Фотоэлектроколориметр принцип действия кратко

Обновлено: 02.07.2024

В основе любого фотометра, фотоэлектроколориметра, спектрофотометра лежат физические законы поглощения света. Указанные диагностические приборы нашли широкое применение в медико-биологической практике для определения концентрации веществ в биологических жидкостях ( моча, плазма крови, лимфа), что имеет важное значение при постановке правильного диагноза. В рамках данной статьи познакомимся с принципом работы фотоэлектроколориметра а также приведем подборку сервисной и не только документации для диагностики и ремонта медтехники.

Цифровой фотоэлектроколориметр AE-30F
Колориметр фотоэлектрический КФК-2МП
Фотометр КФК-3
Микроколориметр Фотоэлектрический МКМФ-1

Устройство и принцип работы фотометра

Фотометр или фотоэлектроколориметр (сокращенно ФЭК)используется для вычисления концентраций различных окрашенных растворов по поглощению света ими. Структурная схема типового однолучевого фотметра представлена на рисунке ниже:

1- Лампа; 2- Cветофильтр; 3- Кювета для растворов; 4-Фотоприёмник; 5- Преобразователь сигнала (усилитель); 6- устройство измерительное (гальванометр).

Луч света от источника света - лампы светит через светофильтр. Полученный монохроматический свет следует через кювету с раствором. Кюветы их минимум две или более представляют из себя сосуды, в которые наливают раствор для сравнения и исследуемый. Кюветы изготавливаются из прямоугольной формы с заданным расстоянием между своими стенками. Для измерений важен не общий объём раствора, а толщина слоя, которая задается расстоянием между передними и задними стенками. Кюветы изготавливают из прозрачного стекла, пропускающего все лучи видимого светового спектра. Для анализа в ультрафиолетовом спектре частот используют кюветы сделанные из кварца пропускающие УФ лучи.

Прошедший через раствор световой спектр, следует на фотоприёмник, обычного в его роли используется фотодиод, преобразующий энергию световой волны в электрический ток. Полученный электрический сигнал усиливается усилителем и попадает на устройство измерительное (гальвонометр). На нем имеются две шкалы. На нижней нанесены значения оптической плотности раствора, а на верхней - коэффициента пропускания в %.

Принцип измерения оптической плотности и коэффициента пропускания базируется на том, что на фотоприёмник поочерёдно направляют потоки света - прошедший через анализируемый раствор и полный . Вначале под луч светового потока ставят кювету с раствором сравнения ( дистиллированная вода или какой-то растворитель).

Изменением чувствительности фотометра добиваются, чтобы отсчёт по первой шкале коэффициентов пропускания был равен 100 делениям (или был равен нулю по шкале оптической плотности - вторая шкала). Т.е, полный световой поток условно принимается за 100% - полный. Затем в него помещают кювету с анализируемым раствором. Из-за поглощения света этим раствором световой поток уменьшается, и стрелка измерительного прибора отклоняется от нуля. По показаниям стрелки определяют значение коэффициента пропускания или оптической плотности.

Фотометр широко используется в клинико-биохимических исследованиях. Фотометр позволяет производить измерения коэффициентов пропускания рассеивающих эмульсий, взвесей, и коллоидных растворов в проходящем свете. В зависимости от применяемого реактива, определяют количество гемоглобина в крови, количество желчных пигментов и белка, мочевины в сыворотке, креатина в моче и сыворотке, мочевой кислоты, глюкозы в моче и крови, железа, кальция, фосфора и др.

Для исследования процесса оксигенации (насыщения крови кислородом)в лабораторной медицинской техники применяют методы неинвазивной или инвазивной спектрофотометрии.

Главным параметром оксигенации является степень насыщения гемоглобина крови кислородом SpO 2 , Эта характеристика получила название сатурация крови кислородом.

В основе применения фотометрических способов при вычислении параметра оксигенации крови лежит свойство измерения поглощения света, прошедшего через пробу с кровью, в различных диапазонах спектрального света. Метод основана на использовании закона Бера-Ламберта с учетом того важного факта, что каждая из известных четырех форм гемоглобина обладает своим собственным спектром поглощения. Так, например, оксигемоглобин (- НbO 2 ) обладает минимумом поглощения в красной части спектра. Напротв, редуцированный гемоглобин (НЬ) в этой же части спектра обладает более высокое поглощение. В ИК части спектра поглощение НЬО 2 будет выше поглощения НЬ. Также можно выделить отдельные участки светового спектра, где оптические свойства метгемоглобина (metHb)резко отличаются от других составляющих крови. Спектральная характеристика карбоксигемоглобина (СОНЬ) несет резко падающий характер, и в ИК - диапазоне ее поглощения практически нет.

Поэтому, для анализа всех четырех фракций сатурации так важно применять четыре разные длины волны излучения. Многолучевая спектрофотометрия применяется в кровяных оксиметрах. Исследования показали, что аппараты неинвазивного чрезкожного измерения сатурации артериальной крови кислородом дают достаточно нестабильные показания из-за присутствия различных неоднородных тканевых структур, окружающих сосуды. Поэтому в лабораторной практике применяется прямая инвазивная спектрометрия крови, в которой используют волоконно-оптические оксиметры, позволяющие осуществлять лабораторную оценку оксигенации венозной крови (SvO2).

В этих разновидностях фотометров применяются специальные катетеры, которые вводят в легочную артерию или подключичную вену. В катетеры помещаются два световода, соединенные с источником света и фотоприемнику соответственно, причем в световодах может быть несколько оптических волокон, что позволяет параллельно и независимо принимать и пропускать излучения, с разными длинами волн.

На рисунке ниже изображена структура инвазивного абсорбционного измерителя, в котором анализируется величина поглощения света компонентами крови, расположенными между обоими торцами световода.

Если приемник и источник расположить под углом 90°, то будет анализироваться не поглощательная, а отражательная способность крови, т.е мы видим нефелометрический способ исследования.

Коэффициенты отражения у оксигемоглобина и гемоглобина сильно отличаются на длинах волн 620. 650 нм. Это дает возможность строить двулучевые устройства определения параметров оксигенации крови повышенной точности. На рисунке ниже приведена схема двухчастотного датчика насыщения крови кислородом, состоящего из трех световодов, одного фотодиода (ФД) и двух светодиодов (СД1, СД2).

По первым двум световодам оптическое излучение с длинами волн λ1 и λ2 поступает к исследуемой крови. По третьему световоду отраженное от элементов крови излучение следует на фотоприемник. На полученных частотах можно рассчитать отклонение сигналов λ1 и λ2 и определить показатель сатурации крови.

При прохождение светового пучка через слой вещества его интенсивность снижается вследствие взаимодействия квантов света с электронами вещества, поэтому чего часть энергии света передается электронам.

Поглощением света принято считать ослабление интенсивности света при прохождении через любой материал вследствие преобразования световой энергии в другие виды.

Общий принцип измерения состоит в поочередном сравнении интенсивностей световых потоков, проходящих через раствор сравнения и фотометрируемый раствор. Поглощение анализируемого раствора измеряют относительно раствора сравнения (последнее принимают за оптический нуль). Интенсивности световых потоков измеряют фотометрическим способом после преобразования излучения в электрический сигнал. Общий принцип приборов для измерения поглощения (фотоэлектрических колориметров) заключается в том, что поток электромагнитного излучения, прошедший через фотометрируемый раствор, попадает на фотоэлемент, который преобразует энергию излучения в электрическую. Согласно законам фотоэффекта, сила возникающего фототока прямо пропорциональна интенсивности электромагнитного излучения, падающего на фотоэлемент. В связи с этим отношение интенсивностей потоков электромагнитных излучений в математическом выражении закона Бугера-Ламберта-Бера может быть заменено отношением фототоков. Таким образом, при фотоэлектрическом определении оптической плотности растворов практически измеряют не ослабление потоков электромагнитного излучения, а значение фототоков, возникающих под действием потока электромагнитных излучений.

Колориметр фотоэлектрический КФК-2 является однолучевым прибором и предназначен для измерения в отдельных участках диапазона длин волн 315-980 нм, выделяемых светофильтрами, коэффициентов пропускания и оптической плотности растворов, а также определения концентрации веществ в растворах методом построения градуировочных графиков. Принцип действия и основные элементы фотоэлектрического колориметра показаны на рис. 1 и 2.

