Метод диффузии в агар кратко
Обновлено: 02.07.2024
Этот метод точнее, чем метод серийных разведений, поэтому он чаще используется на практике. Однако методу диффузии присущи определенные недостатки. Критерии для оценки данных, полученных с быстрорастущими микроорганизмами, не применимы к медленнорастущим штаммам.
Поэтому если в качестве тест-культуры необходимо использовать медленнорастущий микроор-ганизм, применяют метод разведений или условия испы-тания отрабатывают в специальных экспериментах. То же можно сказать и о медленнодиффундирующих ан-тибиотиках (например, полимиксиие).
Голодный агар разливают по 15 мл в чашки Петри, размещенные на горизонтальном столике. После застывания агара чашки подсушивают в термостате, затем в каждую чашку наливают по 5 мл питательного агара, смешанного с тест-культурой. Количество последней бе-рут из расчета 20 млн клеток на 1 мл среды. Перед вне-сением культуры в агар его необходимо охладить до 45—50°С. Вместо цилиндров можно использовать лунки, которые делают в агаре с помощью специального приспособления. После застывания второго слоя агара на его поверхность наносят по трафарету б цилиндров на каждую чашку. В три из них через один вносят по 0,1 мл испытуемого раствора антибиотика, а в три оставшихся цилиндра вносят по 0,1 мл стандартного раствора (контроль). После этого чашки помещают в термостат при 37°С на 16—18 ч. По истечении этого времени цилиндры удаляют с чашки, а размеры зон задержки роста тест- культуры измеряют. Расчет активности антибиотика по размеру зон задержки может быть произведен на основании расчетных таблиц В. С. Дмитриевой (ГФХ) или по стандартным кривым.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом дисков проводят прежде всего для оценки эффективности антибиотиков в клинических условиях. Питательную среду разливают в чашки, помещенные на строго горизонтальной поверхности, заполнив их на одинаковую высоту 4 мм (25 мл среды для чашек с внутренним диаметром 9 см). Клинический материал или культуру микроорганизмов, выделенную от больного, засевают на поверхность питательного ага-ра сплошным газоном. После посева крышку чашки при-открывают не более чем на 15 мин и дают поверхности среды подсохнуть. Затем стерильным пинцетом следует положить на поверхность агара бумажные диски, про-питанные раствором определенного антибиотика, и слег-ка придавить. Расстояние между дисками и краем чашки должно быть не менее 15 мм. Чашки инкубируют около 18 ч при 37°С в перевернутом положении. При наличии чувствительной к антибиотику флоры вокруг со-ответствующих дисков отмечается зона угнетения роста микроорганизмов. Диаметр зоны измеряют с точностью до 1 мм. Соотношение чувствительности микроорганиз-мов к антибиотику и диаметра зоны его угнетения зави-сит при соблюдении стандартных условий испытания от антибиотика и вида тест-культуры (табл. 12).
Принцип данного метода заключается в диффузии антибиотиков из бумажного диска, помещенного на твердую агаровую среду, засеянную испытуемой культурой. Наличие зоны задержки микробного роста вокруг диска и ее размер служат показателями чувствительности данного микроорганизма к противомикробному средству. Отсутствие зоны задержки роста вокруг диска свидетельствует об устойчивости микроорганизма к испытуемому препарату. Диски с антибиотическим препаратом изготовляют из фильтровальной бумаги диаметром 6 мм. В каждом диске создается стандартное количество противомикробного средства, соответствующее требованиям ВОЗ. Диски находятся во флаконе, на этикетке которого указано точное количество антибиотического препарата в одном диске. Флаконы с дисками хранят при температуре от 4 до 20 °С. Когда флаконы с дисками вынимают из холодильника, их, прежде чес открыть, выдерживают в течение часа при комнатной температуре, чтобы предотвратить конденсацию водяных паров. После вскрытия флакона диски с большинством антибиотиков можно использовать в течение 30 дней, а с препаратами пенициллиновой группы – в течение 7 дней.
Расплавленный питательный агар разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри. Готовые чашки могут храниться при температуре не выше 6°С в течение 7 суток. Непосредственно перед посевом чашки Петри подсушивают в течение 45-60 мин в термостате при 37°С с приоткрытыми крышками.
В качестве посевного материала используют суточную бульонную культуру или смыв с суточной агаровой культуры. Бактериальную миллиардную взвесь в объеме 1 мл наносят на агар и равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды покачиванием чашки. Затем чашку наклоняют для стока избытка жидкости, которую удаляют пипеткой.
Перед нанесением дисков чашки Петри подсушивают с приоткрытыми крышками при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Диски с различными антибиотиками стерильным пинцетом плотно накладывают на поверхность засеянной среды. В каждую чашку помещают не более шести дисков на расстоянии примерно 2 см друг от друга и от края чашки, чтобы исключить возможность наложения зон торможения роста от разных дисков. Чашки с дисками инкубируют в течение 18 часов при температуре 37 °С в перевернутом положении, чтобы предотвратить размывание газона конденсационной жидкостью.
Измерение диаметров зон задержки роста проводят с точностью до 1 мм с помощью линейки. Отсутствие зоны задержки роста вокруг диска указывает на устойчивость испытуемого возбудителя к данному антибиотику. При зоне лизиса диаметром до 10 мм штамм расценивается как малочувствительный. Зоны диаметром > 10 мм указывают на чувствительность штамма к данной концентрации противомикробного препарата. По таблице 2 можно количественно оценить степень чувствительности микроорганизма к антибактериальным препаратам в зависимости от диаметра зоны задержки роста и значения МПК.
Таблица 2 – коррелятивная связь диаметра зон задержки роста микроорганизмов с МПК антибиотиков
Антибиотик, содержащийся в диске | Содержание антибиотика в диске, мкг | Диаметр зон задержки роста, мм | МПК, мкг/мл | ||
Устойчивые штаммы | Умеренно устойчивые штаммы | Чувстви-тельные штаммы | Чувстви-тельные штаммы | Устойчи-вые штаммы | |
Ампициллин | ≤ 20 | 21-28 | ≥ 29 | ||
Пенициллин для гр(-) бактерий для гр(+)бактерий | ≤ 20 ≤ 9 | 21-28 10-13 | ≥ 29 ≥ 14 | ≤ 0,1 ≤ 5-15 | ≥ 1.5 ≥ 32 |
Гентамицин | ≤ 13 | - | ≥ 14 | ≤ 6 | ≥ 6 |
Доксициклин | ≤ 12 | 13-19 | ≥ 20 | ≤ 4 | ≥ 12 |
Канамицин | ≤ 14 | 15-18 | ≥ 19 | ≤ 6-10 | ≥ 25 |
Левомицетин | ≤ 12 | 13-19 | ≥ 20 | ≤ 12,5 | ≥ 25 |
Линкомицин | ≤ 19 | 20-23 | ≥ 24 | ≤ 2 | ≥ 8 |
Метициллин | ≤ 13 | 14-17 | ≥ 18 | ≤ 6 | ≥ 25 |
Неомицин | ≤ 13 | 14-17 | ≥ 18 | ≤ 10 | ≥ 25 |
Олеандомицин | ≤ 12 | 13-17 | ≥ 18 | ≤ 5 | ≥ 10 |
Оксациллин | ≤ 19 | 20-23 | ≥ 24 | ≤ 6 | ≥ 32 |
Полимиксин | ≤ 8 | 9-12 | ≥ 13 | ≤ 10 | ≥ 50 |
Ристомицин | ≤ 14 | 15-17 | ≥ 17 | ≤ 10 | ≥ 25 |
Рифампицин | ≤ 9 | 10-12 | ≥ 13 | ≤ 15 | ≥ 25 |
Стрептомицин | ≤ 13 | 14-16 | ≥ 17 | ≤ 10 | ≥ 25 |
Тетрациклин | ≤ 15 | 16-19 | ≥ 20 | ≤ 5 | ≥ 10 |
Эритромицин | ≤ 14 | 15-18 | ≥ 19 | ≤ 2 | ≥ 8 |
По рекомендации ВОЗ при определении диаметра задержки роста не учитывают очень маленькие колонии, выявляемые при определенных условиях освещения в пределах зоны торможения роста. В случае образования зон задержки роста с не резко очерченными краями измеряют диаметр только четко выраженной зоны, не принимая во внимание едва заметные колонии.
Читайте также: