Перепрограммирование стволовых клеток кратко
Обновлено: 02.07.2024
Перевод обзора Thorsten M. Schlaeger*, PhD, and Xiao Guan**, PhD, опубликованного в журнале The Hematologist в октябре 2009 г.
*Руководитель Программы по стволовым клеткам в детском госпитале Бостона (Children’s Hospital Boston), специалист Института Стволовых Клеток в Гарварде (Harvard Stem Cell Institute)
** Исполнитель Программы по стволовым клеткам в детском госпитале Бостона
Плюрипотентные стволовые клетки мыши
Характерными свойствами плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) являются их неограниченная способность к делению и к дифференцировке во все типы клеток организма. Эмбриональные стволовые клетки мыши (ЭСК) получают из раннего эпибласта (наружный слой клеток у зародыша на самых первых этапах развития). Впервые эти клетки были выделены в 1981 г. [1] и с тех пор успешно используются in vitro в качестве моделей развития млекопитающих. Ключевым моментом кроветворения является дифференциация ПСК в гемангиобласты [2], эритроциты [3], лимфо-гематопоэтические прогениторные клетки [4] и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК или КСК – кроветворные стволовые клетки) [5].
Мышиные ЭСК также служат объектом многочисленных исследований функций генов и для проверки терапевтической эффективности препаратов для лечения дегенеративных расстройств, таких как иммунодефициты [6] и серповидноклеточная анемия [7]. Следует, однако, заметить, что некоторые специфические гематологические аспекты биологии и патологии человека на мышах воспроизводятся неадекватно. Примерами этого могут послужить различные патологии, такие как анемия Фанкони, трисомия по 21 хромосоме, ассоциированная с острой миелогенной лейкемией, а также трудно диагностируемые генетические синдромы (например, тромбоцитопения и аплазия лучевой кости). Кроме того, модели на мышах зачастую неадекватно реагируют на действие ряда фармацевтических препаратов, таких как TNF-alpha (ФНО-альфа – фактор некроза опухоли альфа), IFN-gamma (интерферон гамма), EPO (эритропоэтин) и камптотецины.
Плюрипотентные стволовые клетки человека
Человеческие плюрипотентные ЭСК, выделенные из позднего эпибласта, были впервые получены в 1998 г., что стало величайшим открытием биологии за последнее десятилетие [8]. Недавно был совершен другой прорыв в науке: прямое перепрограммирование дифференцированных человеческих соматических клеток в так называемые индуцированные ПСК (иПСК) посредством усиленной экспрессии генов плюрипотентности 9. Применение иПСК вместо ЭСК снимает этические ограничения на использование эмбрионального материала. Перепрограммирование является захватывающим процессом, изучение которого, несомненно, будет продолжаться для развития понимания биологии стволовых клеток, регулирования клеточной программы, борьбы с онкологическими заболеваниями и старением.
Рисунок.
ЭСК (ESC, embryonic stem cells) человека могут быть выделены из эмбрионов, полученных путем экстракорпорального оплодотворения (1), в то время как иПСК (iPSC, induced pluripotent stem cells), могут быть получены путем прямого перепрограммирования соматических клеток, например, фибробластов кожи (2). Независимо от происхождения, эти ПСК обладают способностью давать начало всем типам соматических клеток, в том числе клеткам гемопоэтического ряда (HSC, hematopoietic stem cells) (3), благодаря чему появляется возможность изучать развитие тканей человеческого организма in vitro. Соматические клетки, полученные из ПСК, могут быть использованы как модельные объекты для изучения таких заболеваний, как лейкемия (4), для скрининга лекарственных препаратов (5) или в качестве агента клеточной терапии (6).
Использование человеческих ПСК для исследования онтогенеза гемопоэтических клеток (ГСК)
Вооружившись результатами исследований моделей на мышах, ученые получили возможность осуществить направленную дифференциацию человеческих ПСК в гемангиобласты [12], мультипотентные прогениторные клетки [13], лимфоидные клетки [14] и даже в гемопоэтические (кроветворные) стволовые клетки (ГСК) [15]. Однако все же имеется ряд проблем. Например, при дифференциации in vitro все стволовые клетки имеют тенденцию дифференцироваться, в результате чего их количество стремительно сокращается. В частности, образование зрелых эритроидных клеток или истинных ГСК пока увенчалось незначительным успехом. Более того, во многих исследованиях имеет место произвольное использование реагентов с неопределенным составом, таких как сыворотка животных или питающие (фидерные) клетки, которые могут мешать адекватной оценке процесса развития стволовых клеток и затруднять клиническое применение результатов таких наблюдений. Только сейчас мы начинаем понимать, почему отдельные линии стволовых клеток могут значительно различаться по способности образовывать специфические клоны. Этот факт ограничивает наши возможности в обобщении результатов, полученных на любом ограниченном множестве линий.
Использование человеческих ПСК для изучения заболеваний системы кроветворения и онкогенеза
Ученым удалось получить нормальные гемопоэтические прогениторные клетки с исправленным генетическим дефектом от пациентов, страдающих анемией Фанкони, используя технологию индукции плюрипотентности [16]. Кроме того, были получены и в настоящее время активно изучаются человеческие ЭСК и иПСК, выделенные из эмбрионов с врожденными генетическими дефектами и изолированные из организма пациентов с трисомией по 21 хромосоме, SCID (тяжелые комбинированные иммунодефициты), SBDS (Shwachman-Bodian-Diamond syndrome) и талассемией [17, 18]. Технологии, основанные на использовании человеческих ПСК, имеют особое значение, поскольку позволяют проводить моделирование заболеваний с неизвестной генетической этиологией, а также заболеваний, являющихся результатом соматических мутаций в отдельных тканях организма (например, лейкемия) [19]. Было бы интересно узнать, может ли многоступенчатое развитие пролиферативных нарушений быть воспроизведено in vitro и сможет ли скрининг на таких моделях способствовать усовершенствованию методов лечения. Кроме того, технология иПСК может быть использована для получения генетически разнообразных клонов человеческих клеток для тестирования токсичности лекарственных препаратов.
Терапевтическое применение человеческих ПСК
Считается, что аутологичные клетки пациента могут быть получены, подвержены в случае необходимости генетической репарации, индуцированы к дифференциации в терапевтически значимые типы клеток и затем трансплантированы для замены или улучшения качества поврежденных клеток или тканей. Полученные из ПСК гемопоэтические стволовые клетки могут быть полезны тем, кто нуждается в трансплантации костного мозга, поскольку поиск подходящего донора остается главным препятствием таких операций.
В отличие от традиционных трансплантаций костного мозга, КСК, дифференцированные из иПСК от одного здорового донора, могут быть введены нескольким реципиентам. При этом они не будут содержать лимфоцитов и, следовательно, не будут провоцировать развитие реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Дополнительными клиническими преимуществами таких КСК является индукция толерантности к солидным тканевым трансплантатам и препятствие развитию аутоиммунных реакций [20]. На сегодняшний день полученные из плюрипотентных клеток ГСК еще не вошли в клиническую практику, и в настоящее время можно говорить лишь о прогентирных глиальных клетках (предшественниках олигодендроцитов), полученных из ЭСК и проходящих клинические испытания в терапии повреждений костного мозга. Эти испытания проводит американская биотехнологическая корпорация Geron, лидер в экспериментальной терапии травм спинного мозга.
Основная задача этого пилотного испытания – оценить безопасность применения таких клеток, поскольку остаточные недифференцированные ПСК могут присутствовать в любом лекарственном препарате, произведенном на основе ПСК, и спровоцировать у реципиента появление тератом – доброкачественных опухолей, состоящих из различных дифференцированных соматических клеток [8]. По этой причине первостепенное внимание уделяется тщательной очистке дифференцированных клеток. С целью повышения безопасности клетки можно инкапсулировать или подвергать облучению накануне трансплантации, но это приведет к существенному снижению эффективности и увеличению продолжительности лечения. В то же время, эритроциты, полученные из человеческих ПСК, не теряют своей функциональной активности при облучении, уничтожающем оставшиеся в культуре недифференцированные стволовые клетки.
Терапевтические эффекты облученных эритроидных клеток неизбежно будут транзиторными, как и в случае с традиционным переливанием крови. Однако сочетание запросов клинической практики, отсутствия ограничений по HLA-совместимости и возможности достичь безопасности самой процедуры посредством облучения, вполне вероятно, будут способствовать тому, что эритроциты, полученные из ПСК, станут одним из первых успешных событий в клинической практике. В действительности их крупномасштабное производство вполне осуществимо [21], и консорциум во главе с Шотландской Государственной Службой Переливания Крови (Scottish National Blood Transfusion Service) нацелен на производство клинически значимых универсальных донорских эритроцитов [22].
