Протеолитические свойства микроорганизмов кратко

Обновлено: 05.07.2024

Учебно-методическое пособие для внеаудиторной и кружковой работы по дисциплине "Основы микробиологии и иммунологии" для специальностей 060501 Сестринское дело и 060102 Акушерское дело.

В лабораторной диагностике инфекционных болезней изучение ферментативной активности бактерий имеет огромное значение в ходе бактериологического метода исследования. Изучая биохимическую активность микроорганизмов, студенты не только глубоко познают особенности жизнедеятельности бактерий, но и знакомятся с одним из важнейших методов лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Изучение данной темы предполагает использование активных методов обучения в сочетании с традиционными:

в занятии предусмотрены этапы активизации базисных знаний (в данном случае по химии и теории микробиологии),

демонстрация преподавателем результатов опытов с ферментами бактерий, самоподготовка с использованием УМП,

самостоятельное решение проблемы в конкретной ситуационной задаче.

В ходе занятия студенты овладевают навыками исследовательской работы. Решение ряда теоретических вопросов позволяет студентам достичь конкретных практических целей в ходе бактериологического метода исследования.

Процесс работы над темой организован таким образом, что студент вынужден осмыслить основную проблему темы, найти ключ к её решению, изучив опорный конспект, и сделать вывод на основе логического обобщения результатов исследования. Работа студентов над данной темой не только даёт определённый объём информации, но и решает важнейшую педагогическую задачу – учит активно мыслить, обобщать результаты исследований, делать выводы. Важно, что наряду с коллективной формой обучения учебно-методическое пособие предполагает также индивидуальную самостоятельную работу каждого обучающегося в ходе решения конкретных ситуационных задач.

P.S. К сожалению, при публикации утрачены цветные иллюстрации в пособии. Полную версию работы можно получить при контаткте непосредственно с автором.

Вложение	Размер
izuchenie_bioh_akt_bakt.docx	287.11 КБ

Предварительный просмотр:

Государственное бюджетное образовательное учреждение

среднего профессионального образования

«Московское медицинское училище № 15

Учебно - методическое пособие

для проведения внеаудиторной работы и кружковой работы

"Изучение биохимической активности бактерий"

Составлено в соответствии

с Государственными требованиями

к минимуму содержания и уровню

по специальностям: Сестринское дело 060501

Акушерское дело 060102

РАССМОТРЕНО И ОДОБРЕНО УТВЕРЖДАЮ

НА ЗАСЕДАНИИ ПЦК №3 ЗАМЕСТИТЕЛЬ ДИРЕКТОРА

ПРОТОКОЛ № _______ ПО УЧЕБНОЙ РАБОТЕ

_____________/Парфёнова Л. Ф./

Биохимическая, или ферментативная, активность микроорганизмов лежит в основе тех изменений, которые происходят под влиянием метаболизма бактерий как во внешней среде, так и в организме человека. Ферментативная деятельность бактерий используется в пищевой и фармацевтической промышленности, сельском хозяйстве и генной инженерии. Ферменты патогенных бактерий участвуют в формировании патологических процессов в органах и тканях при инфекционной болезни. В лабораторной диагностике инфекционных болезней изучение ферментативной активности бактерий имеет огромное значение в ходе бактериологического метода исследования. Изучая биохимическую активность микроорганизмов, студенты не только глубоко познают особенности жизнедеятельности бактерий, но и знакомятся с одним из важнейших методов лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Изучение данной темы предполагает использование активных методов обучения в сочетании с традиционными:

в занятии предусмотрены этапы активизации базисных знаний (в данном случае по химии и теории микробиологии),

самостоятельное решение проблемы в конкретной ситуационной задаче.

Процесс работы над темой организован таким образом, что студент вынужден осмыслить основную проблему темы, найти ключ к её решению, изучив опорный конспект, и сделать вывод на основе логического обобщения результатов исследования. Работа студентов над данной темой не только даёт определённый объём информации, но и решает важнейшую педагогическую задачу – учит активно мыслить, обобщать результаты исследований, делать выводы . Важно, что наряду с коллективной формой обучения учебно-методическое пособие предполагает также индивидуальную самостоятельную работу каждого обучающегося в ходе решения конкретных ситуационных задач.

Уметь 1) обнаружить ферменты бактерий с помощью специальных питательных сред;

2) использовать результаты исследования биохимической активности бактерий для определения вида патогенных микроорганизмов.

особенности белкового и углеводного обмена патогенных бактерий;
значение изучения биохимической активности патогенных бактерий в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Активизация базисных знаний

Освоение теории биохимии бактерий.

Самостоятельная практическая работа с УМП.

Общее время занятия

Методическое:

Учебно-методическое пособие "Изучение биохимической активности микроорганизмов".
Учебники: "Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии" под ред.А.А.Воробьёва и Ю.С. Кривошеина. Изд. "Мастерство". Москва, 2012 г.

Материальное:

Слайды для интерактивной доски.
Цветные карандаши.

Имитация чистых культур микроорганизмов - взвесь в физиологическом растворе; малый цветной ряд Гисса до посева и тот же ряд после суточного культивирования в термостате после посева.

2.3.Пробирки с мясо-пептонным бульоном и индикаторными бумажками для определе-

ния индола и сероводорода до посева чистой культуры и то же после посева через

сутки культивирования в термостате (имитация) .

Освоение теории биохимии бактерий.

Письменно ответьте на вопросы, используя опорный конспект:

Демонстрация углеводных и белковых сред с посевами микроорганизмов.

Устно ответьте на вопросы:

Как изменяются углеводные среды под воздействием микробов?
Почему изменяются углеводные среды под воздействием микробов?
Как изменяются белковые среды под воздействием микробов?
Почему изменяются белковые среды под воздействием микробов?
Как обнаруживают изменения в углеводных средах под воздействием бактерий?
Как обнаруживают изменения в белковых средах под воздействием бактерий?
Как используют данные о сахаролитической и протеолитической активности бактерий в диагностике инфекционного заболевания?

Решите ситуационную задачу, используя полученную на занятии информацию, данные задачи и справочную таблицу.

Произвели посев культуры бактерий, выделенных у больного, на среды Гисса и на пептонную воду.Через 24 часа культивирования обнаружено: в средах с глюкозой, лактозой, маннитом и мальтозой цвет среды изменился с жёлтого на ярко – розовый и выделились пузырьки газа; в среде с сахарозой произошло помутнение без изменения цвета среды. Реактивная бумажка на сероводород почернела, а реактивная бумажка на индол стала малиновой.

Задание: 1. Зарисуйте результат проведённого исследования (2 –ой день). Расставьте под пробирками значки, обозначающие сахаролитическую и протеолитическую активность бактерий.

2. Используя данные своего исследования и справочную таблицу, определите вид патогенных бактерий, выделенных у больного.

ГРАФИЧЕСКАЯ СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

МИКРООРГАНИЗМОВ (1 вариант)

Первый день – посев микроорганизмов на среды Гисса и мясо – пептонный бульон для определения сахаролитической и протеолитической активности.

Глюкоза Лактоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

Второй день: учёт результатов исследования. Зарисовать согласно условию задачи.

Произвели посев культуры бактерий, выделенных у больного, на среды Гисса и на пептонную воду. Через 24 часа культивирования обнаружено: в средах с глюкозой, маннитом и мальтозой цвет среды изменился с жёлтого на ярко – розовый и выделились пузырьки газа; в среде с лактозой и сахарозой произошло помутнение без изменения цвета среды. Реактивные бумажки для определения сероводорода и индола не изменились.

ГРАФИЧЕСКАЯ СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ (2 вариант)

Глюкоза Лактоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

Второй день: учёт результатов исследования. Зарисовать согласно условию задачи.

Произвели посев культуры бактерий, выделенных у больного, на среды Гисса и на пептонную воду. Через 24 часа культивирования обнаружено: в средах с глюкозой, маннитом и мальтозой цвет среды изменился с жёлтого на ярко – розовый и выделились пузырьки газа; в среде с лактозой и сахарозой произошло помутнение без изменения цвета среды. Реактивная бумажка для определения сероводорода почернела, а реактивная бумажка для определения индола не изменилась.

1. Зарисуйте результат проведённого исследования (2 –ой день). Расставьте под пробирками значки, обозначающие сахаролитическую и протеолитическую активность бактерий.

ГРАФИЧЕСКАЯ СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

МИКРООРГАНИЗМОВ (3 вриант)

Глюкоза Лактоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

Второй день: учёт результатов исследования. Зарисовать согласно условию задачи.

I. Определение сахаролитических ферментов бактерий.

Сахаролитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью ферментов разлагать сахара до более простых соединений – кислоты, газа, альдегидов. Эти вещества можно обнаружить в питательной среде с помощью специальных химических веществ – индикаторов.

II. Определение протеолитических ферментов бактерий.

Протеолитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью протеолитических ферментов расщеплять молекулы белка до аминокислот и простых веществ – сероводорода, индола и др.

Для обнаружения протеолитических ферментов исследуемую культуру засевают на мясо – пептонный бульон или пептонную воду. Под пробки пробирок вводят индикаторные бумажки, пропитанные реактивными растворами.

Если бактерии разлагают белок с образованием сероводорода , то реактивная бумажка окрашивается в чёрный цвет. Некоторые бактерии разлагают белок с накоплением в окружающей среде индола. В этом случае индикаторная бумажка окрашивается в малиновый цвет. Присутствие продуктов распада белка в пробирке - сероводорода и индола - свидетельствует о протеолитической активности бактерий и обозначается на схеме H 2 S (+) и индол (+) соответственно .

III. Протеалитическую активность бактерий можно изучать на желатиновой среде. При посеве на желатин бактерии с сильной протеолитической активностью разжижают его. Форма разжижения желатина характерна для некоторых видов бактерий и используется как видовой признак в лабораторной диагностике инфекций.

Некоторые виды микроорганизмов продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты — протеазы, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада — пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединения двух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокислоты.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатин, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса.

Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. Поэтому для разных видов микробов рекомендуют питательные среды различного состава.

Определение протеолитической активности микробов

а) На желатине. Мясо-пептонный желатин разливают в пробирки столбиком по 5— 6 мл. Посев производят уколом, погружая петлю с исследуемой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Микробы, способные расти при низкой температуре, оставляют стоять в комнате при 20—22°С. Остальные посевы инкубируют в термостате при 37°С. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят одну или две пробирки с незасеянным желатином для контроля. При температуре 37°С желатин плавится, поэтому после инкубации пробирки, вынутые из термостата, опускают в холодную воду или ставят в холодильник. После застудневания желатина в контрольных пробирках приступают к просмотру роста и учету изменений в питательной среде опытных пробирок. Там, где под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной среды. Пробирки, в которых после суточного инкубирования среда остается без изменения, оставляют в термостате. Наблюдение за изменением среды ведется в течение 20 суток. В протоколе исследования обязательно отмечают день появления признаков разжижения среды, степень и характер ее разжижения.

б) На молочном агаре Эйкмана. Молочный агар Эйкмана, разлитый и остуженный в чашках Петри, засевают исследуемой культурой микробов. Посев делают петлей или шпателем так, чтобы получить изолированные колонии. Через 24—48 ч инкубации в термостате культуры, продуцирующие протеолитический фермент, обусловливают пептонизацию молочного белка — казеина, в результате чего вокруг таких колоний образуются прозрачные зоны, четко выделяющиеся на общем молочно-мутном фоне среды.

в) На свернутой кровяной сыворотке. Культуру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыворотки, инкубируют в термостате при 37°С. Штаммы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

г) В бульоне с куриным яичным белком. В пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера, содержащим кусочек свернутого куриного белка, вносят одну петлю исследуемой культуры микроба. Посевы просматривают ежедневно в течение 5 дней. Протеолитически активные культуры микробов расщепляют коагулированный яичный белок; кусочки белка, содержавшиеся в среде, заметно уменьшаются в размере, превращаясь в крошкообразную массу, или полностью растворяются.

Аналогичным образом проявляются протеолитические свойства микробов в средах с кусочком вареного мяса.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, мочевины и аммиака.

При определении видов и дифференциации разновидностей патогенных микробов наибольшее значение имеет выявление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Основной путь метаболизма представителей кишечной флоры

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ УПМ (условно-патогенная потенции	САХАРОЛИТИЧЕСКАЯ (полезные микроорганизмы)
Бактероиды Протей Клостридии* Ристелла Кишечная палочка*	Бифидобактерии Лактобактерии Фекальный стрептококк

Сахаролитическая микрофлора (бифидобактерии, лактобактерии)

В организме человека только клетки мозга и клетки микрофлоры могут утилизировать углеводы без инсулина.

Пищевые волокна и крахмал не перевариваются ферментами желудочно-кишечного тракта в желудке и тонком кищечнике и не являются источником энергии. Они подвергаются бактериальной ферментации сахаролитическими видами бактерий (бифидо- и лактобактерии, некоторые кокки, пропионобактерии).

Ряд органических соединений (желчные кислоты, стероиды, некоторые токсичные соединения и бактерии) могут обратимо связываться с волокнами и выводиться из организма.

Крахмал и пищевые волокна способствуют росту сахаролитических видов бактерий в толстом кишечнике: бифидобактерий, лактобактерий, некоторых кокков, пропионобактерий, метаболические функции которых способствуют поддержанию нормального обмена веществ и нейтрализуют негативные влияния протеолитической флоры.

Протеолитическая микрофлора (бактероиды, протей, клостридии, растелла, кишечная палочка)

Протеолитическая микрофлора осуществляет утилизацию непереваренных молекул белка.

При превышении нормы по протеолитической флоры развивается гнилостная диспепсия. В этих случаях рекомендуется ограничить употребление продуктов, содержащих животный белок (яиц, мяса, рыбы), и 2-3 раза в неделю соблюдать лактовегетарианскую диету ( для наращивания сахаролитической флоры).

Условно-патогенная протеолитическая флора при превышении норм может вызывать воспалительные заболевания

При превышении по норме клостридии вызывают разжижение стула, понос. Косвенный - признак повышенное газообразование, тухлый запах кала, (симптомы гнилостной диспепсии).

Уменьшение нормальной кишечной палочки ведет за собой к снижению количества бифидобактерий. На начальном этапе эшерихиоза достаточно восстановить бифидофлору Бифидум БАГ (жидким концентратом бифидобактерий) и кишечная палочка сама восстанавливается.

Кишечная палочка со сниженной ферментативной активностью (лактозонегативная ) – признак начинающегося дисбактериоза, и косвенный признак возможного присутствия в кишечнике глистов или простейших. Превышение нормы 10*5 КОЕ/г вызывает инфекции мочевых путей, брюшной полости, кишечника и верхних дыхательных путей.

Протей провоцирует инфекции мочевых путей.

Бактероиды при превышении нормы может вызвать инфекции брюшной полости, малого таза, желчных путей.

ИЗУЧЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ, ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ И ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММ ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS SUBTILIS ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Введение. Ферменты - это специфические катализаторы белковой природы. Они вырабатываются клетками и тканями организмов, и которые играют центральную роль в каждом биохимическом процессе. Они катализируют сотни ступенчатых реакций по разрушению питательных веществ, сохранению и трансформации химической энергии и получении биологических макромолекул из простых предшественников. Исследование ферментов имеет огромное практическое значение в связи с применением, которое основано на их высокой каталитической активности и более высокой по сравнению с небиологическими каталитическими системами субстратной специфичностью [1,2].

Целью данного исследования является получение ферментов из Bacillus subtilis, используя в качестве субстрата экстракт пивной дробины.

Ранее авторами [3] приведен аминокислотный состав сухой пивной дробины, где показано, что при анализе особое внимание уделяется содержанию незаменимых аминокислот, которые обусловливают биологическую ценность белков.

Методы исследования. В работе проведен скрининг амилолитической активности B. Subtilis, где для его выявления использовали среду Лоурия-Бертони (LA), в который вносится 1%-ный раствор крахмала. После инкубирования микроорганизмов раствор Люголя был добавлен для идентификации окрашенной зоны. По наличию окрашивания и его диаметра, образованного после добавления раствора Люголя, устанавливают амилолитическую активность культуры [4,5].

Амилолитическая активность. Для выявления амилолитической активности использовали плотные питательные среды: MRS (Merck) - для лактобацилл и Лоурия-Бертони (LA) - для остальных бактерий, в которые вносили 1% во-дорастворимый картофельный крахмал. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом на чашки Петри и инкубировали при 37 о С в течение 2 – 5 суток. Гидролиз крахмала обнаруживали по бесцветным зонам вокруг штриха (колоний) после обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивалась в синий цвет.

Состав питательной среды. В 1 литре дистиллированной воды растворяют 6 г. бактериологического пептона, 0,5 г. MgSO₄.7H₂O, 0,5 г. KCL, 1 г. субстрата. Затем 100 мл среды в конической колбе подогревается на плитке и стерилизуется в автоклаве при 120 0 С.

Определение протеолитической активности. Определение протеолитической активности проводили по гидролизу 1 % раствора казеина протеазами исследуемых штаммов. За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, которое за 1 мин при 37°Си рН 7,2 повышает в неосаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктах протеолиза содержание тирозина на 1 микроэквивалент или за 10 мин при той же температуре повышает оптическую плотность раствора при 280 нм на 1 единицу.

Исследование влияния рН на выход амилазы. Влияние рН было исследовано для значений рН от 6 до 9 для B. subtilis, выход амилазы исследован по методу ДНСК [6,7].

Определение редуцирующих сахаров по реакции с 3,5 – диннитросалициловой кислотой. При взаимодействии сахаров с 3, 5 – динитросалициловой кислотой последняя восстанавливается в 3-амино 5-нитросалициловую кислоту. В мерной колбе на 1 литр в дистиллированной воде растворяют 10 г. 3,5 динитросалициловой кислоты, 300 г. Сегнетовой соли, 16 г. Едкого натра и доводят до метки водой. Раствор выдерживают два дня в темном месте, затем фильтруют в склянку оранжевого цвета и хранят в темноте. К 1 мл испытуемого раствора приливают 2 мл динитросалицилового реактива, нагревают 5 мин. В кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, доводят до объема 25 мл. Определение оптической плотности проводят при 530 нм (зеленый светофильтр).

Определение гидролитической активности. Гидролитическая активность определяется в надосадочной жидкости из культур, которую получают путем центрифугирования полного объема культуры. В реакционную смесь вводят 900 мл соответствующего полисахаридного субстрата и 100 мл надосадочной жидкости. Пробы по 50 мл отбирают в исходный момент и через каждые 30 мин в течение 1,5-3 ч. Для контроля к субстрату добавляют гомологичную надосадочную жидкость, прогретую в течение 10 мин при 80 0 С. Реакцию останавливают нагреванием проб при 95 0 С в течение 10 мин. Определяют активность путем определения концентрации глюкозы, используя колориметрический метод. Для этого измеряют оптическую плотность на фотоколориметре при длине волны 490 нм, и по градуированному графику определяют концентрацию моносахарозы. Гидролитическую активность ферментов выделенной глюкозы за 1 мин (мкмоль/мин) рассчитывают на 100 мл надосадочной жидкости исследуемых штаммов.

В качестве полисахаридных субстратов используется водорастворимый крахмал, а также экстракт пивной дробины.

Результаты и обсуждение. В данной работе представлены результаты по исследованию амилолитической, протеолитической и гидролитической активности выделенного штамма Bacillus subtilis при глубинном культивировании.

Выделенные штаммы Bacillus subtilis были исследованы на способность гидролизовать растительные полимерные углеводы, в качестве источника которых была использована пивная дробина.

Рисунок 1 показывает влияние рН на активность ферментов, вырабатываемых B. subtilis. Было установлено, что наиболее оптимальным рН для амилолитической и протеолитической активности является 9 при концентрациях 1,15 и 0,8 мг/мл/сек соответственно.

1 – амилаза; 2 - протеаза

Рисунок 1. Влияние рН на выход ферментов амилазы и протеазы, продуцируемых B.subtilis

В сравнении с глубинными стационарные культуры имели более низкий уровень гидролитических ферментов: максимальный уровень суммарной гидролитической активности штамма наблюдался на 4-й день инкубации. Сравнение значений гидролитической активности пленочных и глубинных культур показывает, что более эффективным является глубинное культивирование.

Более замедленная динамика нарастания активности ферментов гидролаз при стационарном культивировании может объясняться дополнительным временем (10-15 ч), которое требуется для формирования пленки.

Помимо суммарной гидролитической активности с использованием в качестве субстрата отвара пивной дробины была определена гидролитическая активность надосадочной жидкости штаммов в отношении крахмала (табл.1).

Таблица 1 - Активность внеклеточных гидролаз в глубинных и пленочных культурах штаммов

Скорость образования продуктов реакции (мкмоль/мин. при гидролизе различных субстратов)

Читайте также:

Протеолитические свойства микроорганизмов кратко

Предварительный просмотр:

Определение протеолитической активно­сти микробов

Основной путь метаболизма представителей кишечной флоры

Сахаролитическая микрофлора (бифидобактерии, лактобактерии)

ИЗУЧЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ, ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ И ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММ ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS SUBTILIS ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

Определение протеолитической активности микробов