К2.

Кроме того, обычно имеются также 2 проекционные линзы (П1, которая иногда называется промежуточной линзой, и П2), что позволяет получить большое увеличение конечного изображения при относительно небольшой длине колонны микроскопа.

Вакуумная система микроскопа.

В воздухе электроны могут проходить лишь несколько микрометров, а затем они либо останавливаются, либо скорость их снижается в результате столкновения с молекулами газов, содержащихся в воздухе. Поскольку расстояние между электронной пушкой и фотографической пластинкой составляет приблизительно 1м, внутри микроскопа необходимо создать вакуум. Рабочий вакуум должен быть не менее 10 -4 мм рт.ст. (как правило, 10-5 - 10 -6 мм рт.ст.). В этих условиях электрон может пройти 2,5 м, прежде чем он столкнется с молекулой газа.

Для поддержания требуемого вакуума необходимы вакуумные насосы двух типов. С помощью ротационного механического форвакуумного насоса осуществляют первую, предварительную откачку (до 10 -2 мм рт.ст.). Далее включают насос второго типа (диффузионный).

Система охлаждения микроскопа.

При работе электронного микроскопа диффузионный насос и магнитные линзы охлаждаются водой, циркулирующей в специально охлажденной рубашке. При употреблении для этой цели нефильтрованной водопроводной воды может произойти быстрое засорение системы охлаждения микроскопа. Чтобы избежать частой смены и чистки фильтров, многие микроскопы снабжены встроенной системой повторной циркуляции деионизированной или дистиллированной.

Подготовка материала к исследованию в трансмиссионной электронной микроскопии.

1. Взятие материала для фиксации.

Кусочки органа или ткани сразу же после иссечения у животного помещают на пробку или фильтровальную бумагу, смоченную фиксатором. С помощью пинцета и лезвия из небольших кусочков аккуратно нарезают кусочки размером не более 1-1,5 мм 3 . Очень важно, чтобы кусочки имели размер не выше указанного: в противном случае их внутренние части будут фиксированы не полностью или совсем не фиксированы. Нарезанные кусочки быстро перемещают в фиксирующую жидкость.

Фиксация.

Цели фиксации: 1) остановить посмертные изменения, 2) сохранить ткань в состоянии, по возможности наиболее близком к прижизненному. Фиксирующие вещества, используемые в электронной микроскопии, применяются обычно в водных растворах (величина pH этих растворов поддерживается на уровне физиологических значений при помощи буфера).

Постфиксация.

Читайте также: