Правила пользования иммерсионной системой кратко

Обновлено: 08.07.2024

При иммерсионной микроскопии окрашенных препаратов необходимо создавать хорошее освещение, для чего надо максимально поднять конденсор, открыть диафрагму конденсора, поставить малый сухой объектив на расстоянии 5–7 см от предметного столика и с помощью плоского зеркала установить равномерное освещение поля зрения. При работе с иммерсионной системой во избежание порчи объектива необходимо соблюдать следующие правила: после нанесения на поверхность препарата небольшой капли иммерсионного масла под контролем глаза сбоку погрузить в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива, а затем, глядя в окуляр, при помощи сначала макрометрического, а затем микрометрического винта установить препарат в фокусе микроскопа. Микроскопирование необходимо проводить, не снимая руки с микрометрического винта, что дает возможность, изменяя фокусное расстояние, рассмотреть всю поверхность поля зрения. После работы иммерсионная система и столик микроскопа должны быть очищены от масла.

3.Виды микроскопии
Микроскопия в темном поле. Ее применяют для изучения неокрашенных микробов, их подвижности. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной центральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лучей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи. В связи с этим поле зрения остается неосвещенным в то время как объекты, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне.
Люминесцентная микроскопия. Люминесценция – свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией (коротковолновая и ультрафиолетовая части спектра). Микробы обладают слабой собственной первичной люминесценцией, и поэтому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами люминесцирующих красителей (флюорохромами), которые светятся под влиянием ультрафиолетовых и коротковолновых синих лучей. Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, т.е. связываются с отдельными клеточными структурами (ядро, цитоплазма, включения). Для люминесцентной микроскопии необходим источник ультрафиолетового света и набор светофильтров.

7. Приготовления фиксированного мазка и простой способ окрашивания . Значение.Для приготовления мазка на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал с плотной питательной среды и распределяют так, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1–1,5 см. При приготовлении мазков из жидких культур исследуемый материал непосредственно наносится на предметное стекло.
Фиксация мазка производится с целью прикрепления микроорганизмов к стеклу и обеззараживания препарата. Кроме того, фиксированные бактерии лучше воспринимают красители. Для фиксации мазков высушенный препарат проводят 3–4 раза через пламя горелки, причём в пламени препарат следует выдерживать не более 2 секунд. Если фиксация проведена правильно, стекло при прикосновении к тыльной поверхности руки тотчас после окончания процесса фиксации слегка обжигает кожу. В некоторых случаях мазки можно фиксировать путем погружения в этиловый спирт на 15–20 минут, в смесь равных объёмов этилового спирта и эфира (смесь Никифорова) на 15–20 минут, в ацетон на 5 минут.
Окрашивание мазков осуществляется растворами анилиновых красителей. В основе окраски лежат сложные химические и физико-химические процессы взаимодействия компонентов микробной клетки с анилиновыми красителями. Красящая способность последних зависит от наличия у них карбоксильных, серосодержащих аминогрупп, от заряда микробной клетки. Для окраски микроорганизмов используют главным образом основные красители – метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый, фуксин, гематоксилин, везувин и др. Для выявления различных структурных элементов бактериальной клетки применяют нейтральные и кислые красители (нейтральный красный, кислый фуксин, Конго, пикриновая кислота и др.). Отношение микроорганизмов к красителям определяет их тинкториальные свойства.

9. Выявление капсул по методу Бурри – Гинса

а) на край предметного стекла нанести каплю туши, а рядом каплю исследуемой культуры. Капли быстро перемешать и с помощью шлифованного стекла приготовить тонкий мазок;
б) после высушивания мазок фиксировать над пламенем и окрасить фуксином в течение 1–2 минут;
в) осторожно промыть водой и высушить.
Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсула не окрашивается и имеет вид светлой зоны вокруг бактерий на тёмном фоне.

10. Окраска включений волютина по методу Нейссера
Приготовить мазок и окрасить по методу Нейссера для выявления зёрен волютина, микроскопировать:
а) фиксированный мазок окрасить в течение 2–3 минут уксусно-кислой синькой Нейссера;
б) препарат 10–30 секунд обрабатывать раствором Люголя;
в) не промывая водой, мазок докрасить в течение 30–60 секунд везувином.
Зёрна везувина окрашиваются в синий цвет, тела клеток – в жёлтый.

11.Окраска жгутиков по методу Леффлера

а) приготовить мазок из 18–24-часовой культуры, для чего взвесь бактерий внести в каплю стерильной водопроводной воды, нанесенной на предметное стекло, и высушить;

б) мазок обработать в течение 15–20 минут протравой, содержащей
1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 25 % водного раствора танина и 5 мл насыщенного водного раствора серно-кислого железа;

в) мазок тщательно промыть водой, высушить на воздухе и докрасить фуксином Циля в течение 3–4 минут при легком подогревании;

г) препарат промыть водой и высушить.

12.Выявление спор способом Ожешки

а) приготовить мазок на краю предметного стекла;

б) нефиксированный мазок подвергнуть протравливанию кислотой при повышенной температуре, для чего на мазок налить 1 % раствор соляной кислоты и подогреть над пламенем горелки в течение 2–3 минут;

в) кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.

При такой обработке оболочка споры размягчается и становится доступной для красителя. Далее мазок 13.окрасить по методу Циля – Нильсена :

а) на мазок поместить кусочек фильтровальной бумаги, на него налить карболовый фуксин Циля и подогреть стекло над пламенем горелки до появления паров;

б) охладить, снять бумагу, промыть водой и обесцветить 5 % серной кислотой в течение 30 секунд;

в) препарат тщательно промыть водой и докрасить раствором метиленового синего в течение 3–5 минут;

г) препарат промыть водой и высушить.

Карболовая кислота разрыхляет оболочку споры и тем самым повышает её тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия бактериальных спор с красителями. Споры окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой вегетативные тела бактерий обесцвечиваются метиленовым синим.

Иммерсионная микроскопия (от лат. immersio — погружение) — метод микроскопического исследования малых объектов с помощью погружения объектива светового микроскопа в среду с высоким коэффициентом преломления, расположенную между микроскопическим препаратом и объективом.

Для проведения исследований используют специальные иммерсионные объективы (объективы для масляной иммерсии имеют чёрную полосу на оправе, вблизи от фронтальной линзы; объективы для водной иммерсии — белую полосу).

Правила работы с иммерсионной системой:

1. установить микроскоп на малое увеличение;

2. навести максимальную освещенность (зеркало, конденсор, диафрагма);

3. установить препарат на столик;

4. нанести каплю масла на препарат;

5. установить иммерсионный объектив;

6. опустить объектив в каплю масла при помощи макровинта;

7. наблюдая в окуляр вращать макровинт до появления изображения;

8. микровинтом установить более четкое изображение;

9. провести микроскопию мазка с описанием морфологических свойств;

10. поднять тубус вверх, снять препарат и очистить объектив от масла;

11. установить микроскоп в нейтральное положение (малое увеличение, тубус вниз).

2. Устройство светового микроскопа и работа с ним.

Микроскоп - сложный оптический прибор, используемый для изучения морфологии и тинкториальных свойств микроорганизмов. Принципиально все микроскопы устроены одинаково и состоят из механической части и оптической системы.

Механическую часть составляют: основание микроскопа, тубусодержатель, тубус, система винтов для передвижения, предметный столик и револьвер. Оптическую часть составляют - окуляр, объективы и осветительный аппарат (рис. 1).

Работа с иммерсионной системой. Объективы малого увеличения (3,5,8,9) применяют главным образом для предварительного осмотра препарата, объективы среднего увеличения (20,40) - для изучения крупных клеток микроорганизмов (например, грибов); эти объективы называются сухими, поскольку при микроскопии между фронтальной линзой и препаратом находиться воздух. При этом благодаря различию показателей преломления воздуха (n=1) и стекла (n=1,52) часть лучей, освещающих препарат, рассеивается и не попадает в объектив.

Рис.1.Микроскоп МБР-1. 1‑основание; 2‑предметный столик; 3‑винты для перемещения предметного столика; 4‑клеммы; 5‑конденсор; 6‑кронштейн конденсора; 7‑винт, укрепляющий конденсор; 8‑рукоятка перемещения конденсора; 9‑рукоятка ирисовой диафрагмы конденсора; 10‑зеркало; 11‑тубусодержатель; 12‑рукоятка макрометрического винта; 13‑рукоятка микрометрического винта; 14‑револьвер; 15‑объектив; 16‑наклонный тубус; 17‑винт для крепления тубуса; 18‑окуляр.

Объективы больших увеличений (85, 90) носят название иммерсионных. При работе с ними необходима максимальная освещенность препарата; устранение рассеивания, неизбежного при работе с сухими объективами, в данном случае достигается путем использования иммерсионных жидкостей, у которых показатель преломления близок к показателю преломления стекла (рис.2).

Вначале под малым увеличением микроскопа наводят свет и определяют на препарате участок микроскопирования. Затем на выбранное место наносят каплю иммерсии и осторожно (под контролем глаз с боку) погружают в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива (90). Иммерсионные объективы имеют короткое фокусное расстояние (до 2,3 мм) поэтому наводить на резкость следует путем поднимания объектива, а не опускания его, так как при небольшом рабочем расстоянии можно раздавить препарат и повредить фронтальную линзу. После грубой наводки, которую проводят с помощью макрометрического винта, руки переводят на микрометрический винт и осуществляют точную фокусировку. По окончании работы объектив поднимают, убирают препарат, а с фронтальной линзы кусочком фильтровальной бумаги убирают иммерсию.

Иммерсионная микроскопия – это методика микроскопического исследования различных объектов, основанная на введении между объективом и предметным стеклом иммерсионных жидкостей.

Данный иммерсионный метод микроскопии применяется для того, чтобы свет проходил через рассматриваемый предмет, иммерсионную жидкость, при этом луч не преломлялся. Благодаря этому происходит получение изображения более высокого качества и разрешения.

Немаловажным моментом в иммерсионном микроскопе является та самая жидкость, благодаря которой и получается изображение такого качества. При прохождении светового луча через предметное стекло с препаратом, он сталкивается в последующим с иммерсионной средой, которой является иммерсионная жидкость. Именно за счет нее происходит уменьшение преломления данного светового луча, и именно поэтому в объектив попадает гораздо больше света, что дает такую яркую, четкую картинку у исследователя.

На иммерсионном объективе всегда есть соответствующая маркировка, которая говорит о том, какой тип иммерсии имеется в нем:

Oil – объектив с масляной иммерсией;
W – объектив с водной иммерсией;
S – силиконовая иммерсия.

Начало применения иммерсионных микроскопов ознаменовалось такими масляными иммерсионными средами, как кедровое масло, глицерин, масло вазелиновое. Однако, с течением времени ученые выяснили тот факт, что их свойство значительно меняется, масло начинает менять консистенцию, загустевания, вплоть до того, что становиться твердой массой, меняется его цвет, а, следовательно, и коэффициент преломления при микроскопировании. Что уже дает негативный эффект при проведении микроскопического исследования объекта. Именно поэтому было принято решение использовать только лишь синтетические масла в качестве иммерсионных сред, которые не обладают такими негативными моментами как натуральные продукты.

К тому же в современных вариантах иммерсионных микроскопов используются объективы, на которые нанесено специальное покрытие, которое улучшает цветопередачу при иммерсионной микроскопии, а также имеет защитные свойства, которые защищают объектив от мелких царапин в процессе эксплуатации соответствующего оборудования.

1. Поднять конденсор микроскопа выше предметного стекла и полностью открыть диафрагму.

2. Включить осветитель и установить свет с помощью зеркала.

3. На мазок нанести каплю иммерсионного масла, поместить препарат на предметный столик микроскопа.

4. Поставить в рабочее положение иммерсионный объектив, маркированный черной линией.

5. Под контролем зрения, глядя сбоку, с помощью макровинта осторожно опустить тубус микроскопа до погружения иммерсионного объектива в каплю масла.

6. Глядя в окуляр, очень медленно поднимать тубус при помощи макровинта, пока не появится изображение объекта.

7. Далее провести точную фокусировку с помощью микровинта.

8. В процессе микроскопии следует медленно передвигать препарат, установить наилучшее поле зрения и изучить морфологические (форму и расположение) и тинкториальные (цвет) свойства микроорганизмов.

9. По окончании микроскопии поднять тубус и после этого снять препарат с предметного столика микроскопа.

10. Протереть фронтальную линзу иммерсионного объектива чистой марлевой салфеткой, смоченной спиртом, и повернуть револьвер таким образом, чтобы ни один из объективов не был направлен в сторону конденсора.

III. План практической работы

1. Выполнить микроскопию с иммерсией мазков, окрашенных по Граму, зарисовать.

2. Выполнить микроскопию с иммерсией мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, зарисовать.

3. Описать метод окраски по Бурри-Гинсу, микроскопировать с масляной иммерсией препараты капсульных бактерий, окрашенных по Бурри-Гинсу, зарисовать.

4. Описать метод окраски по Ожешко (Ауэски), микроскопировать с масляной иммерсией мазок спорообразующих бактерий, окрашенных по Ожешко, зарисовать.

5. Описать метод окраски по Леффлеру, выявить зерна волютина, зарисовать.

6. Микроскопировать готовые препараты плесневых грибов рода Мuсоr, зарисовать.