Рис. 1. Принципиальная схема фотоэлектрического однолучевого колориметра с прямым способом измерения: 1 – источник света; 2 – линза; 3 – светофильтр; 4,4’ – кюветы с растворами сравнения и фотометрируемым, соответственно; 5 – фотоэлемент; 6 – усилитель; 7 – регистрирующий прибор.

Порядок работы на КФК-2:

3. Установить в кюветное отделение кюветы: с раствором сравнения – в дальнее гнездо кюветодержателя, с исследуемым раствором – в ближнее гнездо. Следует помнить, что кюветы предварительно ополаскивают анализируемым раствором и заполняют их только до метки. С внешней стороны кюветы необходимо тщательно протереть фильтровальной бумагой грани, через которые будет проходить световой поток

Основной принцип работы фотоколориметра заключается в сравнении между собой двух световых потоков – так называемого фонового, который был пропущен через раствор сравнения, и основного, который проходил сквозь исследуемый раствор. Фоновый световой поток корректируется при этом каналом сравнения. Отношение основного светового потока к фоновому называют пропусканием Т (или же коэффициентом пропускания). Оптическая плотность А (или же поглощение) выражается десятичным логарифмом величины, обратной коэффициенту пропускания. Таким образом, концентрация растворенного в исследуемой среде вещества прямо пропорциональна оптической плотности А среды. Вышеназванные два световых потока и тот, что определяется при неосвещенном фотоприемнике, фотоприемник преобразует в соответствующие электрические сигналы. Микропроцессор прибора обрабатывает эти электрические сигналы и отображает их на цифровом дисплее фотоколориметра уже в виде оптической плотности А и коэффициента пропускания Т. Для определения пропускания Т и поглощения А микропроцессору приходится производить определенные вычисления по достаточно простым формулам. В этом и заключается принцип работы фотоколориметра.

Принципы градуировки при работе фотоколориметра

В случае, когда оптическая плотность исследуемого раствора прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества во всех областях исследуемых концентраций, принцип работы фотоколориметра позволяет использовать для градуировки прибора один стандартный раствор. Но в наиболее общих случаях зависимость между поглощением А и концентрацией исследуемого раствора может и не быть линейной. В таких случаях для градуировки устройства приходится использовать два или больше стандартных растворов. Соответственно, определение массовых концентраций веществ согласно выбранной методике выполнения измерений производится по градуировочным графикам зависимости измеренных значений коэффициентов пропускания (или же оптической плотности) от концентрации определяемых веществ, построенным по указанным в методике выполнения измерений контрольным растворам. Градуировочные графики строятся вручную или же с помощью поставляемого вместе с прибором программного обеспечения

Устройство фотоколориметра вытекает из принципа работы

Принцип работы фотоколориметра определяет, что чаще всего устройство относят к категории малогабаритных переносных приборов, оснащенных автономным питанием. В состав фотоколориметра входят, как правило, оптический блок, блок управления и последующей обработки информации, блок индикации, оснащенный подсветкой, клавиатура, кювета и кюветный отсек. Источниками излучения в оптическом блоке являются 8 полупроводниковых высокостабильных светодиодов, которые определяют рабочий диапазон по длине волн излучения. На канале сравнения и измерительном канале для приема излучения применяются цифровые фотодиоды. Основой блока управления и обработки информации является микропроцессор. Возможно включение режима самоконтроля с последующим выводом информации о степени готовности к работе на ЖКИ или дисплей. Для подключения к компьютерам в принцип работы фотоколориметра заложена возможность использования соответствующего интерфейса.

Фотоэлектроколориметрический метод более объективный по сравнению с визуальной колориметрией и может давать более точные результаты. Для определения применяются фотоэлектроколориметры (ФЭК) различных марок.

Принцип работы ФЭК следующий. Световой поток, проходя через окрашенную жидкость, частично поглощается. Остальная часть светового потока попадает на фотоэлемент, в котором возникает электрический ток, регистрирующийся при помощи амперметра. Чем больше концентрация раствора, тем больше его оптическая плотность и тем больше степень поглощения света, и, следовательно, тем меньше сила возникающего фототока.

К прибору прилагаются наборы кювет. Кюветы бывают различных размеров и подбираются в зависимости от интенсивности окрашенного раствора. Проходя через кюветы с раствором, лучи света попадают на фотоэлементы.

Между оптической плотностью и концентрацией вещества в растворе существует прямая пропорциональная зависимость.

Для того чтобы проводить на ФЭКе определение количества вещества, необходимо составить градуировочную кривую

Градуировочная кривая.

С — концентрация; D — оптическая плотность раствора.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 С

Градуировочная кривая показывает зависимость оптической плотности раствора D от количества вещества С Для построения градуировочной кривой готовят ряд окрашенных растворов с известным количеством вещества (для этого берутся разные количества стандартного раствора). Окрашенные стандартные растворы должны быть приготовлены в таких же условиях, в которых будет готовиться окрашенный раствор определяемого вещества при полном соблюдении методики работы. Измеряют оптические плотности всех растворов и строят градуировочную кривую, откладывая ,по оси абсцисс известные концентрации, а по оси ординат — соответствующие им значения оптической плотности.

По градуировочной кривой в дальнейшем определяют концентрацию вещества в исследуемом растворе. Для этого раствор наливают в ту же кювету, для которой построена градуировочная кривая и, включив тот же светофильтр, определяют оптическую плотность раствора. Затем по градуировочной кривой находят концентрацию определяемого вещества, соответствующую, данной оптической плотности. Градуировочную кривую следует время от времени проверять. Часто в работе пользуются градуировочными таблицами, которые составляются по данным градуировочной кривой.

Техника определения на ФЭК-56М. Кюветы, в которых проводят измерение поглощения, должны быть тщательно очищены: их моют концентрированной соляной кислотой, водопроводной водой, несколько раз споласкивают дистиллированной водой и насухо вытирают снаружи. Во всех случаях кювету предварительно споласкивают небольшим количеством раствора, оптическую плотность которого собираются измерять. Кювету, заполняют до такого уровня, чтобы поток излучения проходил только через слой раствора. Толщину слоя кюветы выбирают таким образом, чтобы измеряемые величины D укладывались в оптимальном интервале 0.1-1.0. Кюветы устанавливают в кюветное отделение прибора всегда в строго определенное положение, чтобы избежать ошибок, связанных с отражением и рассеянием излучения.

Подготовка прибора. Прибор включают за 25-30 мин до начала работы, так как первое время после включения показания не постоянны, система должна прогреться. При этом шторка должна быть закрыта.

Измерение на ФЭКе производят в следующем порядке:

1. В левый кюветодержатель ставят кювету с растворителем, а в правый — в одно гнездо кювету с испытуемым раствором, а в другое — кювету с растворителем.

2. В правый пучок света помещают кювету с испытуемым раствором.

3. Открывают шторку, при этом стрелка микроамперметра отклоняется от нуля; вращая левый отсчетный барабан от себя, подводят стрелку микроамперметра к нулю.

4. Закрывают шторку.

5. Рукояткой кюветодержателя перемещают кюветы в правом кюветодержателе, так чтобы в правом пучке света оказалась кювета с растворителем.

6. Открывают шторку, стрелка микроамперметра снова отклоняется от нулевого положения.

7. Вращая правый отсчетный барабан от себя, возвращают стрелку микроамперметра к нулю.

8. Закрывают шторку.

9. Снимают показания прибора по красной шкале правого отсчетного барабана.

10. Для исключения случайных ошибок повторяют измерение еще два раза. Для расчетов можно брать повторяющиеся результаты с незначительным расхождением.

11. Находят по градуировочной кривой или по таблице количество определяемого вещества.

Указания к пользованию прибором. Кончив измерение данного раствора, необходимо его тотчас вылить из кюветы, которую необходимо тщательно промыть дистиллированной водой и поставить в перевернутом виде на чистую фильтровальную бумагу. Проверяют, закрыта ли шторка и ставят отсчетные барабаны на нуль.

Если на ФЭКе в течение дня работа больше не будет производиться, то выливают растворитель из кюветы и споласкивают их дистиллированной водой. Все кюветы вытирают досуха и убирают. ФЭК отключают и закрывают чехлом. Рекомендуется при работе закрывать кюветы крышками, чтобы предотвратить проливание жидкости внутри прибора. Если работают с летучими жидкостями, закрывать кюветы надо обязательно.

Рефрактометрия

Рефрактометрия основана на измерении угла преломления светового луча при переходе его из одной среды в другую. Такой переход, предположим из воды в стекло, сопровождается изменением направления света Преломление светового луча измеряют с помощью показателя преломления, представляющего собой отношение синуса угла падения ? к синусу угла преломления β:

Показатель преломления зависит от природы и плотности вещества, его концентрации, температуры, давления среды и длины волны падающего света. При прочих постоянных условиях показатель преломления пропорционален только концентрации вещества.

Аппаратура. Показатели преломления определяют на специальных приборах — рефрактометрах, работающих на принципе измерения предельного угла преломления Если угол падения луча равен 90°, то луч света, преломляясь в другую фазу, образует предельный угол преломления.

При этом существует зависимость:

Если для одной среды известен показатель преломления (n₂), то показатель второй среды легко определить, измерив предельный угол преломления β Предельный угол определяют по границе света и тени, наблюдаемой в рефрактометре. В качестве одной среды используют стекло (стеклянные призмы) с известным значением n₂, второй средой служит раствор, показатель преломления которого необходимо измерить.

Перед производством измерений показания рефрактометра проверяют по дистиллированной воде (nD 20 = 1,3330). Все измерения проводят при постоянной температуре, так как n t _D зависит от нее. Показатель преломления n t _D обозначают с индексами t и D. Индекс t обозначает температуру, при которой производят измерения. Индекс D обозначает желтую линию D в спектре натрия, так как в лабораторных рефрактометрах источником света обычно служит натриевая лампа, испускающая желтый свет.

В простейшем рефрактометре (типа РЛ или РЛ-2) раствор вещества помещают между двумя призмами и, вращая увеличенную трубку, наводят границу света и тени на центр визирного креста. Затем по круговой шкале отсчитывают значение показателя преломления При работе на рефрактометрах сначала замеряют показатель преломления растворителя, затем — раствора.

Рефрактометрическое измерение. Определение концентрации вещества в растворе ведут с помощью калибровочного графика, по таблицам показателей преломления и по рефрактометрическому фактору. Калибровочный график строят по показателям преломления стандартных растворов известной концентрации. На осях координат откладывают значения концентрации, разницу показателей преломления стандартных растворов и растворителя и соединяют полученные точки линией. Измерив, показатель преломления анализируемого раствора, на графике определяют его концентрацию. Для многих веществ разработаны таблицы, в которых приведены показатели преломления растворов с известной концентрацией, например:

2%	4%	6%
CaCl₂	1,33788	1,34251	1,34703
KCl	1,33589	1,33848	1,34106
NaCl	1,33667	1,34002	1,34332

Показатели преломления nD 17 основных растворителей, применяемых в анализе, имеют следующие значения: вода — 1,3333; этанол — 1,3613; ацетон — 1,3591; хлороформ — 1,4456.

Кроме графиков и таблиц для расчета концентраций можно использовать рефрактометрический фактор F, показывающий увеличение показателя преломления раствора при возрастании его концентрации на 1%. Рефрактометрический фактор F (и концентрацию веществ С) определяют по формуле:

где n_p, n_{0 –} показатели преломления раствора и растворителя. Например,. для NaCl фактор F (используем nD 17 4% раствора) равен:

F = (1,34002 – 1,33324)/4 = 0,001695

По фактору, зная показатель преломления раствора и растворителя рассчитывают концентрацию раствора. Все измерения на рефрактометрах проводят при постоянной температуре, для чего в рефрактометрах предусмотрено термостатирование призменного блока. При изменении температуры n t _D изменяется, например, для воды: n_D 10 = 1,33369; n_D 15 = 1,33339; n_D 20 = 1,33299.