Перспективы
Продвижение методов лечения, основанных на ПСК человека, сталкивается с рядом трудностей, такими как финансовые ограничения на получение и использование генетически модифицированных клеток, неопределенность перспектив по вопросу интеллектуальной собственности, неразвитость регуляторной базы в сфере таких методов лечения. Ученые пытаются найти безопасные и эффективные методы производства специфических для пациентов ЭСК или иПСК, а также их эффективной последующей дифференцировки в пригодные для трансплантации клетки.
В других публикациях авторы ставят вопрос о том, равноценны ли человеческие иПСК обыкновенным ЭСК (имеются доказательства, что такие различия существуют и это требует дальнейшего изучения), а также обращают внимание на недостаток данных долгосрочных клинических испытаний. Однако, несмотря на то, что эти трудности, вместе взятые, могут быть препятствием на пути продвижения новой технологии, каждая из них по отдельности может быть преодолена. Следует вспомнить, что от первого этапа разработки моноклональных антител до их успешного широкомасштабного применения в клинической практике прошло несколько десятилетий. При достаточном количестве времени и финансовых вложений технология, основанная на использовании ПСК человека, может совершить революционный переворот в регенеративной медицине.
Новость
Колонии человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека, полученные из клеток кожи
William Collins, Gladstone Institutes
Автор
Редакторы
Предыстория
Перепрограммирование с помощью ядра соматической клетки
Рисунок 2. Перепрограммирование ядра клетки эпителия лягушки. Гардон использовал ультрафиолет, чтобы разрушить ядро икринки лягушки (1), а потом пересаживал туда другое ядро, полученное из эпителия головастика (2). В большинстве случаев клетки погибли, однако несколько из них развились в головастиков и затем — во взрослых лягушек (3). Этот опыт подтвердил, что генетическая информация сохраняется неизменной на протяжении всего срока жизни клетки, и может в подходящих условиях быть задействована вновь. Более поздние исследования, основанные на том же принципе, привели к клонированию млекопитающих (4).
Атака клонов
Эра перепрограммированных клеток
Лаборатория Яманаки работала над поиском факторов, поддерживающих в ЭСК программу плюрипотентности. Было найдено несколько десятков генов, активность которых в ЭСК была намного выше, чем в дифференцированных клетках, и, кроме того, уже открыли, что слияние ЭСК и специализированной клетки может дать две плюрипотентные клетки [8].
Рисунок 3. Способ перепрограммирования специализированной клетки в стволовую. Начиная с набора 24 транскрипционных факторов и постепенно сужая этот перечень (1), Такахаши и Яманака установили, что всего четыре гена (Myc, Oct3/4, Sox2 и Klf4) могут преобразить фибробласт, вернув его в состояние плюрипотентности (2) [9]. Полученные ИПСК (3) могут давать начало тератомам, что используется как маркер плюрипотентной клетки, а также использоваться в технологии получения химерных мышей (традиционно, для этого использовали ЭСК [7]).
Перспективы использования стволовых клеток в медицине
С момента появления технология получения ИПСК была существенно усовершенствована. В частности, теперь не нужно использовать векторы на основе ретровирусов, которые встраиваются в произвольное место генома и могут повредить его или даже запустить программу онкологической трансформации. Теперь используют аденовирусы или другие вирусные векторы, не встраивающиеся в хромосомы, а также РНК, белковые транскрипционные факторы и эписомальные плазмиды. В некоторых случаях число перепрограммирующих факторов можно снизить до одного — например, нейрональные стволовые клетки мыши превращаются в ИПСК введением одного только фактора Oct4 [12].
Открытие Яманаки также сообщило новый импульс поиску способов трансдифференцировки — то есть, превращению одного типа клеток в другой, минуя стадию стволовых клеток. Это возвращает нас в 1960–80-е годы, к работам по имагинальному диску дрозофилы и к таким генам как Antennapedia, MyoD, GATA1 и Pax5. В частности, уже тогда удалось превратить фибробласты в миобласты активацией гена MyoD [13]. Под впечатлением от работ Яманаки быстро нашли способ превратить экзокринные клетки поджелудочной железы в эндокринные [14], а фибробласты — в кардиомиоциты [15]. Есть даже пример превращения друг в друга клеток разных зародышевых листков — мезодермальных фибробластов в эктодермальные нейроны (на что потребовалось три транскрипционных фактора) [16].
Другая перспектива, уже ставшая твердой действительностью, — возможность получать линии бессмертных клеток (ИПСК), соответствующих различным редким генетическим заболеваниям, и изучать как саму болезнь, так и действие на нее разрабатываемых лекарственных средств (рис. 4) [18]. ИПСК уже получены для таких заболеваний как амиотрофический латеральный склероз (болезнь Шарко), синдром Ретта, спинальная мышечная атрофия (СМА), недостаточность антитрипсина α1, семейная гиперхолестеринемия, а также для различных кардиологических заболеваний. В некоторых из этих клеточных моделей удается связать наблюдаемый фенотип с болезнью: в частности, в случае клеток из СМА, это затухание функций моторных нейронов. Некоторый прогресс есть даже в изучении заболеваний со сложной генетикой, таких как шизофрения.
Рисунок 4. ИПСК в медицине. Из тканей пациентов, страдающих различными заболеваниями, можно выделить соответствующие клетки и превратить их в ИПСК. Колонии этих клеток можно дифференцировать в другие типы клеток и использовать их в лечении, или же изучать на них болезнь и действие лекарств.
Открытие того, что зрелые дифференцированные клетки можно вернуть в плюрипотентное состояние или даже, минуя его, превратить один тип клеток в другой, стало поворотным в эмбриологии, биологии развития и всей молекулярной биологии. Это знание уже осветило все уголки физиологии и медицины, и практические применения в виде новых видов лечения наверняка не заставят себя ждать.
Стволовые клетки разделяют на эмбриональные и стволовые клетки взрослого организма. Актуальность использования стволовых клеток в клинической практике в последние годы получает новые подтверждения, однако способы получения эмбриональных стволовых клеток для медицинских целей вызывают этическое неприятие. Альтернативой стволовым клеткам служат индуцированные плюрипотентные клетки, мультипотенциальные и сравнимые по свойствам с эмбриональными стволовыми клетками, но с дополнительными преимуществами: их получение позволяет исключить многие этические проблемы, связанные с использованием эмбрионального материала, их применение снижает риск иммунного отторжения. Возможность перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки открывает огромные перспективы для регенеративной медицины. Применение метода направленного перепрограммирования позволяет получать из индуцированных стволовых клеток пациента практически любые типы клеток для аутологичной клеточной терапии. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки также могут использоваться для моделирования заболеваний человека и скрининга лекарственных средств. Тем не менее существует еще ряд препятствий, которые необходимо преодолеть, прежде чем использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток войдет в повседневную практику. В настоящем обзоре рассматриваются история создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и последние достижения в области перепрограммирования соматических клеток, а также проблемы, которые необходимо преодолеть, чтобы применять эту стратегию в клинической практике.
Ключевые слова
Об авторах
Список литературы
1. Audouy S., Hoekstra D. Cationic lipid-mediated transfection in vitro and in vivo (review) // Mol. Membr. Biol. 2001. 18. (2). 129-143.
3. Briggs R., King T.J. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs’ eggs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1952. 38. (5). 455-463.
4. Bunnell B.A., Flaat M., Gagliardi C., Patel B., Ripoll C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation // Methods. 2008. 45. (2). 115-120.
5. Chin M.H., Mason M.J., Xie W., Volinia S., Singer M., Peterson C., Ambartsumyan G., Aimiuwu O., Richter L., Zhang J., Khvorostov I., Ott V., Grunstein M., Lavon N., Benvenisty N., Croce C.M., Clark A.T., Baxter T., Pyle A.D., Teitell M.A., Pelegrini M., Plath K., Lowry W.E. Induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells are distinguished by gene expression signatures // Cell Stem Cell. 2009. 5. 111-123.
7. Cieslar-Pobuda A., Knoflach V., Ringh M.V., Stark J., Likus W., Siemianowicz K., Ghavami S., Hudecki A., Green J.L., Łos M.J. Transdifferentiation and reprogramming: Overview of the processes, their similarities and differences // Biochim. Biophys. Acta. 2017. 1864. (7). 1359-1369.
8. De Vries W.N., Evsikov A.V., Brogan L.J., Anderson C.P., Graber J.H., Knowles B.B., Solter D. Reprogramming and differentiation in mammals: motifs and mechanisms // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2008. 73. 33-38.
10. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981. 292. 154-156.
11. Fu J.D., Stone N.R., Liu L., Delgado-Olguin P., Ding S., Bruneau B.G., Srivastava D. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state // Stem Cell Reports. 2013. 1. (3). 235-247.
13. Gopalakrishnan S., Hor P., Ichida J.K. New approaches for direct conversion of patient fibroblasts into neural cells // Brain Res. 2017. 1656. 2-13.
15. He T.C., Zhou S., da Costa L.T., Yu J., Kinzler K.W., Vogelstein B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95. 2509-2514.
16. Holtkamp S., Kreiter S., Selmi A., Simon P., Koslowski M., Huber C., Türeci O., Sahin U. Modification of antigen-encoding RNA increases stability, translational efficacy, and T-cell stimulatory capacity of dendritic cells // Blood. 2006. 108. (13). 4009-4017.
17. Jia F., Wilson K.D., Sun N., Gupta D.M., Huang M., Li Z., Panetta N.J., Chen Z.Y., Robbins R.C., Kay M.A., Longaker M.T., Wu J.C. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells // Nat. Methods. 2010. 7. (3). 197-199.
18. Jungverdorben J., Till A., Brustle O. Induced pluripotent stem cell-based modeling of neurodegenerative diseases: a focus on autophagy // J. Mol. Med. 2017. 95. (7). 705-718.
19. Kumano K., Arai S., Hosoi M., Taoka K., Takayama N., Otsu M., Nagae G., Ueda K., Nakazaki K., Kamikubo Y., Eto K., Aburatani H., Nakauchi H., Kurokawa M. Generation of induced pluripotent stem cells from primary chronic myelogenous leukemia patient samples // Blood. 2012. 119. (26). 6234-6242.
20. Li X., Zhang P., Wei C., Zhang Y. Generation of pluripotent stem cells via protein transduction // J. Dev. Biol. 2014. 58. 21-27.
21. Liu H., Zhaohui Y., Kim Y., Sharkis S., Jang Y.Y. Generation of endoderm-derived human induced pluripotent stem cells from primary hepatocytes // Hepatology. 2010. 51. (5). 1810-1819.
22. Markoulaki S., Hanna J., Beard C., Carey B.W., Cheng A.W., Lengner C.J., Dausman J.A., Fu D., Gao Q., Wu S., Cassady J.P., Jaenisch R. Transgenic mice with defined combinations of drug-inducible reprogramming factors // Nat. Biotechnol. 2009. 27. 169-171.
23. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. 78. 7634-8.
24. Maureen L. Condic totipotency: What it is and what it is not // Stem Cells Dev. 2014. 23. (8). 796-812.
25. Mendez-Ferrer S., Scadden D.T., Sanchez-Aguilera A. Bone marrow stem cells: Current and emerging concepts // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2015. 1335. 32-44.
26. Meraviglia V., Zanon A., Lavdas A.A., Schwienbacher C., Silipigni R., Di Segni M., Chen H.S., Pramstaller P.P., Hicks A.A., Rossini A. Generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids // J. Vis. Exp. 2015. 100. e52885.
27. Mitalipov S., Wolf D. Totipotency, pluripotency and nuclear reprogramming // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2009. 114. 185-199.
28. Nakhaei-Rad S., Bahrami A.R., Mirahmadi M., Matin M.M. New windows to enhance direct reprogramming of somatic cells towards induced pluripotent stem cells // Biochem. Cell Biol. 2012. 90. (2). 115-123.
29. Novak A., Shtrichman R., Germanguz I., Segev H., Zeevi-Levin N., Fishman B., Mandel Y.E., Barad L., Domev H., Kotton D., Mostoslavsky G., Binah O., Itskovitz-Eldor J. Enhanced reprogramming and cardiac differentiation of human keratinocytes derived from plucked hair follicles, using a single excisable lentivirus // Cell. Reprogram. 2010. 12. (6). 665-678.
30. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells // Nature. 2007. 448. 313-7.
31. Okita K., Nakagawa M., Hyenjong H., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors // Science. 2008. 322. (5903). 949-953.
33. Pasque V., Karnik R., Chronis C., Petrella P., Langerman J., Bonora G., Song J., Vanheer L., Sadhu Dimashkie A., Meissner A., Plath K. X Chromosome dosage influences DNA methylation dynamics during reprogramming to mouse iPSCs // Stem Cell Reports. 2018. 10. (5). 1537-1550.
34. Rajaei B., Shamsara M., Amirabad L.M., Massumi M., Sanati M.H. Pancreatic endoderm-derived from diabetic patient-specific induced pluripotent stem cell generates glucose-responsive insulin-secreting cells // J. Cell. Physiol. 2017. 232. (10). 2616-2625.
35. Rivera T., Haggblom C., Cosconati S., Karlseder J. A balance between elongation and trimming regulates telomere stability in stem cells // Nat. Struct. Mol. Biol. 2017. 24. (1). 30-39.
36. Sandmaier S.E.S., Telugu B.P.L. MicroRNA-mediated reprogramming of somatic cells into induced pluripotent stem cells // Cell. Reprogram. 2015. 1330. 29-36.
38. Shizuru J.A., NegrinR. S., Weissman I.L. Hematopoietic stem and progenitor cells: Clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system // Annu. Rev. Med. 2005. 56. 509-538.
39. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007. 131. (5). 861-872.
40. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. 126. 663-676.
41. Takahashi K., Yamanaka S. A developmental framework for induced pluripotency // Development. 2015. 142. 3274-3285.
В данном обзоре рассматриваются возможности использования в медицине метода репрограммирования взрослых стволовых клеток человека в плюрипотентные (пребывающие в состоянии неполной дифференцировки). Именно плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) обладают способностью при дальнейшем их развитии преобразовываться в структурные компоненты любых органов и систем. Данные клетки не могут развиться в полноценный организм (эмбрион), что сразу же исключает этический барьер как тормозящий фактор в такого рода исследованиях. Метод индукции репрограммирования стволовых клеток (ИРСК) содержит в себе огромный потенциал для дальнейшего развития терапевтического клонирования как перспективного медицинского направления.
2. Masako Tada, Yousuke Takahama, Kuniya Abe, Norio Nakatsuji, Takashi Tada. (2001). Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Current Biology. 11, 1553-1558;
4. Кузьмина Е.Ю. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для геннотерапевтической модели мыши: выпускная квалификационная работа бакалавра. Санкт-Петербург, 2016. 51 с.
Введение. Современная медицина активно разрабатывает и внедряет в практику разнообразные биотехнологии, которые открывают возможности для более полной и точной диагностики и лечения патологических состояний, ранее недоступных для коррекции. Идея регенеративной терапии различных заболеваний с использованием стволовых клеток - одно из магистральных направлений медицинской науки. К перспективным технологиям в контексте данного направления относится терапевтическое клонирование.
Терапевтическое клонирование заключается в получении пациент-специфичных линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), обладающих колоссальными возможностями в поддержании и восстановлении здоровья человека. С биологической точки зрения, терапевтическое клонирование – это то же репродуктивное клонирование, но с ограниченным (до 14 дней) сроком роста эмбриона. По прошествии обозначенного временного промежутка процесс размножения клеток приостанавливается. Название метода предопределено тем, что образующиеся в течение двух недель эмбриональные клетки способны в дальнейшем преобразоваться в дифференцированные клетки различных органов: сердца, печени, поджелудочной железы, почек и т.д. Этот факт благоприятствует использованию данного метода в медицине для терапии многих заболеваний [5].
Выделяя стволовые клетки из эмбриона, срок жизни которого не более 3 - 4 дней, их дальнейший алгоритм развития в лабораторных условиях можно спроектировать в любом направлении. В теории, стволовые клетки способны дать начало любой структуре тела человека, способной заместить патологически изменный фрагмент или даже орган. В том случае, если они получены из тканей, взятых у человека, которому выращивают трансплантат (аутотрансплантация), также решается проблема гистосовместимости при пересадке.
Технология искусственного получения эмбриональных стволовых клеток с помощью клонирования активно разрабатывается в комплексе с биохимическими направлениями по созданию специальных питательных сред для культивирования живых тканей.
При ПЯСК осуществляется перенос ядра, извлеченного из соматической клетки пациента, в цитоплазму энуклеированного ооцита, находящегося в метафазе второго деления мейоза. Как результат, развивающийся эмбрион будет генетической копией донора ядра. По достижении стадии бластоцисты, из ее клеточной массы выделяют клонированные ЭСК и производят исследования свойств полученных клеточных культур [1, с. 207].
Проведение экспериментов с использованием яйцеклеток человека затрудняют различные проблемы этического и биомедицинского характера. Это законодательные нюансы, связанные с получением разрешений регулирующих органов, проблема оценки качества образовавшихся в организме клеток, риск возникновения мутаций при генно-инженерных манипуляциях и т.д.
Разработка методик формирования линий стволовых клеток человека, несущих генетический материал пациента (полученных методом ПЯСК), откроет широкие перспективы для дальнейших исследований в области клеточной терапии.
Индукция репрограммирования стволовых клеток (ИРСК) человека в плюрипотентные стволовые клетки происходит при внедрении в клетки исходной культуры генов плюрипотентности, способных вернуть взрослые клетки в эмбриональное состояние.
Лаборатория японского учёного С. Яманаки работала над поиском факторов, поддерживающих в ЭСК программу плюрипотентности. Было найдено несколько десятков генов, активность которых в ЭСК была намного выше, чем в дифференцированных клетках. К моменту исследования уже был открыт и тот факт, что слияние ЭСК и специализированной клетки может дать две плюрипотентные клетки [2].
Вооруженная этим знанием, группа учёных внедрила в клетку фибробласта вектор с 24 генами, заставившими часть клеток дать колонии, подобные стволовым клеткам, и принялась по одному удалять гены из этого набора. В результате был установлен список из четырех генов: c-Myc, Oct4, Sox2 и Klf4 (Nanog и Lin28). Стоит отметить, что схема репрограммирования основана на внедрении в культуру соматических клеток человека ретровирусов, несущих такой генный набор. Полученные клетки, названные индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК), возникли в результате вышеупомянутой процедуры, имеющей крайне низкий выход, однако применяемые технологии селекции позволяют обнаружить даже одну перепрограммированную клетку на сотни тысяч. Далее последовала серия работ этой и других лабораторий, в которых исследователи оптимизировали состав перепрограммирующих факторов и способ введения вектора в клетку, чтобы повысить эффективность перепрограммирования и снизить вероятность образования опухолевых клеток в результате вызываемой метаморфозы [3].
Гены Sox2 и Oct4 кодируют ключевые белки, необходимые для пролиферации (деления) и поддержания плюрипотентности стволовых клеток. Продукты генов c-Myc и Klf4 способствуют активации Sox2 и Oct4. Ген c-Myc является протоонкогеном: при его гиперэкспрессии может происходить злокачественная трансформация нормальных клеток. Продукт гена Nanog требуется для индукции плюрипотентности соматических клеток. В последних исследованиях была показана целесообразность замены c-Myc и Klf4 на Lin28 и Nanog. Дальнейшую селекцию культур ИПС клеток проводят по соответствию морфологических (компактность колоний, высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение и т.д.), иммуногистохимических и генетических характеристик с ЭСК человека [4, с. 9].
Получение стволовых клеток методами ИРСК и ПЯСК не является равноценными и по технологии, и по возможным осложнениям. Применение в клеточной терапии методик, основанных на использовании ретровирусной трансфекции и внесения в клетки протоонкогенов, может представлять опасность. Несмотря на то, что сторонники метода ИРСК уверяют, что указанные проблемы легко преодолимы, сторонники ПЯСК убеждены в необходимости ускорения исследований в наиболее спорных направлениях (использование яйцеклеток человека в ПЯСК и т.д.) для скорейшего внедрения методики переноса ядра, как наиболее перспективной и безопасной. Наряду с этим, пока недостаточно проработаны гарантии безопасности биологического материала при генно-инженерных манипуляциях. Для успешного развития и внедрения в медицинскую практику данных технологий требуется не только детальная разработка вариантов самой методики, но и определение чётких показаний и противопоказаний для ее применения. Кроме того, необходимо наличие совершенных критериев оценки и методов коррекции отдаленных результатов, обучение высококвалифицированных специалистов, совершенствование материальной базы клиник и законодательной базы.
Тем не менее, несмотря на имеющиеся сложности, терапевтическое клонирование отмечается большинством специалистов как одно из наиболее перспективных направлений в заместительной клеточной терапии и, в целом, в мировой научной практике. Важнейшей потребностью сейчас является получение законодательного разрешения на проведение исследований, способствующих стремительному развитию данного направления, и преодоление уже выявленных недостатков и сложностей биомедицинского характера.
Читайте также: