Особенности окраски микроорганизмов кратко

Обновлено: 02.07.2024

Вложенные файлы: 1 файл

Okraska_mikroorganizmov.doc

Окраска микроорганизмов — наиболее распространенный в микробиологии комплекс методов и приемов, применяемый для обнаружения и идентификации микроорганизмов с помощью микроскопа. В естественном состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы при микроскопическом исследовании. Окрашенные клетки наоборот четко видны. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы в процессе обработки инактивируются, что делает препарат безопасным для исследователя. Окраска микроорганизмов позволяет изучить морфологические особенности микробов, а иногда точно определить их вид, например некоторые микробы — одинаковые по морфологии — различно окрашиваются с помощью одних и тех же сложных методов окраски. Окраска микроорганизмов представляет собой физико-химический процесс соединения химических компонентов клетки с краской. Отношение к различным красителям и методам окраски называют тинкториальными свойствами микроорганизмов. В ряде случаев различные части микробной клетки (ядро, цитоплазма) избирательно окрашиваются различными красителями. Наиболее пригодными для окраски микроорганизмов являются анилиновые красители, которые дифференцируют на основные и кислые. У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску, служит катион, у кислых - анион, а структуры бактерий, взаимодействующие с красителем, преимущественно отрицательно заряжены и поэтому лучше воспринимают основные красители.

Основные красители : красные (нейтральный красный, пиронин, сафранин, основной фуксин); фиолетовые (генциан фиолетовый, кристаллический фиолетовый, гематоксилин, тионин); синие (виктория, метиленовый синий); зелёные (малахитовый зелёный, метиленовый зелёный, янус зелёный); коричневые (везувин, хризоидин); чёрные (индулин).
Кислые красители : розовые и красные (кислый фуксин, эозин, эритрозин, гропеолин); жёлтые (аурантил, конго, пикриновая кислота); чёрные (нигрозин).
Спиртовые растворы : карболовый фуксин Циля; фуксин Пфейффера; карболовый кристаллический фиолетовый; щелочной метиленовый синий Леффлера.
Водные растворы : раствор сафранина; раствор малахитового (бриллиантового) зелёного; раствор Люголя.

Приготовление окрашенного препарата включает ряд этапов:

приготовление мазка;
высушивание мазка;
фиксацию мазка;
окраску;
высушивание.

Мазок готовят на чистых предметных стеклах, на середину которых наносят небольшую каплю воды и в нее с помощью бактериологической петли помещают исследуемый материал. Материал распределяют на стекле равномерным тонким слоем, размер мазка —1—2 см2.
Препарат обычно высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки.
Высушенный мазок подвергается фиксации, при которой мазок прикрепляется к стеклу (фиксируется), а микробы становятся более восприимчивыми к окраске. Способов фиксации много. Наиболее простой и распространенный физический — фиксация жаром — нагревание на пламени горелки (препарат проводят несколько раз через наиболее горячую часть пламени горелки). В ряде случаев прибегают к фиксации жидкостями (этиловый или метиловый спирт, ацетон, смесь равных объемов спирта и эфира — по Никифорову) - химический способ. После фиксации мазок окрашивают. Количество краски, наносимое на препарат, должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка. По истечении срока окрашивания (2—5 мин.) краску дистиллированной водой, препарат подсушивают фильтровальной бумагой или на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную — фуксин, или синюю — метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1—2 мин.), метиленовый синий — медленнее (3—5 мин.). Фуксин приготовляют в виде концентрированного карболового раствора (фуксин Циля), очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. Метиленовый синий приготовляется заранее в насыщенном спиртовом растворе, который стоек и может долго храниться.
Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней.
Наибольшее практическое значение имеет окраска по методу Грама и окраска по методу Циля-Нильсена.

СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ.

Окраска по методу Грама:

На фиксированный на огне мазок помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором генциан-, метил- или кристаллвиолета (бумажки по Синеву), наносят на неё несколько капель дистиллированной воды для увлажнения, выдерживают 1-2 мин., бумажку удаляют.
Препарат, не промывая, обрабатывают раствором Люголя на 1-2 мин. Мазок приобретает серо-бурую окраску.
Сливают раствор Люголя.
Для обесцвечивания вносят несколько капель 96%-ного этанола на 1-2 мин.; следят, чтобы он равномерно распределился по поверхности всего мазка.
Препарат тщательно промывают водой.
Докрашивают фуксином Пфейффера 1-2 мин.
Бумажку снимают, препарат промывают водой.
Промывают водой, высушивают, микроскопируют.

Результат окраски: грамположительные бактерии окрашиваются основной краской в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.

Основная сложность окраски по методу Грама - опасность переобесцвечивания препарата этанолом.

Окраска по методу Циля-Нильсена:

Фиксированный на пламени горелки мазок окрашива ют в течение 3 – 5 мин. раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения.
Дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой.
Окрашенный препарат обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты в течение 3 – 5 с или 96° этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты, несколько раз погружая стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом.
После обесцвечивания остаток кислоты сливают и тщательно промывают препарат водой.
Докрашивают дополнительно метиленовым синим Леффлера 3 – 5 мин.
Окрашенный препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров.

Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава.

2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают.

3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты.

Серная кислота-обесцвечивающий фактор.

4. Промывают водой

5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут

Синька Леффлера — дополнительная краска

6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией

Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора — синего цвета

Метод окраски по Цилю является основным для окраски кислотоустойчивых бактерий, которые при окраске препаратов окрашиваются фуксином в рубиново-красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты обесцвечиваются и приобретают цвет дополнительного красителя (синий).

МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ВЫЯВЛЕНИЯ СПОР, КАПСУЛ, ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ВКЛЮЧЕНИЙ.

Спора - особая форма существования грамположительных бактерий. Споры с большим трудом воспринимают красители, но прочно удерживают их после окраски. На этой особенности спор основаны все методы их выявления.

Окраска по методу Мёллера:

1. Фиксированные мазки помещают на 2 мин. в хлороформ.

2. Переносят в 5 % водный раствор хромовой кислоты на 2 — 10 мин.

3. Промывают в проточной воде и окрашивают карболовым фуксином 1 мин (стекло при этом подогревают на горелке до появления паров).

4. Дифференцируют в 5 % серной кислоте 5 с.

5. Хорошо промывают в проточной воде и подкрашивают водным раствором метиленового синего 3 мин.

6. Промывают в проточной воде, сушат и изучают при иммерсии.

Результат: споры окрашиваются в розово-красный цвет, вегетативные клетки — в синий.

Окраска по методу Пешкова для выявления спор:

Фиксированный мазок окрашивают метиленовым синим с подогреванием до закипания.

Препарат промывают водой.

Докрашивают 1%-ным водным раствором нейтральрота в течение 10 с.
Препарат промывают водой и высушивают.

Результат: споры синие, вегетативные клетки красные.

Окраска по методу Вальдмана:

На фиксированный мазок наносят щелочную синьку Леффлера и нагревают до кипения.
Дают остыть и промывают водой.
Докрашивают 1%-ным раствором нейтрарольта 30 с.
Промывают водой и просушивают.

Результат: споры синие, вегетативные клетки красные.

Окраска по методу Ауески:

Нефиксированный мазок обрабатывают 0,5%-ным раствором соляной кислоты 2-3 мин. при подогревании.
Промывают водой и фиксируют над пламенем.
Окрашивают карболовым фуксином Циля при подогревании 7-8 мин.
Краску сливают и препарат обрабатывают 5%-ным раствором серной кислоты 5-7 мин.
Промывают водой и докрашивают метиленовым синим 4-5 мин.
Вновь промывают водой и подсушивают.

Результат: споры красные, вегетативные клетки синие.

Окраска по методу Шеффера-Фултона:

Фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой.
Наливают 0,5%-ный водный раствор малахитовой зелени и выдерживают 5 мин. над кипящей водой.
Промывают водой и окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина 30 с.
Препарат промывают водой, подсушивают.

Капсула - это слизистое образование, обволакивающее летку и сохраняющее связь с клеточной стенкой. Вещество капсулы обычно воспринимает красители слабее, чем другие клеточные компоненты, поэтому при специальных методах окраски можно дифференцировать капсулу от остальных структур.

Окраска по методу Романовского-Гимза

Препарат, фиксированный в этаноле или жи дкости Никифорова, кладут мазком вниз в чашку Петри с подставками.
Под препарат наливают краску Романовского-Гимзы (15-20 капель на 10 мл дистиллированной воды).
Выдерживают 15-20 минут.
Препарат промывают водой, подсушивают.

Краска Романовского-Гимза состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Она окрашивает протоплазму форменных элементов ткани в голубовато-синий цвет, а ядра клеток, также как и микробные тела, в фиолетово-красный.

Окраска по методу Нейссера для выявления зерен волютина

Фиксированный на пламени горелки мазок окрашива ют 1 – 2 мин. синькой Нейссера.
Синьку сливают, на препарат наносят несколько капель раствора Люголя на 1 мин.
Мазок промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой.
Докрашивают в течение 2 мин. раствором хризоидина или 1 – 3 мин. раствором везувина.
Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

Зерна волютина окрашиваются в синий цвет, тела микробных клеток – в светло-коричневый цвет.

Окраска микроорганизмов (крашение микробов) — комплекс методов и приёмов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов. Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл. Без окраски микробы, кроме некоторых грибов, в световой микроскоп практически не видны, вследствие их малой контрастности. После обработки мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.

Содержание

Общие сведения о методе

Препараты микробов подвергают действию химических реагентов, обычно — красителей, или тетраоксида осмия. В результате физико-химического процесса взаимодействия красителя с химическими соединениями объектов, с целью искусственного придания ему определённой окраски, появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны (см. окраска по Граму).

Способы крашения разделяют на витальный, поствитальный и негативный, последний может быть витальным и поствитальным.

Витальный способ окраски

Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры. Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.

Поствитальные способы окраски

Способы окраски фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые и сложные. При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.
Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.
Из сложных способов окрашивания бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю — Нельсону, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского — Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу — Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю — Нельсону и др.
Для окраски простейших применяют способ Романовского — Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.
Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля — Нельсона, Леффлера, Романовского — Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.

См. также

Wikimedia Foundation . 2010 .

Полезное

Смотреть что такое "Окраска микроорганизмов" в других словарях:

Окраска микроорганизмов — один из широко применяемых методов микробиологической техники (См. Микробиологическая техника), заключающийся в окраске фиксированных клеток микроорганизмов специальными красителями. Вначале в каплю воды, находящуюся на предметном или… … Большая советская энциклопедия

ОКРАСКА МИКРООРГАНИЗМОВ — окраска микроорганизмов, метод бактериологического исследования, применяемый для обнаружения и изучения микробов при микроскопировании препаратов. Последние могут быть приготовлены из культур микробов или нативного материала тканей органов … Ветеринарный энциклопедический словарь

Окраска — свойство предметов отражать, переизлучать и рассеивать свет, определяющее их визуальное восприятие цвет, воспринимаемый человеком в определённых условиях. Термин окраска не является синонимом слова цвет; он имеет более специальный смысл, нежели… … Википедия

ОКРАСКА — (микроорганизмов). Мазок на предметном или покровном стекле высушивается на воздухе; высушивание над пламенем не рекомендуется, допускается лишь помещение препарата вблизи пламени. Высушенный препарат фиксируется троекратным проведением через… … Большая медицинская энциклопедия

окраска почвы — обусловлена присутствующими в ней минеральными и органическими соединениями и протекающими процессами. Так, серая или тёмно серая окраска вызвана присутствием гуминовых веществ; бурые, красноватые тона связаны с оксидами железа. Сизая,… … Географическая энциклопедия

Окраска по Цилю-Нильсену — Изображение Mycobacterium tuberculosis, полученное с помощью метода Циля Нельсена Метод окраски по Цилю Нельсену метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры),… … Википедия

Окраска по Граму — Метод Грама метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом. По Граму бактерии окрашивают основными… … Википедия

Циля-Нельсена окраска — (F. Ziehl, 1857 1926, нем. бактериолог; F. К. A. Neelsen, 1854 1894, нем. патологоанатом) метод окраски кислотоустойчивых микроорганизмов нагретым карболовым фуксином Циля с последующим обесцвечиванием серной кислотой и этиловым спиртом и… … Большой медицинский словарь

Крашение микробов — Окраска микроорганизмов (крашение микробов) комплекс методов и приемов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов. Метод широко используют в… … Википедия

Окрашивание микробов — Окраска микроорганизмов (крашение микробов) комплекс методов и приемов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов. Метод широко используют в… … Википедия

Приготовление окрашенного препарата включает ряд этапов: 1) приготовление мазка; 2) высушивание мазка; 3) фиксацию мазка; 4) окраску; 5) высушивание.

Препарат обычно высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки.

Высушенный мазок подвергается фиксации, при которой мазок прикрепляется к стеклу (фиксируется), а микробы становятся более восприимчивыми к окраске. Способов фиксации много. Наиболее простой и распространенный — фиксация жаром — нагревание на пламени горелки (препарат проводят несколько раз через наиболее горячую часть пламени горелки). В ряде случаев прибегают к фиксации жидкостями (этиловый или метиловый спирт, ацетон, смесь равных объемов спирта и эфира — по Никифорову). После фиксации мазок окрашивают. Количество краски, наносимое на препарат, должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка. По истечении срока окрашивания (2—5 мин.) краску сливают и препарат промывают водой.

Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней.

Наибольшее практическое значение имеет окраска по Граму (см. Грома метод окраски) и окраска по Цилю.

Метод окраски по Цилю является основным для окраски кислотоустойчивых бактерий. Здесь применяются два красителя: карболовый фуксин Циля и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, все некислотоустойчивые формы — в синий.

Метод Бениньетти является одним из способов окраски жгутиков. Протрава и окраска одним из красящих растворов, составляемых ex tempore (по мере надобности): I — сульфат цинка — 1 г, танин — 10 г, дистиллированная вода — 100 мл и II — насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета. Смешивают 5 мл раствора I и 3 мл раствора II, наносят на препарат, нагревают до появления паров, промывают водой, высушивают и рассматривают.

Из других сложных методов применяется так называемый негативный способ Бурри (см. Бурри метод), способ Гинса для выявления капсул (см. Гинса метод) и ряд других. См. также Бактериологическое исследование.

Окраска микроорганизмов — комплекс методов изучения структуры и морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур или исследуемого материала. Окраска микроорганизмов — важный диагностический прием, позволяющий установить морфологические особенности микроба, а также различить морфологически идентичные микроорганизмы, которые по-разному красятся при использовании одних и тех же методов окраски.

Окраска микроорганизмов — сложный физико-химический процесс, механизм которого в деталях еще не изучен. В основе окраски микроорганизмов лежит взаимодействие отдельных структур бактерии с красителем. Следовательно, результат окраски микроорганизмов зависит от химического и физического строения микробов, свойств красителя, способа приготовления препарата и метода обработки им микроба. Для окраски микроорганизмов используют основные, кислые и нейтральные красители. У основных красителей окрашивающим началом служит катион, а анион бесцветен; у кислых, наоборот, красящая часть молекулы является анионом. Образующиеся при диссоциации основных красителей катионы соединяются со структурами бактерий, обладающими кислыми свойствами; освобождающиеся анионы кислых красителей соединяются со структурами микроорганизма, имеющими основные свойства.

В обычных средах бактерии имеют отрицательный поверхностный заряд, в их цитоплазме и ядре имеются соединения кислой природы. Поэтому основные красители, у которых красящая часть молекулы заряжена положительно, обладают большим сродством к бактерии и чаще применяются в микробиологии, чем кислые красители, обычно используемые для контрастной окраски фона препарата. У нейтральных красителей красящими являются и катионы, и анионы (краска Романовского — Гимзы).

Фиксированные бактерии окрашиваются лучше живых, так как клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана живой клетки ограничивают проникновение в нее красителя. Для витальной окраски микроорганизмов (окраски живых микроорганизмов) красители применяют в больших разведениях (1:10 000— 1:100 000), чтобы избежать артефактов, появляющихся в результате токсического действия красителя на живые микроорганизмы. Чаще всего для витальной окраски микроорганизмов пользуются метиленовым сипим, нейтральным красным и др. Препараты для микроскопии готовят методом раздавленной капли. (см.) или висячей капли (см.).

Наиболее распространены методы окраски микроорганизмов в фиксированных препаратах. Эти методы подразделяют на простые и сложные. При простых методах применяют один краситель (например, окраску метиленовым синим, фуксином Пфейфера и др.). При сложных методах применяют несколько красителей и исследование включает несколько этапов физической и химической обработки препарата (см. Грама метод окраски, окраска по Цилю — Нельсену — см. Туберкулез; окраска по. Романовскому — Гимзе — см. Кровь и др.). Сложные методы окраски микроорганизмов используют в микробиологической диагностике для изучения строения и функций микроорганизмов. Например, при помощи окраски по Граму дифференцируют грамположительные микробы от грамотрицательных, что имеет большое значение для идентификации гонококков, менингококков, кишечных бактерий и др. Методом Циля — Нельсена; пользуются для диагностики туберкулеза и проказы, методом Ненесера — дифтерии.

В качестве примера использования окраски микроорганизмов для изучения строения и функций микроорганизмов можно указать на применение йода для выявления крахмала, виктории синей — для избирательной окраски клеточной стенки и цитоплазматиической мембраны бактерий, осмиевой кислоты — для окраски жира и т. д. Эти методы основаны на различиях в химическом строении отдельных морфологических структур микроба, избирательно окрашиваемых различными красителями.

Другие методы окраски отдельных структур микроорганизмов основаны на способности этих структур по-разному фиксировать красители, что выявляется при последующей обработке препарата спиртом, кислотой, ацетоном и др. и докрашивании контрастным красителем. Так, для обнаружения спор используют их свойство прочно фиксировать краситель и не обесцвечиваться при последующей обработке кислотой. При окраске бактерий по Граму основными красителями (генциановый фиолетовый и др.) с последующей обработкой йодом в одних микроорганизмах (грамположительные) краситель прочно фиксируется и не удаляется при обработке спиртом или ацетоном; грамотрицательные же бактерии легко обесцвечиваются. Для выявления в бактериях нуклеоида применяют метод Фейльгена. От окраски в собственном смысле следует отличать импрегнацию солями металлов, например импрегнацию солями серебра при окраске спирохет по методу Левадити (см. Сифилис).

Помимо позитивных методов окраски (краситель непосредственно действует на окрашиваемый субстрат), в микробиологии используют и негативные методы — окрашивание фона препарата. Они применяются в случае, когда микробы или их отдельные структуры плохо прокрашиваются. Классическим примером негативной окраски является Бурри метод (см.). В тех случаях, когда необходимо выявить у микроорганизма капсулу и окрасить сам микроб, негативные и позитивные методы комбинируют (см. Гинса метод).

Существует также несколько способов повышения эффективности окраски. Одни из них создают условия для проникновения красителя внутрь окрашиваемого объекта (например, при окраске спор препараты предварительно обрабатывают соляной кислотой). Другие методы, связанные с применением протрав, приводят к увеличению окрашиваемого объекта [например, применение солей таниновой кислоты для окраски жгутиков у бактерий (см. Бениньетти метод), телец Пашена — по методу Морозова и клеточной стенки — по методу Нейзи].

Клеточная стенка бактерий является их важным отличительным признаком.

В целях более подробного изучения клеточных структур бактерий микробиологические препараты окрашивают. Можно окрашивать живые бактериальные формы, однако такая окраска не даёт полной картины строения микробной клетки. В связи с этим приготавливают фиксированные препараты микроорганизмов. Фиксация убивает живые клетки и одновременно закрепляет их на поверхности предметного стекла.

Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

Высушивание мазка лучше всего производить при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание происходит медленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка.

Для этого препарат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например, их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим раствором.

Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым относятся красители, у которых красящими свойствами обладает анион, у основных красителей хромофором является катион. Примерами кислых красителей служат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все они интенсивно связываются с цитоплазматическими компонентами клетки. Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристалл-виолет, сафранин — интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерии делает ее более чувствительной к основным красителям. В связи с этим в микробиологической практике применяются почти исключительно основные красители.

Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные палочки, лежащие над лотком, наносят на него раствор красителя и выдерживают в нем в течение 1 - 3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания краситель на мазке не подсыхал, и в случае необходимости добавляют новую порцию красителя.

По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.

Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Окраска по Граму (сложное окрашивание микроорганизмов) и ее использование для дифференциации бактерий с различным строением клеточной стенки.

Данный сложный (использующий более одного действующего вещества) метод окраски впервые был предложен в 1884г. датским ученым Х. Грамом (Ch.Gram) для окрашивания тканей, а позднее получил широкое распространение при окраске прокариот и был назван именем его разработчика.

В свою очередь грамотрицательные бактерии не образуют подобных гетерополисахаридов или содержат их в небольших количествах, недостаточных для предотвращения экстрагирования комплекса красителя с йодом из протопласта при его обработке спиртом. Сказанное объясняет, почему несмотря на кажущуюся простоту метода Грама, именно он получил наибольшее распространение в качестве важного таксономически значимого теста, с результатами которого хорошо коррелируют многие прочие свойства прокариот.

Для реализации данного метода готовят специальный краситель – карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллического фиолетового: 1 г красителя растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до консистенции кашицы, прибавляют небольшими порциями 10 мл 96 % спирта, окончательно разводят 100 мл дистиллированной воды, сливают в бутыль, отстаивают и через сутки фильтруют. Вторым важным компонентом для окраски по Граму является раствор Люголя: в 10 мл дистиллированной воды растворяют 2 г иодида калия и 1 г иода кристаллического, смесь хорошо укупоривают и оставляют на сутки, после чего добавляют 300 мл дистиллированной воды.

Среди множества предложенных в настоящее время вариантов, окрашивания по Граму (по Г.П. Калине, по Эткинсу и др.) достаточно широкое распространение получила модификацияпо А.И. Синеву, для реализации которой предварительно готовят полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового и высушенной.

Процедура сложного окрашивания микроорганизмов:

1) на предметном стекле готовят мазок бактериальной культуры, который фиксируют над пламенем горелки;

2) на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового, на который наносят 2-3 капли воды и выдерживают в течение 2 мин;

3) снимают фильтровальную бумагу;

4) не смывая водой (!) на препарат наносят 2-3 капли раствора Люголя и выдерживают в течение 1 мин;

5) сливают раствор Люголя;

6) опускают предметное стекло в стаканчик с 95 % спиртом, где тщательно прополаскивают препарат в течение 0,5-1 мин, пока не перестанет отходить краситель;

7) тщательно промывают препарат водой;

8) наносят на предметное стекло раствор водного фуксина и прокрашивают препарат в течение 0,5-1 минут;

9) краситель сливают, тщательно промывают препарат водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

Считается, что в большинстве случаев интерпретация результатов окраски мазка по Граму не представляет трудностей, однако некоторые грамположительные микроорганизмы, в частности представители рода Bacillus, могут иметь грамотрицательную окраску. Напротив, некоторые штаммы грамотрицательных родов Acinetobacter и Moraxella проявляют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, поэтому выглядят грамположительными.

Методика выполнения работы.

На предметное стекло наносят каплю 3 %-ного водного раствора КОН. Петлей вносят суточную агаровую культуру исследуемых бактерий и тщательно эмульгируют. При положительной реакции, если суспензия в капле становится вязкой, нити слизи тянутся за петлей на 0,5 – 2,0 см и даже дальше, это - грамотрицательные бактерии, если нет – грамположительные бактерии. Учет этой пробы более удобен на черном фоне.

Образование слизистой консистенции после обработки грамотрицательных бактерий КОН обусловлено выходом из их клеток ДНК, являющейся вязким компонентом.