Алгоритм приготовления питательных сред кратко
Обновлено: 30.06.2024
Посуду вымыть, просушить. Посуду для питательных сред запрещается использовать в других целях, т.к. примеси посторонних веществ могут препятствовать росту микроорганизмов.
3. Установление рН – проводят с помощью индикаторных бумажек.
4. Осветление – проводят, если среда помутнела при помощи белка куриного яйца.
5. Фильтрация через ватно-марлевый фильтр.
6.Разлив в посуду.
7.Стерилизация - проводится в автоклавах при температуре 80 -120 °С.
8.Контроль готовых сред:
1)На стерильность – чашки со средой ставят в термостат на 2 суток, если на чашках не будет признаков роста микроорганизмов, то среды считаются стерильными.
2)Химический – определение рН среды, содержание азота, пептона, хлоридов и др.
3) Биологический – на питательность. Среды засевают микроорганизмами и по их росту судят о питательных свойствах среды.
Задание 8. Ответьте на вопросы.
1. Каким требованиям должны соответствовать питательные среды (ПС)?
2. На какие группы классифицируют ПС?
3. Какие виды сред в группе по происхождению?
4. Какие виды сред в группе сложности?
5. Какие виды сред в группе по консистенции?
6. Какие виды сред в группе по целевому назначению?
7. Какие этапы имеет процесс приготовления питательной среды?
8. Как проводится осветление?
9. Сколько видов контроля должна пройти готовая питательная среда?
Методы посевов микроорганизмов на питательные среды.
Посев — один из стационарных методов культивирования микроорганизмов на питательных средах.
В зависимости от содержания исследуемых бактерий в образце, проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний и определения чистоты культуры).
Если в исследуемом материале содержание микроорганизмов незначительное, то посев проводят на жидкие среды обогащения.
Во время посева материала необходимо исключить попадание других микроорганизмов, поэтому нельзя разговаривать во время посева, работу производить быстро и соблюдать технику личной безопасности.
Инструменты для посева микроорганизмов
1. Микробиологический шпатель.
2. Пастеровская пипетка.
3. Бактериальная петля.
Различают различные методы посева.
1. Метод истощающего штриха. Применяют для получения отдельных колоний.
2. Метод посева сплошным газоном. Применяют при определении общего микробного числа или при определении чувствительности бактерий к антибиотикам.
Метод посева истощающим штрихом.
В основе метода лежит механическое разобщение микробных клеток путем снижения их концентрации по ходу нанесения исследуемого материала бактериологической петлей штриховымидвижениями по поверхности плотной питательной среды (а) и последующим их культивированием с целью получения изолированных колоний.
Метод Дригальского.
Для взятия санитарного смыва мы используем метод посева истощающим штрихом для получения отдельных колоний.
Взятие и посев смыва с объектов внешней среды
Смывы берутся стерильными ватными тампонами, помещенными в пробирки с физиологическим раствором хлорида натрия.
Смывы проводятся для оценки санитарно-гигиенического состояния предприятий общепита, лечебно- профилактических учреждений, детских учреждений.
Взятие смыва проводится с объектов внешней среды с поверхности площадью 10´10 см. Каждый смыв берется только с одного объекта исследования.
Используют ватные тампоны (палочка с намотанной на нее ватой вставлена в пробирку) или салфетки 5×5 см, которые захватывают стерильным пинцетом. Тампоны и салфетки увлажняют, помещая их в пробирки с 2 мл изотонического раствора натрия хлорида.
1. Тампон перед взятием смыва смочить в физиологическом растворе в пробирке.
2. Вынуть из пробирки.
3. Провести взятие смыва тампоном с исследуемой поверхности.
4. Опустить тампон в пробирку и в течение часа доставить в лабораторию.
Тампон с посевным материалом вносят в приоткрытую чашку и методом истощающего штриха аккуратно, не повреждая агара, втирают в поверхность среды.
1. Налейте в пробирку 2 мл физ. раствора.
2. Приготовьте ватные тампоны на металлических палочках.
3. Опустите в пробирку, смочите ватный тампон.
4. Возьмите санитарный смыв с выбранного объекта: со стен, кнопки лифта, ручки двери, водопроводного крана.
5. Опустите в пробирку ватный тампон.
6. Осуществите посев.
7. Переверните дном вверх, для предотвращения попадания конденсата на растущие колонии.
8. Поставьте в термостат при t 37 0 С.
9. Приготовьтесь к итоговому опросу и выполнению теста.
3. Заключительная часть.
1. Формирование отчета по выполненной практике.
При формировании отчета ориентируйтесь на цель практики, и. выполненные вами практические действия. Запищите, чему вы научились и что вами было сделано.
2. Прочитайте итоговые вопросы по теме занятия, подготовьте короткие ответы.
Итоговые вопросы по теме занятия
1. Где существуют микробиологические лаборатории?
2. Какие исследования проводятся в микробиологических лабораториях при ЛПУ?
3. Какие исследования проводятся в лабораториях при ЦСЭН?
4. Что служит материалом для исследования в микробиологических лабораториях?
5. Как должен осуществляться забор материала для исследования?
6. Каковы правила работы в микробиологической лаборатории.
7. Каковы условия культивирования микроорганизмов?
8. Какие требования предъявляются к питательным средам для выращивания микроорганизмов?
9. Какими по консистенции бывают питательные среды?
10. На какие группы делятся питательные среды по целевому назначению?
11. Что такое агар-агар?
12. Назовите этапы приготовления питательных сред.
13. Какие виды контроля готовых сред вы знаете?
14. Какие методы посева микроорганизмов вы знаете?
15. Как проводится взятие смывов с объектов внешней среды?
4. Подведение итогов. Выслушайте итоговую оценку.
6. Приведите в порядок свое рабочее место.
1. Подготовка посуды.
Посуду вымыть, просушить. Посуду для питательных сред запрещается использовать в других целях, т.к. примеси посторонних веществ могут препятствовать росту микроорганизмов.
3. Установление рН – проводят с помощью индикаторных бумажек.
4. Осветление – проводят, если среда помутнела при помощи белка куриного яйца.
5. Фильтрация через ватно-марлевый фильтр.
6.Разлив в посуду.
7.Стерилизация - проводится в автоклавах при температуре 80 -120 °С.
8.Контроль готовых сред:
1)На стерильность – чашки со средой ставят в термостат на 2 суток, если на чашках не будет признаков роста микроорганизмов, то среды считаются стерильными.
2)Химический – определение рН среды, содержание азота, пептона, хлоридов и др.
3) Биологический – на питательность. Среды засевают микроорганизмами и по их росту судят о питательных свойствах среды.
Задание 8. Ответьте на вопросы.
1. Каким требованиям должны соответствовать питательные среды (ПС)?
2. На какие группы классифицируют ПС?
3. Какие виды сред в группе по происхождению?
4. Какие виды сред в группе сложности?
5. Какие виды сред в группе по консистенции?
6. Какие виды сред в группе по целевому назначению?
7. Какие этапы имеет процесс приготовления питательной среды?
8. Как проводится осветление?
9. Сколько видов контроля должна пройти готовая питательная среда?
Методы посевов микроорганизмов на питательные среды.
Посев — один из стационарных методов культивирования микроорганизмов на питательных средах.
В зависимости от содержания исследуемых бактерий в образце, проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний и определения чистоты культуры).
Если в исследуемом материале содержание микроорганизмов незначительное, то посев проводят на жидкие среды обогащения.
Во время посева материала необходимо исключить попадание других микроорганизмов, поэтому нельзя разговаривать во время посева, работу производить быстро и соблюдать технику личной безопасности.
Инструменты для посева микроорганизмов
1. Микробиологический шпатель.
2. Пастеровская пипетка.
3. Бактериальная петля.
Различают различные методы посева.
1. Метод истощающего штриха. Применяют для получения отдельных колоний.
2. Метод посева сплошным газоном. Применяют при определении общего микробного числа или при определении чувствительности бактерий к антибиотикам.
Метод посева истощающим штрихом.
В основе метода лежит механическое разобщение микробных клеток путем снижения их концентрации по ходу нанесения исследуемого материала бактериологической петлей штриховымидвижениями по поверхности плотной питательной среды (а) и последующим их культивированием с целью получения изолированных колоний.
Метод Дригальского.
Для взятия санитарного смыва мы используем метод посева истощающим штрихом для получения отдельных колоний.
Взятие и посев смыва с объектов внешней среды
Смывы берутся стерильными ватными тампонами, помещенными в пробирки с физиологическим раствором хлорида натрия.
Смывы проводятся для оценки санитарно-гигиенического состояния предприятий общепита, лечебно- профилактических учреждений, детских учреждений.
Взятие смыва проводится с объектов внешней среды с поверхности площадью 10´10 см. Каждый смыв берется только с одного объекта исследования.
Используют ватные тампоны (палочка с намотанной на нее ватой вставлена в пробирку) или салфетки 5×5 см, которые захватывают стерильным пинцетом. Тампоны и салфетки увлажняют, помещая их в пробирки с 2 мл изотонического раствора натрия хлорида.
1. Тампон перед взятием смыва смочить в физиологическом растворе в пробирке.
2. Вынуть из пробирки.
3. Провести взятие смыва тампоном с исследуемой поверхности.
4. Опустить тампон в пробирку и в течение часа доставить в лабораторию.
Тампон с посевным материалом вносят в приоткрытую чашку и методом истощающего штриха аккуратно, не повреждая агара, втирают в поверхность среды.
1. Налейте в пробирку 2 мл физ. раствора.
2. Приготовьте ватные тампоны на металлических палочках.
3. Опустите в пробирку, смочите ватный тампон.
4. Возьмите санитарный смыв с выбранного объекта: со стен, кнопки лифта, ручки двери, водопроводного крана.
5. Опустите в пробирку ватный тампон.
6. Осуществите посев.
7. Переверните дном вверх, для предотвращения попадания конденсата на растущие колонии.
8. Поставьте в термостат при t 37 0 С.
9. Приготовьтесь к итоговому опросу и выполнению теста.
3. Заключительная часть.
1. Формирование отчета по выполненной практике.
При формировании отчета ориентируйтесь на цель практики, и. выполненные вами практические действия. Запищите, чему вы научились и что вами было сделано.
2. Прочитайте итоговые вопросы по теме занятия, подготовьте короткие ответы.
Итоговые вопросы по теме занятия
1. Где существуют микробиологические лаборатории?
2. Какие исследования проводятся в микробиологических лабораториях при ЛПУ?
3. Какие исследования проводятся в лабораториях при ЦСЭН?
4. Что служит материалом для исследования в микробиологических лабораториях?
5. Как должен осуществляться забор материала для исследования?
6. Каковы правила работы в микробиологической лаборатории.
7. Каковы условия культивирования микроорганизмов?
8. Какие требования предъявляются к питательным средам для выращивания микроорганизмов?
9. Какими по консистенции бывают питательные среды?
10. На какие группы делятся питательные среды по целевому назначению?
11. Что такое агар-агар?
12. Назовите этапы приготовления питательных сред.
13. Какие виды контроля готовых сред вы знаете?
14. Какие методы посева микроорганизмов вы знаете?
15. Как проводится взятие смывов с объектов внешней среды?
4. Подведение итогов. Выслушайте итоговую оценку.
6. Приведите в порядок свое рабочее место.
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
Для культивирования микроорганизмов используют различные питательные среды. Это необходимо для дифференциации инфекционных болезней, для приготовления вакцин, антибиотиков и др.
К питательным средам предъявляют следующие требования: должны содержать все необходимые вещества для питания микробов, иметь определенную реакцию среды, быть стерильными и обязательно влажными. Питательные среды подразделяют на Простые и сложные.
К простым средам относятся мясопептонный бульон, мясопептонный агар, мясопептонный желатин (МПЖ). Все простые питательные среды готовят на мясной воде. Для ее приготовления мясо отделяют от жира и фасций, измельчают, заливают водой в соотношении 1:2 и кипятят в течение 30-60 мин. Затем фильтруют, доливают до первоначального объема и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.
Приготовление МПБ состоит в следующем. К 1 л мясной воды добавляют 1 % Пептона, 0,5 % Поваренной соли. Устанавливают реакцию среды (рН 7,2-7,4), кипятят, фильтруют, разливают по колбам и стерилизуют при давлении 0,1 МПа 15-20 мин.
По консистенции питательные среды могут быть Жидкими, полужидкими и плотными. Для приготовления полужидких и плотных сред к МПБ добавляют агар (соответственно 0,2-0,3 и 2-3 %). Агар - это вещество, получаемое из морских водорослей. В его состав входят пектиновые вещества. Агар плавится при 90-100 °С и застывает при температуре ниже 45 "С. Как питательное вещество агар микроорганизмами не используется.
Сложные (специальные) питательные среды готовят для культивирования микробов, которые не растут на обычных, простых средах. Например, яичную среду Петраньяни используют для выращивания туберкулезной палочки. В состав среды входят молоко, картофельная мука, пептон, яичный белок, 2 %-ный водный раствор малахитовой зелени.
К сложным питательным средам относятся дифференциально-диагностические среды (Эндо, Плоскирева и др.), которые служат для отличия одних групп или видов микробов от других. Например, среда Эндо состоит из МПА, лактозы, фуксина основного, обесцвеченного щелочью. На этой среде кишечная палочка растет в виде темно-красных колоний с металлическим блеском, так как сбраживает лактозу с образованием молочной кислоты, которая восстанавливает обесцвеченный фуксин. Сальмонеллы на среде Эндо растут в виде бесцветных колоний. Они не ферментируют лактозу.
Для выращивания анаэробов готовят среду Китта-Тароцци (МППВ), состоящую из печеночного бульона, кусочков печени на дне пробирки и вазелинового масла, налитого сверху.
Для изучения способности микробов сбраживать сахара в лабораториях используют полужидкие углеводные среды, состоящие из пептонной поды, 0,2-0,3 % Агара, моноуглевода и индикатора.
Протеолитнческие свойства микробов (способность расщеплять белки) изучают на желатине, свернутой кровяной сыворотке и молоке.
Среды накопления используют для подавления одних видов микробов и создания благоприятных условий для развития других. Наиболее часто в лабораториях используют накопительные среды (Кауфмана, Мюллера, селенитовую, хлористомагниевую М), которые задерживают рост гнилостных микробов и не препятствуют размножении) сальмонелл.
Для культивирования микробов применяют также синтетические среды, которые включают определенные химические вещества, необходимые для питания микроорганизмов.
Заводы выпускают некоторые питательные среды (МПА, среда Эндо и др.) в высушенном виде, что значительно облегчает метод их приготовления в лабораториях.
Оценивание: за работу на занятии выставляется общая оценка – за устный ответ фронтального обсуждения, манипуляцию, тестовую работу (если она предусматривается).
Вопросы для фронтального обсуждения:
1.Дайте понятие культивированию.
2.Назовите цель культивирования микроорганизмов.
3.Назовите этапы культурального (бактериологического) метода исследования.
Отработайте манипуляции:
1.Продемонстрируйте умение по приготовлению питательной среды.
2.Продемонстрируйте умение по посеву микробиологического материала на плотную питательную среду.
3.Опишите культуральные свойства кишечной палочки на среде Эндо, и золотистого стафилококка на желточно-солевом агаре.
! Внимание. При отработке практических манипуляций следуйте алгоритму.
Самостоятельная аудиторная работа студентов:
1.Составьте схему бактериологического метода исследования по следующему образцу:
| Бактериологический метод |
| Этапы |
| 3. |
| 4. |
| 2. |
| 1. |
Составьте алгоритм приготовления питательной среды.
Краткие теоретические положения
Краткая характеристика питательной среды
Для культивирования микробов в лабораторных условиях готовят питательные среды с учетом потребности в питательных веществах каждого вида в отдельности. Питательная среда в своем составе должна содержать углерод, водород, кислород, азот, фосфор, серу, магний, железо, микроэлементы и биостимуляторы роста.
Различают питательные среды естественные(молоко, яйца, картофель и т. п.),искусственные,приготовленные из продуктов животного или растительного происхождения, исинтетические(среды Чапека, Сабуро). По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.
Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар или желатин. Агар-агар представляет собой продукт переработки высушенных морских водорослей рода анфельция, состоящий в основном из полисахаридов. В холодной воде агар-агар набухает и размягчается, в горячей (90—100° С) расплавляется, образуя клееобразную массу. Застывает агар-агар при 40° С, образуя студень. Как питательное вещество агар-агар микробами не используется.
Желатин получают путем вываривания кожи, костей и сухожилий животных. При нагревании с водой желатин образует коллоидный раствор, застывающий при 18—20° С в однородный коллоидный студень и расплавляющийся при 25—27° С.
В бактериологической практике обычно применяют среды из продуктов животного и растительного происхождения, содержащие пептоны, экстрактивные вещества мяса, кровь, сыворотку, сусло, углеводы и т. п.
Необходимые питательные вещества должны содержаться в среде в доступной форме и в определенных соотношениях.
Питательные среды должны быть стерильными (должно быть обеспечено получение чистых культур микроорганизмов), прозрачными (выросшие на них микроорганизмы должны быть хорошо видны и иметь определенную величину рН).
Хранят готовые среды в прохладном месте, в плотно закрывающихся шкафах или ящиках, что предохраняет их от быстрого высыхания. Надолго хранившихся средах микробы развиваются слабо или совсем не растут.
Питательные среды принято делить на три группы:
1) стандартные (универсальные) — предназначаются для культивирования большинства микробов;
2) специальные элективные, избирательные — предназначаются для выращивания только определенного вида микробов, рост других микроорганизмов на этих средах подавляется;
3) дифференциально-диагностические — предназначаются для изучения биохимических свойств микробов с целью дифференцирования различных видов микроорганизмов.
Техника приготовления
Этапы приготовления сред: 1) варка; 2) установление оптимальной величины рН; 3) осветление; 4) фильтрация; 5) разлив; 6) стерилизация; 7) контроль.
Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах.
3.Зарисуйте в тетрадь технику посева на плотные питательные среды.
При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают 1 и II пальцами, а с другой —IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют 1 и III или 1 и II пальцами (рис.). Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться вместо петли тампоном или шпателем.
При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного.
Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида.
Из материала, подлежащего посеву в толщу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15 - 20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40 - 45 °С (при такой температуре пробирка со средой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола.
Посев уколом в столбикпитательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.
Запишите алгоритм культивирования микроорганизмов.
Питательная среда должна обладать определенным набором свойств:
— содержать достаточное количество питательных веществ, микроэлементов, минеральных солей;
— иметь определенную вязкость;
— иметь определенные влажность и/или кислотность;
— быть изотонической, то есть не нарушать нормальное функционирование клеток, проницаемость клеточных мембран;
— в большинстве случаев, среда должна быть прозрачной.
Питательные среды бывают разной консистенции
К жидким средам относятся растительные экстракты, сыворотка крови, мясной бульон. На основе жидких сред, добавляя определенные количества агар-агара, желатина, силикагеля, получают полужидкие и плотные среды.
Плотные среды применяются для выращивания чистых культур микроорганизмов, для исследования их свойств, для подсчета количества бактерий в исследуемой пробе.
К сыпучим средам относят среды для промышленного производства. Они состоят из измельченного и увлажненного растительного сырья. На их основе изготавливают силосные корма в животноводстве, соевый соус в пищепроме и т. д.
Сухие питательные среды представляют собой гигроскопичный порошок. Это стандартизированные готовые смеси, которые выпускаются промышленным способом и предназначены для приготовления питательных сред в лаборатории. Их преимущества:
— точно известный химический состав;
— долгий срок хранения;
— высокое качество компонентов и высокая степень очистки, которых трудно добиться вне условий специализированной лаборатории;
— удобны при хранении и транспортировке;
— из них просто и быстро можно приготовить питательную микробиологическую среду.
Приготовление питательных сред
Для приготовления питательных сред в лабораториях используют или уже готовые сухие смеси, или проверенные временем рецепты, которые есть в специализированной литературе. Существует более тысячи питательных сред для культивирования различных микроорганизмов. В полужидкие и плотные среды вводят агар-агар или желатин, чтобы добиться нужной консистенции.
После того, как питательная среда изготовлена, ее делают прозрачной, добавляя специальные вещества (например, яичный белок) и отфильтровывая взвешенные частицы. Плотные и полужидкие среды, как правило, фильтруют горячими.
Следующий этап — установить определенный уровень кислотности среды, добавляя раствор кислоты или щелочи. Это очень важно, так как разные микробы и бактерии требуют своего уровня рН. Есть микроорганизмы, которые могут размножаться только в кислой (рН около 9) или только в щелочной (рН=5) среде. Для нейтральной среды уровень кислотности подбирается с точностью до десятых долей, например, рН=7,4. Для контроля кислотности используют цветную индикацию (лакмусовые бумажки, фенолфталеин, метанитрофенол и др.) и фотоколориметры или рН-метры.
Приготовленную питательную среду в конце обязательно стерилизуют, чаще всего методом термообработки, в автоклаве или аппарате Коха. Способ и режим термообработки зависит от вида среды.
Хранение питательных сред
Приготовленные и стерилизованные питательные среды разливают по большим колбам или культуральным бутылям и хранят в темных, холодных помещениях с контролируемой влажностью. Перед применением среды с желирующими компонентами (агаром, желатином) нагревают на водяной бане и разливают через воронку или бюретку по сосудам, в которых будет производиться выращивание культур: по биологическим пробиркам или чашкам Петри. Пробирки устанавливают вертикально или почти горизонтально, чтобы получить среду в виде столбика или скошенную, с увеличенной площадью поверхности.
При работе с аэробными (дышащими кислородом) культурами пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками, которые пропускают воздух, но не посторонние микроорганизмы.
Для выращивания и изучения анаэробных микроорганизмов следует ограничить или исключить доступ кислорода к ним. Для этого культуры выращивают под слоем масла, в глубине плотных сред, в атмосфере из углекислого газа. Иногда в среду добавляют специальные вещества, которые связывают кислород.
Сухие питательные среды хранят в сухом помещении, в хорошо укупоренной посуде.
Читайте также: