Метод прогулки по хромосоме кратко

Обновлено: 02.07.2024

Евроген предлагает услуги в области клонирования промоторов и других регуляторных областей генов методом прогулки по хромосоме, основанном на супрессии ПЦР.

Материалы, предоставляемые Заказчиком:

Геномная ДНК
Информация о фрагменте целевой последовательности (не менее 50 п.о. нуклеотидной последовательности)

Результат работы (передается Заказчику):

1. Праймеры, использованные в ходе выполнения заказа (по требованию заказчика)

2. Плазмидная ДНК, содержащая целевую вставку

3. Отчет о проделанной работе, включая хроматограммы сиквенсов клонированных фрагментов ДНК

Вниманию заказчика

В случае невозможности исполнения заказа, возникшей по вине заказчика (например, неверно предоставленной информации о нуклеотидной последовательности, присланных некачественных биологических материалах), произведенные услуги подлежат оплате в полном объеме.

Конфиденциальность

Евроген гарантирует сохранение конфиденциальности данных, полученных в процессе обсуждения и выполнения заказа.

Метод выделения и анализа нуклеотидных последовательностей (новых генов), фланкирующих известные гены, для которых имеются олигонуклеотидные зонды; после выделения гена с фланкирующими его последовательностями эти последние используются в качестве зондов для выделения новых, прилегающих к ним последовательностей и т.д.; в результате “П.п.х.” с помощью перекрывающихся последовательностей нуклеотидов исследуются неизвестные протяженные участки генома, прилегающие друг к другу; одним из вариантов метода “П.п.х.” является метод “прыжков по хромосоме” chromosome jumping >.

Смотреть что такое "прогулка по хромосоме" в других словарях:

Прогулка по хромосоме — * прагулка па храмасоме * chromosome walking or genome w. or overlap hybridization метод (техника) выделения для секвенирования (см.) клонов из геномной библиотеки (см.), содержащей фрагменты рестрикции (см.) с перекрывающимися… … Генетика. Энциклопедический словарь

Полную, но, к сожалению, пока трудно интерпретируемую информацию о строении гена может дать только определение его первичной структуры, т.е. последовательности составляющих ген нуклеотидов. На практике при исследовании протяженных (до 40 т.п.о.) клонированных последовательностей нуклеотидов, включающих исследуемые гены, прежде всего строят их рестрикционные карты. Рестрикционные карты представляют собой схемы, изображающие взаимное расположение сайтов рестрикции для разных рестриктаз и расстояния между ними. Поскольку каждый сайт рестрикции является не чем иным, как строго определенной последовательностью нуклеотидов ДНК, рестрикционные карты наглядно заключают в себе информацию об особенностях первичной структуры картируемых участков генома.

Для построения рестрикционной карты используют гибридизацию по методу Е. Саузерна. Клонированный фрагмент ДНК отдельно или в составе вектора получают в препаративном количестве, затем его обрабатывают соответствующими рестриктазами и продукты рестрикции разделяют электрофорезом в агарозном геле. Количество образовавшихся рестрикционных фрагментов ДНК, обнаруживаемых после окрашивания бромистым этидием в виде флуоресцирующих полос в ультрафиолетовом свете, соответствует количеству сайтов рестрикции в том случае, если различия в размерах образовавшихся фрагментов ДНК достаточны для их разделения при электрофорезе.

Размеры рестрикционных фрагментов оценивают путем сравнения их электрофоретической подвижности с таковой фрагментов ДНК известных размеров. Получив информацию о количестве сайтов рестрикции в гене, далее определяют их взаимное расположение. Для этого в качестве зондов выбирают короткие фрагменты ДНК и после введения в них радиоактивной метки их гибридизуют с рестрикционными фрагментами ДНК, которые после электрофоретического разделения в агарозном геле были перенесены на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры. По завершении гибридизации положение фрагментов ДНК, связавших метку, на фильтрах обнаруживают с помощью авторадиографии. Получение такой информации о принадлежности конкретных фрагментов ДНК, образовавшихся под действием различных рестриктаз, к 5’- или 3’-концевым частям исследуемой последовательности нуклеотидов обычно бывает достаточным для определения взаимного расположения различных сайтов рестрикции на рестрикционных картах.

"Прогулки и прыжки по хромосомам"

Многие гены в геноме эукариот располагаются в виде кластеров, члены которых функционально или эволюционно связаны друг с другом. В связи с этим в молекулярной генетике часто возникает задача клонирования генов, расположенных по соседству с уже выделенными генами. Для ее решения был разработан метод "прогулки по хромосоме". Из клонотеки генов, полученной на основе фаговых или космидных векторов, выделяют ген и короткие 5’- и 3’-концевой фрагменты его последовательности используют в качестве зондов для поиска фрагментов ДНК, перекрывающихся с этим геном. Основным требованием, предъявляемым к зонду, является принадлежность его к уникальной последовательности нуклеотидов, т.е. встречающейся в геноме только один раз. С использованием такого простого подхода были исследованы многие кластеры эукариотических генов, в частности -глобинового локуса человека, структура которого представлена на рис. II.14.

Рис. II.14. Генетическая карта локуса -глобинового гена человека, полученная методом "прогулки по хромосоме"

Перекрывающиеся фрагменты геномной ДНК человека получены путем ее частичного расщепления рестриктазой EcoRI, сайты рестрикции для которой отмечены поперечными черточками. Указаны расстояния междуEcoRI-сайтами рестрикции в т.п.о., гены-глобинового локуса, а также названия рекомбинантных фагов

С помощью "прогулки по хромосоме" удается детально картировать участки ДНК длиной до 250 т.п.о. Недавно разработанный метод "прыжков по хромосоме" позволяет стыковать за один прием фрагменты ДНК общей длиной от 100 до 500–1000 т.п.о. В этом случае на первом этапе препарат высокомолекулярной ДНК расщепляют соответствующей рестриктазой и с помощью электрофореза в импульсном электрическом поле получают фракцию фрагментов ДНК одинакового размера (в данном примере ~100 т.п.о.) (см. рис. II.15). Затем фрагменты ДНК лигируют с маркерным геном, например геном устойчивости к антибиотикам, что приводит к образованию кольцевых молекул. Кольцевые молекулы ДНК расщепляют другой рестриктазой, для которой отсутствуют сайты рестрикции в маркерном гене, что сопровождается образованием коротких фрагментов ДНК, которые далее можно клонировать обычными способами. Полученную клонотеку фрагментов ДНК исследуют с использованием гибридизации с зондом, комплементарным точке начала "прыжка по хромосоме". Отобранные в результате гибридизации клоны содержат маркерный ген, фланкированный изучаемыми последовательностями нуклеотидов, удаленными друг от друга на 100 т.п.о. Таким образом, получают информацию о последовательностях нуклеотидов, удаленных от точки начала "прыжка по хромосоме" на 100 т.п.о., и эти последовательности далее используют в качестве зонда для выделения и исследования фланкирующих ее фрагментов ДНК.

Материалы, предоставляемые Заказчиком:

Геномная ДНК
Информация о фрагменте целевой последовательности (не менее 50 п.о. нуклеотидной последовательности)

Результат работы (передается Заказчику):

1. Праймеры, использованные в ходе выполнения заказа (по требованию заказчика)

2. Плазмидная ДНК, содержащая целевую вставку

3. Отчет о проделанной работе, включая хроматограммы сиквенсов клонированных фрагментов ДНК

Вниманию заказчика

Конфиденциальность

В конце минувшего века автор этих строк гулял по хромосоме одной симпатичной плесени в попытках найти центромеру. "Прогулка по хромосоме" — это способ исследования генома, когда от изученных его частей постепенно перемещаются в неизученные. А "центромера" — участок хромосомы, за который клетка при делении тащит ее к одному из полюсов. Не будь центромер, хромосомы распределялись бы случайно и в конце концов потерялись бы. Этой информации должно хватить для понимания нашей истории.

В процессе той прогулки мы забрели в область густых повторов. Дальше идти было некуда. Работу пришлось забросить (то есть опубликовать как есть), и это разочарование стало одним из факторов, которые привели незадачливого исследователя из его лаборатории к нынешнему состоянию научного журналиста и автора этих строк.

Однако первая любовь остается навсегда, и я изредка заглядывал в прессу: как там у них дела с центромерой? В 2005 году объявлено о том, что геном аспергилла (именно он и был той плесенью) полностью расшифрован. Но знаете что? Центромеру в нем так и не нашли.

И тут уместно вспомнить о геноме человека, который, согласно торжественным анонсам, полностью расшифрован еще в 2003-м. Многим кажется, что слово "полностью" означает, что геном и впрямь был расшифрован полностью, но это не так. Центромер — как и кое-чего другого — вы не найдете там до сих пор. Для тех, кто любит читать мелкий шрифт в конце кредитных договоров, участники проекта поясняют: "человеческий геном расшифрован полностью, насколько позволяют существующие технологии ". Что же мешает технологиям? То же, что изменило жизнь автора: повторы.

Обычно геном собирают из кусочков путем наложения соседних фрагментов. Возьмем два фрагмента текста: "Он не сумел приготовить свое лицо к тому положению, в ко. " и ". положению, в которое он становился перед женой после открытия его вины". Из них легко собирается целая фраза, а затем, если таких кусочков набрать побольше, компьютер может восстановить полный текст романа "Анна Каренина". Но что годится для большой литературы, не работает в случае трэша: полный текст песни "Пiдманула, пiдвела" таким способом восстановить не получится. Виной тому повторяющийся припев: если длина известных фрагментов меньше длины этого припева, нет никакого способа узнать, какой куплет за каким следует.

В геномах живых существ — и плесени, и человека — таких повторов предостаточно. Один из примеров — фрагмент длиной в 171 букву, повторяющийся в геноме человека многие десятки раз подряд. В большинстве геномных проектов длина фрагмента секвенирования составляет чуть больше сотни букв, и прорваться через подобную преграду они не могут. Новая техника, вроде представленного в этом году прибора MinION, расшифровывает ДНК кусками до сотни тысяч букв. Однако длина самых больших брешей в геномах млекопитающих превышает этот предел. По оценкам профессора Джорджа Черча из Гарварда (того самого, который на прошлой неделе сообщил об элегантном способе проследить за судьбой каждой клетки в организме мыши), сегодня нерасшифрованными остаются примерно 5% человеческого генома, и основная часть этой terra incognita — пара десятков больших брешей, каждая размером с геном средней бактерии.

В одном из эпизодов сериала "Теория большого взрыва" официантка Пенни ставит в тупик всезнающего физика Шелдона Купера вопросом о фронтмене группы Radiohead. Ученым порой свойственно даже гордиться незнанием того, что они считают маловажным. Но отсюда один шаг до следующей степени заносчивости: считать маловажным все, чего вы не знаете. И эта опасность всерьез угрожает геномике. Разумеется, гены, кодирующие белки, очень важны, и по счастью они легко расшифровываются. Однако не надо думать, что о бессмысленных повторах в геноме нам знать ничего не нужно. Те же самые центромеры — ключ к анеуплоидиям и другим генетическим расстройствам. Известны случаи, когда тяжелый наследственный дефект развития отличается от здоровья только числом повторяющихся элементов, отделяющих ген от "энхансера" — его выключателя. Да и вообще, знать что-то всегда лучше, чем не знать, даже если речь идет о таком маловажном факте, как то, что вокалиста Radiohead зовут Том Йорк.

Когда они говорят вам, что расшифровали геном человека, они не то чтобы "лгут" — скорее, слегка упрощают ситуацию в угоду нашему невежеству. Но тут есть обратная сторона: уже отпраздновав великую победу разума, мы, широкая публика, просто не поймем, зачем этим ученым нужны еще какие-то деньги. А когда геном все же будет прочитан полностью, от первой до последней буквы — или, как выражаются враги языка, от слова "совсем",— мы не поймем, в честь чего вдруг еще один банкет. А ведь повод для банкета будет весьма достойный.

Читайте также: