Роль электронной и люминесцентной микроскопии в микробиологии доклад
Обновлено: 08.07.2024
Люминесцентная микроскопия — это фиксация при помощи микроскопа первичного либо вторичного люминесцентного свечения объектов.
Принцип люминесцентной микроскопии
Довольно большое количество веществ биологического происхождения имеют такую способность, как свечение, при воздействии на них света.
Такое свечение формируется по причине того, что объекты поглощают лучистую энергию, которая попадает на их поверхности. Длина волны при люминесценции больше, чем у поглощенного света.
Чем люминесцентный микроскоп отличается от обычного светового микроскопа?
Строение светового микроскопа отличается от люминесцентного. Дело в том, что люминесцентный микроскоп оснащен специальной осветительной системой, которая излучает свет, вызывающий соответствующее свечение объектов.
Провоцировать подобное свечение объектов рекомендуется либо ультрафиолетом, либо сине-фиолетовыми лучами. Таким образом можно получить цветное изображение.
Используются разновидности ламп, как, например, ртутно-кварцевая или галогенная кварцевая лампа. Ими оснащается все флуоресцентный микроскоп, они излучают свет в синем спектре.
Также используются специальные светофильтры, которые пропускают только ту часть света, которая способна возбудить люминесцентное свечение объекта. Также используются теплофильтры, которые противостоят перегреву остальных фильтров, оптической конструкции и самого исследуемого объекта.
Есть и объекты, которые не обладают люминесцентным свечением. Однако, это не проблема. Ведь есть возможность обработки их флюорохромами, специальными веществами, которые могут поглощать свет и являются люминесцентными.
Именно по этому принципу люминесценцию разделяют на первичную и вторичную, соответственно, первичной называется та люминесценция, которой объекты обладают без какого-либо внедрения, а вторичной – при окрашивании их флюорохромами.
Применение люминесцентной микроскопии позволяет увеличить контрастность объекта, в микробиологии именно такая методика позволяет отчетливо рассмотреть органеллы и другие клеточные структуры.
Довольно большое значение имеет реакция иммунофлюоресценции в вирусологии, так как при помощи данной технологии меченные флюорохромом антитела идентифицируют антигены чужеродных организмов. Такая технология может значительно помочь в экспресс- идентификации вирусных заболеваний.
Люминесцентная микроскопия имеет широкое распространения в современной науке и технике.
Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использование для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов - микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия.
Светлопольная микроскопия
Светлопольная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, основной частью которого является объектив. На оправе объективов обозначается увеличение: 8, 10, 20, 40, 90.
При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей (рис. 1.12).
Рис. 1.12. Ход лучей в иммерсионном объективе
Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, состоящий из двух линз. В отечественных микроскопах применяются окуляры с увеличением 7, 10, 15 (рис. 1.13). Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В микробиологии обычно используются увеличения в 900-1000 раз. Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности.
Рис. 1.13. Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом поле, отрегулированного для освещения по Келеру
Под этим надо понимать наименьшее расстояние между двумя точками препарата, при котором они еще четко различимы под микроскопом. Разрешающая способность обычных световых микроскопов с иммерсионной системой равна 0,2 мкм.
Темнопольная микроскопия
Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем принципе (рис. 1.14). Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя: поле зрения остается темным, а объект на его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального конденсора (параболоид) или обычного конденсора, прикрытого в центре кружком черной бумаги.
Рис. 1.14. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле.
На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.
Фазово-контрастная микроскопия
При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазово-контрастного конденсора и фазового объектива (рис. 1.15).
Рис. 1.15. Схема фазово-контрастного микроскопа.
Фазово-контрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.
Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.
Люминесцентная микроскопия
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения.
Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 1.16). Очень важно использование нефлуоресцентного иммерсионного масла.
Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.
Рис. 1.16. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1 - дуговая лампа; 2 - кварцевый коллектор; 3 - кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4 - передняя часть коллектора; 5 - ультрафиолетовый фильтр; 6 - призма; 7 - пластинка из уранового стекла; 8 - окулярный фильтр, поглощающий
ультрафиолетовые лучи.
Электронная микроскопия
Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (рис. 1.17).
Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа.
В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность.
С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.
Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения и красителей светиться под действием падающего на них света.
Свечение объектов возникает в результате поглощения ими лучистой энергии. Свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами, либо сине-фиолетвыми. Возникает люминесценция в цветовой гамме всего или большей части видимого спектра, что дает цветное изображение. Объект, не дающий явления люминесценции, окрашивают специальными красителями - флюорохромами. Люминесценция, свойственная самим микроорганизмам, называется первичной, а после обработки флюорохромами - наведенной или вторичной.
Borrelia burgdorferi. Люминесцентная микроскопия.
В осветителе люминесцентного микроскопа используется мощный источник света (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогенная кварцевая лампа), излучающий преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра. Используется система светофильтров: возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию; теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику люминесцентного микроскопа.
В медицинской микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флюорохромирование (окрашивание флюорохромами) и флюоресцирующих антител (реакция иммунофлюоресценции - РИФ).
Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изображения, дает возможность различить отдельные клеточные структуры. Люминесцентная микроскопия применяется для бактериоскопии инфекционных возбудителей, для цитохимического исследования живых и фиксированных микроорганизмов. В РИФ с помощью антител, меченных флюорохромами, выявляются антигены микроорганизмов или антитела в сыворотке больных. РИФ используется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.
В микробиологии с помощью микроскопа изучают живые и убитые клетки микроорганизмов как в окрашенном, так и в неокрашенном виде.
Световой микроскоп (МБИ - 1, 2, 3, 6, 11). Все объекты рассматриваются в проходящем свете сухим и иммерсионным объективом. Разрешающая способность - 0,4-0,2 мкм. Увеличение при данной длине тубуса равно произведению увеличений объектива и окуляра. Минимальное - 630 (для иммерсионного объектива) и максимальное - 1350. Применяется для изучения морфологии, структуры, подвижности и тинкториальных свойств микроорганизмов.
Люминесцентный микроскоп. Использование ультрафиолетовых лучей и люминесцирующих красителей, способных светиться (флюоресцировать) под УФ-лучами. Позволяет наблюдать микроорганизмы в излучаемом ими свете и цвете. Разрешающая способность - 0,1 мкм. Повышение ее связано с работой коротковолновыми ультрафиолетовыми лучами. Максимальное увеличение - в 3000 раз. Преимущество - цветное изображение, высокая контрастность, возможность исследовать живые объекты. Применяется не только для изучения морфологии, и тинкториальных свойств, но и для исследования процессов жизнедеятельности микробной клетки.
Инвертированные микроскопы (темнопольный, фазово-контрастный). Исследования проводят в проходящем свете в светлом или темном поле с применением метода фазового контраста. МБИ - 12,13 снабжены собственными столиками-термостатами, кинокамерами. Линзы окуляра и объектива дают обратное увеличенное изображение. Позволяет проводить широкий круг микроскопических исследований: визуальное наблюдение, фотографирование, применение светлого и темного полей в прямом и отраженном свете, прямое и косое освещение, микроскопирование в поляризованном свете, методом фазовых контрастов, в свете люминесценции. Методы наблюдения в темном поле, фазово-контрастный используются с целью исследования живых клеток микроорганизмов.
Электронный микроскоп. Принцип действия и устройства подобен таковым у обычного светового микроскопа. Различия - вместо источника света - источник электроволн (вольфрамовая проволока, нагреваемая электротоком, вместо оптических линз - электромагнитные). Разрешающая - способность 0,001 мкм. Первое промежуточное увеличение в 130 раз, от проекционной линзы - в 20-200 раз, в целом - 2500-25000, максимум - в 100000 раз. Широко используется для изучения вирусов, мельчайших микроорганизмов. В бактериологии применяется для изучения деталей тонкого строения.
Стереомикроскоп. Дает подсвет в прямом и косопроходящем свете. Наиболее пригоден для крупных объектов (грибов). Изучение колоний, микологических культур.
1. Дополнительные устройства к микроскопу.
Бинокулярная насадка АУ-12. Приближает микроскопию к условиям естественного зрения. Повышение трудоспособности работающего с микроскопом. Разрешающая способность несколько увеличена. Применима к любому микроскопу.
Микрометр: объект, окуляр. Объект-микрометр и окуляр-микрометр позволяют определить размеры бактерий с помощью расчетных сеток. Разрешающая способность несколько повышается, дает возможность изучать микроорганизмы в нативном состоянии. Для определения размеров.
Темнопольный конденсор к световому микроскопу. Затемнение центральной части конденсора и, как следствие, боковое освещение объекта позволяет на темном фоне препарата видеть микроорганизмы в отраженном от них свете. Разрешающая способность повышается. То же, что и при темнопольной микроскопии.
Фазово-контрастное устройство (объектив). При обычной микроскопии в проходящем свете повышает контрастность и отражение за счет превращения фазовых смещений световой волны в амплитудные, улавливаемые глазом. В отличие от темнопольного устройства - дает возможность наблюдать контрастные живые неокрашенные объекты на световом фоне. Используется для наблюдения за живыми биообъектами.
Столик-термостат. Сохраняет подвижность и жизнеспособность объекта. Применяется для изучения простейших.
2. Микроскопия препарата с иммерсионным объективом.
При использовании иммерсионных объективов между фронтальной линзой объектива и объектом исследования должна находиться жидкость.
Иммерсионный объектив дает увеличение х90 при условии отсутствия рассеивания потока лучей в связи с неоднородностью среды при их прохождении. Поэтому, во избежание такого дефекта используется иммерсионное кедровое масло или его заменитель - вазелиновое масло. Процесс микроскопии с иммерсионным объективом х90 ведут с окулярами х7, х10, но чаще с первым из них.
Место для микроскопа выбирается подальше от прямого солнечного света. Работа на столе с темной поверхностью способствует меньшему утомлению глаз. Рекомендуется смотреть в окуляр левым глазом, не закрывая правого. Удобнее работать с бинокулярным микроскопом.
Переносить микроскоп необходимо двумя руками: одной держать штатив, другой - основание микроскопа. Следует предохранять микроскоп от толчков, соприкосновения с сильнодействующими веществами типа кислот, щелочей.
Техника микроскопии состоит из нескольких этапов:
1. На готовый окрашенный мазок наносят каплю масла.
2. Под контролем глаза сбоку осторожно опускают тубус, погружая объектив в каплю масла. При неосторожном выполнении можно раздавить либо линзу объектива, либо предметное стекло.
3. После соприкосновения объектива с маслом дальнейшее опускание тубуса происходит с помощью микровинта микроскопа до появления микрообъектов в окуляре.
4. Просмотр препарата ведут только за счет манипуляций с микровинтом и движения стекла.
5. После окончания микроскопии тубус поднимают, объектив выходит из капли масла.
6. Масло с объектива удаляют чистой марлей и протирают жирорастворителем - либо ксилолом, либо спиртом, либо хлороформом. Оставлять масло на линзе объектива нельзя.
7. Револьверную часть на тубусе устанавливают на объектив х8, конденсор и тубус опускают, переводя в нерабочее состояние, и закрывают микроскоп колпаком.
3. Люминесцентная микроскопия.
Сущность метода. Некоторые биологические объекты способны при освещении коротковолновыми лучами (синими, фиолетовыми, ультрафиолетовыми) поглощать их и испускать лучи более длинной волной (светиться желто-зеленым или оранжевым светом). Это так называемая собственная или первичная люминесценция.
Нелюминесцирующие объекты можно обработать специальными флуорохромами и также наблюдать люминесценцию, но это уже будет наведенная вторичная люминесценция. Она используется в микроскопии чаще.
К флуорохромам относятся акридин желтый, акридин оранжевый, аурамин, примулин, тиофлавин, конго красный, тетрациклин, хинин и другие вещества (табл. 1).
Таблица 1. Флюорохромы для люминесцентной микроскопии, используемые в микробиологических исследованиях
Читайте также: