Метод маскама и гилберта химический кратко

Обновлено: 02.07.2024

Секвенирование Максама – Гилберта это метод Секвенирование ДНК разработан Аллан Максам и Уолтер Гилберт в 1976–1977 гг. Этот метод основан на азотистое основание-специфическая частичная химическая модификация ДНК и последующая расщепление остова ДНК на сайтах, прилегающих к модифицированному нуклеотиды. [1]

Пример реакции Максама – Гилберта секвенирования. Расщепление одного и того же помеченного сегмента ДНК в разных точках дает меченые фрагменты разного размера. Затем фрагменты можно разделить с помощью гель-электрофореза.

Секвенирование Максама – Гилберта было первым широко применяемым методом секвенирования ДНК, и наряду с Метод дидезокси Сэнгера, представляет собой первое поколение методов секвенирования ДНК. Секвенирование Максама – Гилберта больше не широко используется, его заменили секвенирование следующего поколения методы.

Содержание

История

Хотя Максам и Гилберт опубликовали свой метод химического секвенирования через два года после Фредерик Сэнгер и Алан Коулсон опубликовали свою работу по секвенированию плюс-минус, [2] [3] Секвенирование Максама – Гилберта быстро стало более популярным, так как очищенную ДНК можно было использовать напрямую, в то время как первоначальный метод Сэнгера требовал, чтобы каждое начало чтения было клонированный для производства одноцепочечной ДНК. Однако с улучшением метода обрыва цепи (см. Ниже) секвенирование Максама – Гилберта вышло из моды из-за своей технической сложности, запрещающей его использование в стандартных наборах молекулярной биологии, широкого использования опасных химических веществ и трудностей с масштабированием. вверх. [4]

Процедура

Фрагменты в четырех реакциях: электрофорез бок о бок в денатурирующих акриламидных гелях для разделения по размеру. Для визуализации фрагментов гель экспонируют на рентгеновской пленке в течение авторадиография, что дает серию темных полос, каждая из которых показывает расположение идентичных радиоактивно меченных молекул ДНК. По наличию и отсутствию определенных фрагментов можно сделать вывод о последовательности. [1] [6]

Связанные методы

Этот метод привел к анализу интерференции метилирования, который используется для картирования сайтов связывания ДНК для ДНК-связывающие белки. [7]

Автоматический протокол секвенирования Максама – Гилберта был разработан в 1994 году. [8]

Секвенирование ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) - это процедура, выполняемая в лабораториях молекулярной биологии, которая позволяет узнать порядок нуклеотидов в интересующем генетическом материале. Кроме того, секвенирование РНК (рибонуклеиновая кислота) также может быть выявлено.

Эта техника была необходима для развития биологических наук. Это также применимо к другим областям знаний, таким как, например, медицинская диагностика и судебно-медицинская экспертиза..


Ранее секвенирование цепи ДНК считалось медленной и дорогой активностью, которая позволяла идентифицировать только несколько пар оснований в олигонуклеотидах..

В настоящее время, при всех достижениях науки, секвенирование ДНК является обычной операцией во многих лабораториях по всему миру благодаря вкладу почти 50 лет исследований в этой области. Что касается длины цепочки, вы можете упорядочить до миллионов пар оснований за очень короткое время.

Для этого разработаны десятки методов, которые различаются по цене и точности. В этой статье мы опишем как классические, так и современные методы, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки..

До настоящего времени методы секвенирования позволяют получить последовательность полных геномов, от небольших прокариот и дрожжей до генома человека..

  • 1 Структура ДНК
  • 2 История
  • 3 метод Сэнгера
    • 3.1 Основные компоненты реакции
    • 3.2 Чтение результатов
    • 5.1 Процедура
    • 5.2 Чтение результатов
    • 6.1 Пиросеквенирование
    • 6.2 Секвенирование по синтезу
    • 6.3 Секвенирование путем лигирования
    • 6.4 Секвенирование ионного торрента
    • 7.1 Секвенирование человеческого генома

    Структура ДНК

    Чтобы понять методы и приемы, используемые для секвенирования ДНК, необходимо знать некоторые ключевые аспекты структуры и состава молекулы..

    ДНК - это биомолекула, встречающаяся во всех живых организмах, от бактерий до крупных водных животных. Органеллы - как митохондрии и хлоропласты - имеют внутри кольцевую молекулу ДНК. Даже в некоторых вирусах обнаружен генетический материал ДНК.

    Структурно ДНК представляет собой набор нуклеотидов. Каждый из них объединен углеводом, азотистым основанием (А, Т, С или G) и фосфатной группой. Целью секвенирования ДНК является выявление порядка, в котором четыре азотистых основания находятся в последовательности.

    история

    В середине 1950-х годов исследователи Уотсон и Крик описали структуру ДНК, используя христологические методы. Однако ни один из этих исследователей не смог найти способ раскрыть последовательность.

    Хотя были некоторые предшественники, самым важным событием было создание метода Сэнгера в 1977 году. Отец метода Фредерик Сэнгер был британским биохимиком, лауреатом двух Нобелевских премий за его огромный вклад в биологические науки..

    Метод Сэнгера

    Развитие метода Сэнгера стало важным событием в молекулярной биологии. Он включает в себя основные компоненты процесса репликации ДНК, который обычно происходит в клетке, но путем добавления специального компонента: дидезоксинуклеотидов.

    Основные компоненты реакции

    - ДНК-полимераза: фермент ДНК-полимераза является важнейшим элементом процесса. Эта молекула участвует в репликации цепи ДНК, и ее роль заключается в синтезе новой цепи, сопоставляя трифосфат дезоксирибонуклеотидов с комплементарными..

    Помните, что в ДНК тимины (T) соединены с аденинами (A) посредством двух водородных связей, а цитозин (C) - с гуанином (G) тремя мостиками..

    - Нуклеотиды: секвенирование Сэнгера включает два типа нуклеотидов: четыре 2'-дезоксинуклеотида (сокращенно dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и четыре дидезоксинуклеотида (ddATP, ddGTP, ddCTP и ddTTP).

    Хотя дидезоксинуклеотиды похожи на мономеры, которые обычно включены в ДНК, в их структуре отсутствует группа -ОН. Это делает невозможным добавление нового нуклеотида в цепь.

    Поэтому, когда специальный нуклеотид добавляется - совершенно случайным образом - к формирующейся цепи, синтез парализуется. Таким образом, в конце реакции, есть цепи разных размеров, каждая из которых, где реакция была остановлена ​​в другой точке.

    Экспериментально подготовлено четыре испытания. Каждый содержит ДНК, извлеченную из представляющего интерес биологического образца, нормальные нуклеотиды и один из четырех типов специальных нуклеотидов. Или специальные нуклеотиды помечены каким-то типом флуоресцентного маркера (см. Ниже автоматическое секвенирование).

    Чтение результатов

    Первым шагом является разделение каждой из синтезированных цепей в соответствии с их размером. Некоторые будут длиннее других, в зависимости от того, где были включены специальные базы.

    Существуют различные биохимические методы, которые позволяют разделять компоненты смеси, используя размер как дискриминационное свойство. В методе Сэнгера различные цепи разделяют электрофорезом. В самых сложных вариантах методики используется капиллярный электрофорез.

    Таким образом, более длинные пряди движутся меньше, чем более короткие варианты. Затем эта система проходит через ридер, который распознает маркер, включенный в каждый дидезоксинуклеотид. Таким образом, порядок последовательности может быть известен.

    Автоматическая последовательность

    Когда требуется крупномасштабное секвенирование, процесс ускоряется за счет автоматизации. Это вариант метода обрыва цепи Сангера, где праймеры помечены флуоресцентными продуктами, чтобы их можно было различить.

    Впоследствии продукт реакции запускается в электрофорезе - все в одной полосе. Когда каждый фрагмент покидает последнюю часть геля, он быстро идентифицируется по флуоресцентной метке с ошибкой, которая составляет 1%..

    Самые сложные системы имеют систему до 96 капиллярных трубок, управляемых компьютером, соединенным с роботом. То есть 96 образцов ДНК могут быть оценены одновременно. Таким образом, процесс, включающий электрофорез и анализ результатов, полностью автоматизирован.

    За один день эти системы могут упорядочить до 550 000 баз. Во время процесса человеческая работа не нужна, запуск метода занимает всего около 15 минут.

    Секвенирование Максам-Гилберт

    В то же время, когда Сэнгер опубликовал свою работу, двум исследователям по имени Аллан Максан и Уолтер Гилберт удалось разработать другой метод получения последовательности ДНК. Метод приобрел популярность в то время, но позже был заменен улучшением метода Сэнгера..

    В отличие от метода Сэнгера, секвенирование Максана и Гилберта (или химическое секвенирование, как оно также известно) не включает реакции гибридизации. Методология состоит из маркировки реакционноспособными агентами на одном конце с последующим процессом очистки.

    Один из негативных аспектов этого метода заключается в его огромной сложности и в использовании химических веществ, которые опасны для пользователя. Химические нарушения вызваны применением DMS, муравьиной кислоты, гидразина и гидразина с солями.

    процесс

    Протокол начинается с маркировки на 5'-конце цепи с помощью фосфорного маркера 32, затем происходит химическая модификация азотистого основания, и оно отделяется. Наконец происходит расщепление абазической области.

    Сначала последовательность, которую нужно упорядочить, укорачивается на более мелкие сегменты. Этот шаг выполняется с ферментами рестрикции, которые приводят к выдающимся крайностям.

    Далее реакцию проводят с щелочной фосфатазой, целью которой является удаление фосфатной группы. Таким образом, полинуклеотидкиназа может быть использована для осуществления мечения.

    Цепочка денатурирована (две нити открыты). Затем мы приступаем к применению химических веществ. Эти реакции расщепления проводятся контролируемым образом, и какие типы связей разрушаются каждым применяемым химическим веществом..

    Чтение результатов

    Как и в методе Сэнгера, считывание результатов включает разделение по размеру цепей, полученных в системе электрофореза. Системы, состоящие из полиакриламида, позволяют получить очень адекватное разрешение для считывания геля..

    Массивная последовательность

    Массивное секвенирование охватывает серию новых методов, сокращенно NGS, от английского "Следующее поколение ".

    Методы, занесенные в каталог как NGS, требуют предварительного этапа амплификации ДНК (они не работают с одной молекулой). Кроме того, используемые платформы сильно различаются. Принципы наиболее популярных методов будут описаны ниже:

    пиросеквенирование

    Он включает в себя мониторинг высвобождения пирофосфата, который происходит каждый раз, когда новый нуклеотид добавляется к цепи ДНК. Ферментная система связана, так что излучение света (которое обнаруживается камерой) происходит каждый раз, когда вводится новый нуклеотид.

    Процесс начинается с отдельной инкубации каждого азотистого основания, чтобы проверить, существует ли излучение света. Пиросеквенирование может выполнять чтение длинных цепей, но найденная частота ошибок высока.

    Секвенирование по синтезу

    Это включает в себя включение меченых нуклеотидов. Эти флуоресцентные компоненты добавляют, промывают и отмечают включенный нуклеотид. Затем маркировка нуклеотида устраняется, и синтез цепи может продолжаться. На следующем этапе также будет включен меченый нуклеотид, и упомянутые этапы будут повторены.

    Недостаток этого метода заключается в том, что флуоресцентные маркеры не полностью устранены. Эти выбросы создают фоновые ошибки, что приводит к значительным ошибкам.

    Секвенирование путем лигирования

    Этот метод отличается от других, так как он не использует ДНК-полимеразу. Вместо этого ключевым ферментом для этой методологии является лигаза. Здесь используются фрагменты ДНК, флуоресцентно меченные, связанные ферментом и обнаруживаемые.

    Самая большая проблема с этой техникой - очень короткая длина фрагмента, которая способна обрабатывать.

    Ионный секвенирующий торрент

    Этот метод основан на измерении иона Н + который высвобождается каждый раз, когда новый нуклеотид включен. Принцип очень похож на пиросеквенирование, но гораздо дешевле.

    примеров

    Секвенирование генома человека

    Секвенирование генома человека было одной из самых многообещающих задач в биологии, а также одним из самых известных конкурентов в истории науки. Фактически, для ученых, участвующих в проекте, секвенирование генома стало соревнованием..

    В 1995 году Вентер объявил о своем успехе в полном секвенировании бактериального генома методом случайного секвенирования. Аналогичным образом, противоположная команда объявила год спустя о секвенировании дрожжевого генома..

    В 2000 году гонка была прекращена. Обе компании опубликовали свои предварительные результаты полного генома в двух самых престижных научных журналах: природа и наука.

    Тем не менее, ученые продолжили работу над улучшением предложений, и в 2006 году были завершены последовательности определенных человеческих хромосом..

    Важность и приложения

    Знание порядка нуклеотидов молекулы, столь же важной, как ДНК, является ценным для биологов и связанных с ними специалистов. Эта цепочка полинуклеотидов содержит всю информацию, необходимую для развития и поддержания всех форм жизни.

    По этим причинам знание этой последовательности необходимо для биологических исследований. По сути, секвенирование позволяет нам измерить одно из важнейших свойств биологических систем и установить различия между ними.

    Секвенирование широко используется таксономистами и систематиками, поскольку определенные последовательности ДНК позволяют установить критерии для определения того, принадлежат ли два организма одному и тому же виду или нет, а также могут выдвигать гипотезы о филогенетических отношениях между ними..

    Кроме того, секвенирование ДНК имеет приложения в области медицины и диагностики. Например, существуют доступные и доступные системы, которые посредством секвенирования позволяют нам оценить тенденцию развития определенных заболеваний (таких как рак) с использованием так называемых простых нуклеотидных полиморфизмов (SNP)..

    Расследования криминалистического и криминалистического типа также были обогащены методами упорядочения и могут быть использованы в качестве надежного доказательства участия определенного лица в преступлении..

    Используется для секвенирования одно- и двухцепочечных фрагментов ДНК.

    1) специфическая химическая фрагментация изучаемого полинуклеотида

    2) фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом 32 Р по 5'- или 3'-концу. У двухцепочечной ДНК метятся обе цепи

    3) Подготовка меченных фрагментов к секвенированию. Для этого используются клонирующие векторы, содержащие синтетические полилинкеры. После гидролиза рестриктазами, образующими липкие концы, с помощью фрагмента Кленова избирательно метят клонированные фрагменты по одному концу.

    4) Меченные фрагменты делят на порции и каждую подвергают определенной химической модификации. Ее проводят так, чтобы на одну молекулу ДНК в среднем приходилось по одной метке.

    Пуриновые основания: диметилсульфат – метилирование аденина по положению N 3 , гуанина – N 7 . Обработка 0,1М HCl при температуре 0ºС приводит к отщеплению метиладенина. Инкубация при 90ºС в щелочной среде (0,1М NaOH) вызывает разрыв цепи ДНК в местах отщепления оснований. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК по остаткам метилгуанина.

    Пиримидиновые основания: гидразин. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются тимин и цитозин, а в присутствии 2М NaCl – только цитозин. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК пр точкам модификации

    5) После параллельного проведения четырех различных обработок фрагмента ДНК полученные субфрагменты разделяют путем электрофореза в полиакриламидном геле на соседних дорожках

    6) С помощью радиоавтографии геля на рентгеновской пленке считывается нуклеотидная последовательность ДНК

    Экспрессия в клетках бактерий рекомбинантных ДНК

    Одна из важнейших задач генной инженерии – создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных, которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов.

    Используется для секвенирования одно- и двухцепочечных фрагментов ДНК.

    1) специфическая химическая фрагментация изучаемого полинуклеотида

    2) фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом 32 Р по 5'- или 3'-концу. У двухцепочечной ДНК метятся обе цепи

    3) Подготовка меченных фрагментов к секвенированию. Для этого используются клонирующие векторы, содержащие синтетические полилинкеры. После гидролиза рестриктазами, образующими липкие концы, с помощью фрагмента Кленова избирательно метят клонированные фрагменты по одному концу.

    4) Меченные фрагменты делят на порции и каждую подвергают определенной химической модификации. Ее проводят так, чтобы на одну молекулу ДНК в среднем приходилось по одной метке.

    Пуриновые основания: диметилсульфат – метилирование аденина по положению N 3 , гуанина – N 7 . Обработка 0,1М HCl при температуре 0ºС приводит к отщеплению метиладенина. Инкубация при 90ºС в щелочной среде (0,1М NaOH) вызывает разрыв цепи ДНК в местах отщепления оснований. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК по остаткам метилгуанина.

    Пиримидиновые основания: гидразин. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются тимин и цитозин, а в присутствии 2М NaCl – только цитозин. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК пр точкам модификации

    5) После параллельного проведения четырех различных обработок фрагмента ДНК полученные субфрагменты разделяют путем электрофореза в полиакриламидном геле на соседних дорожках

    6) С помощью радиоавтографии геля на рентгеновской пленке считывается нуклеотидная последовательность ДНК

    Экспрессия в клетках бактерий рекомбинантных ДНК

    Одна из важнейших задач генной инженерии – создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных, которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов.

    Секвенирование нуклеиновых кислот - это определение их первичной нуклеотидной последовательности.

    Некоторые задачи генетического анализа:

    • расшифровка абсолютно неизвестных последовательностей ДНК, например, генома какого-нибудь нового вида (секвенирование "de novo");
    • обнаружение индивидуальных отличий конкретного образца от обобщенной последовательности, которая в общих чертах уже известна (ресеквенирование);
    • анализ генетических полиморфизмов, включая однонуклеотидные (SNP-типирование);
    • анализ эпигенетических модификаций ДНК, например профиля метилирования;
    • анализ профиля экспрессии отдельных клеток секвенированием кДНК, полученной из тотальной мРНК клетки, например, для диагностики вирусных и раковых заболеваний и др.

    Таблица сравнения производительности секвенаторов.

    Классификация генетических анализаторов.

    1. По гомогенности пробы: ♦ гомогенная проба (очищенный раствор молекул НК, полученных из одного источника, одинаковой структуры и практически одинаковой длины) -
      "классические" секвенаторы;
      ♦ негомогенная проба ("библиотека" молекул НК, которые могут отличаться по длине, по структуре и могут быть получены из различных источников) -
      "NGS" - секвенаторы.
    2. По длине прочтений: ♦ короткие чтения;
      ♦ средние чтения;
      ♦ длинные чтения.
    3. По используемой технологии: ♦ метод Маскама и Гилберта (химический);
      ♦ технология по методу Сэнгера;
      ♦ метод пиросеквенирования;
      ♦ технология "454";
      ♦ технология "ionTorrent";
      ♦ технология "SOLiD";
      ♦ технология "Solexa";
      ♦ технология "WildFire".
    4. По количеству отдельных чтений за запуск.
    5. По количеству одновременно анализируемых образцов (мультиплексирование).
    6. По времени, необходимому на запуск.
    7. По дополнительным требованиям.
    8. По стоимости секвенатора.
    9. По стоимости одного запуска.
    10. По стоимости анализа отдельной пробы.
    11. По методам генетического анализа.

    Методы секвенирования.

    "Классический" метод Сэнгера (ферментативный).
    Метод секвенирования НК путем "обрыва цепи" (Ф.Сэнгер) основан на синтезе новой ДНК-цепи на анализируемой ДНК-матрице с участием ДНК-полимеразы в присутствии праймера и смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) и на случайном обрыве синтезируемой цепи при встраивании одного из меченных разными флуоресцентными красителями дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). Поскольку "обрыв цепи" происходит статистически, то получается весь набор ДНК-фрагментов, отличающихся между собой по длине всего на один нуклеотид. Затем полученная смесь ДНК-фрагментов обрабатывается формамидом для расхождения цепей и подвергается капиллярному электрофорезу в полиакриламидном геле, в результате чего фрагменты распределяются по длине. Сканирование лазером, возбуждающим флуоресценцию красителей, которыми были помечены дидезоксинуклеотидфосфаты, позволяет определить последовательность нуклеотидов исходной молекулы НК.

    В клетке ДНК-полимераза I участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются предшественники ДНК - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двухцепочечный участок - затравка, с которого начинается синтез (рис. 1). Синтезированы модифицированные дидезоксирибонуклеотиды, в которых дезоксирибоза 3’-ОН отсутствует, для каждого из четырех оснований ДНК. ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК. Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид (ddNTP). Поэтому их называют терминаторами элонгации.


    Рис. 1. Ферментативный метод секвенирования ДНК.

    Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи ДНК, нуклеотидную последовательность которой надо определить, короткого фрагмента "меченой" ДНК, комплементарной концевому отрезку этой цепи (затравка), одного из четырех ddNTP и соответствующего dNTP в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех dNTP. Готовят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четырех ddNTP. В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов разной длины. Длина их зависит от того, в каком месте в цепь включен дефектный нуклеотид. Полученные меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 1).

    В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины - вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов про- и эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось делать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка. Сейчас часто бывает проще определить структуру белка через нуклеотидную последовательность, чем с помощью прямого секвенирования. Если секвенирование белка занимает месяцы и даже годы, то ДНК удается секвенировать за несколько недель.

    Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК. В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. – геном арабидопсиса, в 2000 году – геном человека, однако в данном случае речь идет только об установлении последовательности нуклеотидов, так как генетическая структура и функции отдельных участков генома еще не идентифицированы, это более сложная задача.

    Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирования появились столь же быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной последовательностью. Теперь за три-четыре дня можно синтезировать последовательность из 12 - 20 нуклеотидов. Автоматизация этой процедуры еще более облегчает и ускоряет синтез. Появились приборы - ДНК-синтезаторы, которые выполняют эту работу за несколько часов.

    В "классических" секвенаторах для анализа используется гомогенная проба. Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участков ДНК, последовательность которых требуется определить, при помощи ПЦР. В результате получается гомогенная проба одинаковых ДНК-фрагментов. Негомогенность исходной пробы, или ошибки в ходе ПЦР-реакции могут привести к тому, что не удастся однозначно определить генетическую структуру молекулы нуклеиновой кислоты.

    Метод пиросеквенирования.
    Метод секвенирования НК (П. Ниреном) основан на синтезе новой ДНК-цепи на иммобилизированной анализируемой ДНК-матрице с участием ДНК-полимеразы в присутствии праймера при последовательном добавлении каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). При встраивании нуклеотида стехиометрически высвобождается пирофосфат (PPi). Пирофосфат (PPi) ферментом ATP-сульфурилазой в присутствии аденозин-5'-фосфосульфата (dATPαS) превращается в ATP, которая является "топливом" для фермента люциферазы, превращающей люциферин в оксилюциферин с испусканием света. Свет регистрируется камерой и далее анализируется компьютерной программой. Невстроенные нуклеотиды подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом.

    Бисульфитный метод.
    Метод для определения паттерна (профиля) метилирования ДНК основан на бисульфитной обработке ДНК, первращающей остатки цитозина в остатки урацила, но не затрагивающей метилированные остатки 5-метилцитозина. Дальнейший анализ сводится к различению однонуклеотидных полиморфизмов, и к разделению цитозинов и тиминов в прочитанных последовательностях.

    В Секвенирование ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) - это процедура, выполняемая в лабораториях молекулярной биологии, которая позволяет узнать порядок нуклеотидов в интересующем генетическом материале. Кроме того, также может быть раскрыто секвенирование РНК (рибонуклеиновой кислоты).

    Этот метод был незаменим для развития биологических наук. Это также применимо к другим областям знаний, таким как, например, медицинская диагностика и судебно-медицинские исследования.

    Ранее секвенирование цепи ДНК считалось медленным и дорогостоящим мероприятием, которое позволяло идентифицировать только несколько пар оснований в олигонуклеотидах.

    Сегодня, при всех достижениях науки, секвенирование ДНК стало рутинной операцией во многих лабораториях по всему миру благодаря вкладу почти 50-летних исследований в этой области. Что касается длины цепи, за очень короткое время можно секвенировать до миллионов пар оснований.

    Для этого разработаны десятки методик, различающихся по цене и точности. В этой статье мы опишем как классические, так и современные техники, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки.

    До сих пор методы секвенирования позволяют получить последовательность полных геномов, от небольших прокариот и дрожжей до генома человека.

    Структура ДНК

    Чтобы понять методы и методы, используемые для секвенирования ДНК, необходимо знать некоторые ключевые аспекты структуры и состава молекулы.

    ДНК - это биомолекула, обнаруженная во всем живом, от бактерий до крупных водных животных. Органеллы, такие как митохондрии и хлоропласты, имеют внутри кольцевую молекулу ДНК. Даже у некоторых вирусов обнаруженный генетический материал - это ДНК.

    Структурно ДНК представляет собой набор нуклеотидов. Каждый из них состоит из углевода, азотистого основания (A, T, C или G) и фосфатной группы. Цель секвенирования ДНК - выявить порядок, в котором четыре азотистых основания находятся в последовательности.

    История

    В середине 1950-х исследователи Уотсон и Крик описали структуру ДНК, используя христолографические методы. Однако ни один из этих исследователей не смог найти способ разгадать последовательность.

    Хотя были определенные предшественники, наиболее важным событием было создание метода Сенгера в 1977 году. Фредерик Сэнгер, отец метода, был британским биохимиком, лауреатом двух Нобелевских премий за его огромный вклад в биологические науки.

    Метод Сенгера

    Развитие метода Зангера стало решающим событием в молекулярной биологии. Он включает в себя основные компоненты процесса репликации ДНК, который обычно происходит в клетке, но с добавлением специального компонента: дидезоксинуклеотидов.

    Основные компоненты реакции

    - ДНК-полимераза: фермент ДНК-полимераза является важным элементом процесса. Эта молекула участвует в репликации цепи ДНК, и ее роль заключается в синтезе новой цепи, сопряжении трифосфат-дезоксирибонуклеотидов с комплементарными.

    Напомним, что в ДНК тимины (T) соединяются с аденинами (A) через две водородные связи, а цитозин (C) соединяется с гуанином (G) через три связи.

    - Нуклеотиды: секвенирование по Сэнгеру включает два типа нуклеотидов: четыре 2'-дезоксинуклеотида (сокращенно dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и четыре специальных дидезоксинуклеотида (ddATP, ddGTP, ddCTP и ddTTP).

    Хотя дидезоксинуклеотиды похожи на мономеры, которые обычно встраиваются в ДНК, в их структуре отсутствует группа -ОН. Это делает невозможным добавление к цепи нового нуклеотида.

    Поэтому, когда особый нуклеотид добавляется - совершенно случайным образом - к образующейся цепи, синтез парализуется. Таким образом, в конце реакции появляются цепочки разного размера, каждая из которых останавливает реакцию в другой точке.

    Экспериментально подготовлено четыре теста. Каждый из них содержит ДНК, извлеченную из интересующего биологического образца, нормальные нуклеотиды и один из четырех специальных типов нуклеотидов. Или специальные нуклеотиды помечаются каким-либо типом флуоресцентного маркера (см. Автоматическое секвенирование ниже).

    Чтение результатов

    Первый шаг - разделить каждую из синтезированных цепочек по размеру. Некоторые из них будут длиннее других, в зависимости от того, где были встроены специальные базы.

    Существуют различные биохимические методы, которые позволяют разделить компоненты смеси, используя размер в качестве дискриминационного свойства. В методе Сенгера различные цепи разделяют электрофорезом. В более сложных вариантах методики используется капиллярный электрофорез.

    Таким образом, более длинные пряди перемещаются меньше, чем более короткие варианты. Затем эта система проходит через считыватель, который распознает маркер, включенный в каждый дидезоксинуклеотид. Таким образом можно узнать порядок следования.

    Автоматическая последовательность

    Когда требуется крупномасштабное секвенирование, процесс ускоряется за счет автоматизации. Это разновидность метода терминации цепи Сэнгера, при котором праймеры метят флуоресцентными продуктами для их различения.

    Затем продукт реакции подвергают электрофорезу - и все это на одной дорожке. Когда каждый фрагмент выходит из последней части геля, он быстро идентифицируется по его флуоресцентной метке с погрешностью около 1%.

    Самые сложные системы содержат до 96 капиллярных трубок, управляемых компьютером, соединенным с роботом. То есть одновременно можно тестировать 96 образцов ДНК. Таким образом, процесс электрофореза и анализа результатов полностью автоматизирован.

    За один день эти системы могут секвенировать до 550 000 баз. В этом процессе нет необходимости в человеческом труде, для запуска метода требуется всего около 15 минут.

    Секвенирование Максама-Гилберта

    В то же время, когда Сэнгер опубликовал свою работу, двум исследователям по имени Аллан Максан и Уолтер Гилберт удалось разработать другой метод получения последовательности ДНК. В то время этот метод приобрел популярность, но позже был вытеснен усовершенствованием метода Сангера.

    В отличие от метода Сэнгера, секвенирование Максана и Гилберта (или химическое секвенирование, как его еще называют) не включает реакции гибридизации. Методология состоит из маркировки реактивными агентами на одном конце с последующим процессом очистки.

    Один из отрицательных аспектов этой техники заключается в ее огромной сложности и использовании опасных для пользователя химикатов. Химические разрывы вызываются применением ДМС, муравьиной кислоты, гидразина и гидразина с солями.

    Процесс

    Протокол начинается с маркировки 5'-конца цепи фосфорным маркером 32, затем происходит химическая модификация азотного основания, и оно разделяется. Наконец, происходит расщепление абазической области.

    Сначала вы укорачиваете цепочку, которую хотите разделить на более мелкие сегменты. Этот шаг выполняется с помощью рестрикционных ферментов, что приводит к выступающим концам.

    Далее проводится реакция с щелочной фосфатазой, цель которой - отщепить фосфатную группу. Таким образом, для мечения можно использовать полинуклеотидкиназу.

    Цепочка денатурирована (две нити открываются). Затем применяются химические вещества. Эти реакции расщепления осуществляются контролируемым образом, и известно, какие типы связей разрывает каждое применяемое химическое соединение.

    Чтение результатов

    Как и в методе Сэнгера, считывание результатов включает разделение по размеру цепей, полученных в системе электрофореза. Системы, состоящие из полиакриламида, позволяют получить очень адекватное разрешение для считывания геля.

    Массивное секвенирование

    Методы, классифицируемые как NGS, требуют предварительного этапа амплификации ДНК (они не работают с отдельной молекулой). Кроме того, используемые платформы сильно различаются. Ниже будут описаны принципы работы наиболее популярных методов:

    Пиросеквенирование

    Он включает мониторинг высвобождения пирофосфата, который происходит каждый раз, когда к цепи ДНК добавляется новый нуклеотид. Ферментная система связана, так что излучение света (которое обнаруживается камерой) происходит каждый раз, когда встраивается новый нуклеотид.

    Процесс начинается с отдельной инкубации каждого азотного основания для проверки наличия или отсутствия излучения света. Пиросеквенирование позволяет считывать длинные цепочки, но частота обнаруженных ошибок высока.

    Секвенирование синтеза

    Это включает включение меченых нуклеотидов. Эти флуоресцентные компоненты добавляют, промывают и отмечают включенный нуклеотид. Затем нуклеотидная метка удаляется, и синтез цепи может продолжаться. На следующем этапе также будет включен меченый нуклеотид, и вышеупомянутые этапы будут повторены.

    Недостаток этого метода возникает, когда флуоресцентные маркеры не удалены полностью. Эти выбросы создают фоновые ошибки, приводящие к значительным ошибкам.

    Секвенирование лигирования

    Этот метод отличается от других, поскольку в нем не используется ДНК-полимераза. Вместо этого ключевым ферментом для этой методологии является лигаза. Здесь используются флуоресцентно меченые фрагменты ДНК, она связывается ферментом и обнаруживается.

    Самая большая проблема с этим методом - это короткие фрагменты, которые он способен обрабатывать.

    Секвенирование ионного потока

    Этот метод основан на измерении иона H + который высвобождается каждый раз, когда включается новый нуклеотид. Принцип очень похож на пиросеквенирование, но намного дешевле.

    Примеры

    Секвенирование генома человека

    Секвенирование генома человека было одной из самых многообещающих задач в биологии, а также одним из самых известных соперников в истории науки. Фактически, для ученых, участвовавших в проекте, секвенирование генома стало соревнованием.

    В 1995 году Вентер объявил об успехе полного секвенирования бактериального генома методом случайного секвенирования. Точно так же команда противников объявила год спустя о секвенировании генома дрожжей.

    В 2000 году гонка была прекращена. Обе компании опубликовали свои предварительные результаты по полному геному в двух самых престижных научных журналах: Природа Y Наука.

    Однако ученые продолжали работать над улучшением предложений, и в 2006 году были завершены последовательности определенных хромосом человека.

    Важность и приложения

    Знание порядка расположения нуклеотидов в такой важной молекуле, как ДНК, ценно для биологов и других специалистов. Эта цепочка полинуклеотидов содержит всю информацию, необходимую для развития и поддержания всех форм жизни.

    По этим причинам знание этой последовательности необходимо для биологических исследований. По сути, секвенирование позволяет измерить одно из наиболее важных свойств биологических систем и установить различия между ними.

    Секвенирование широко используется систематиками и систематиками, поскольку определенные последовательности ДНК позволяют установить критерии, позволяющие сделать вывод о том, принадлежат ли два организма к одному виду, в дополнение к возможности выдвигать гипотезы о филогенетических отношениях между ними.

    Кроме того, секвенирование ДНК находит применение в медицине и диагностике. Например, существуют недорогие и доступные системы, которые посредством секвенирования позволяют оценить тенденцию к развитию определенных заболеваний (например, рака) с использованием так называемых однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).

    Расследования криминального и судебно-медицинского характера также были обогащены методами секвенирования, которые могут использоваться как надежные доказательства участия определенного лица в преступлении.

    Читайте также: