В чем суть иммуногистохимического метода кратко

Обновлено: 02.07.2024

Основателем иммуногистохимии является Albert H. Coons и его коллеги, которые впервые в 1941 году произвели метку антител флюоресцентым красителем, для определения антигена (пневмококка) в инфицированных тканях. Позже, в 1966 Nakane и Pierce, разработали пероксидазный метод иммуногистохимической окраски, при котором антитела конъюгируются (метятся) ферментом пероксидаза. Впервые применение иммуногистохимии на тканях, залитых в парафин, было осуществлено в 1974 году Taylor и коллегами.

В зависимости от способа определения антигена, различают прямой и непрямой метод иммуногистохимии.

Прямой метод - подразумевает прямую реакцию меченых антител с антигенами ткани. Данная техника является быстрой, простой и осуществляется в один этап, но обладает низкой чувствительностью из-за небольшой амплификации сигнала, поэтому наиболее широкое применение получил непрямой метод.

Непрямой метод подразумевает связывание первичных немеченых антител с желаемым антигеном, с последующим реагированием вторичных меченых антител с первичными антителами. Непрямой метод более чувствительный, чем прямой метод, из-за достижения амплификации сигнала. Модификациями непрямого метода являются метод PAP, ABC и SLAB.

Визуализация взаимодействия антигена с антителом может быть осуществлена множественными путями. В большинстве случаев антитела связаны с ферментом пероксидаза, данный фермент может катализировать реакцию с формированием цвета. Антитела также могут быть связаны с флуоресцентной меткой (флюорохромом), что даёт свечение при визуализации.

В зависимости от способности реагировать с одним или множеством эпитопов антигена, антитела разделяются на моноклональные и поликлональные. Кроме того, антитела классифицируются на первичные и вторичные. Первичные антитела синтезируются против желаемого антигена и в основном не связаны (не конъюгированы) с флюорохромами или ферментными метками, в то время как вторичные антитела синтезируются против иммуноглобулинов первичных антител и в большинстве случаев конъюгированы.

При существовании различных методик иммуногистохимии, вся процедура может быть разделена на 2 этапа: подготовка образцов и окрашивание. Подготовка включает в себя взятие материала, фиксацию, заключение тканей, приготовление слайдов, восстановление эпитопа, блокирование эндогенной пероксидазы, блокирование связывания с неспецифическими эпитопами. Окрашивание включает иммунодетекцию, контрастирующую окраску и заключение слайдов. Дальнейшая визуализация осуществляется с помощью обычного светового микроскопа или флюоресцентного микроскопа в зависимости от используемых антител.

(c) Федеральное бюджетное учреждение науки Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2006-2022 г.

Если Вы не нашли необходимую информацию, попробуйте зайти на старую версию сайта

Адрес: 680610, г. Хабаровск, ул. Шевченко, д. 2

Продолжая работу с сайтом, Вы подтверждаете свое согласие на использование файлов cookie вашего браузера с целью улучшения предложения и сервиса на основе ваших предпочтений и интересов.

Иммуногистохимия, или иммуногистохимический анализ — исследование, во время которого в образцах ткани с помощью антител выявляют определенные молекулы. Этот метод диагностики нашел широкое применение в онкологии.

Немного теории и истории. Для того чтобы обнаруживать и уничтожать чужеродные вещества, иммунная система использует особые молекулы — антитела. Они отличаются специфичностью: каждое антитело может связываться строго с определенным антигеном.

В 1994 г. С. Тэйлор применил иммуногистохимический анализ, чтобы проверить 20 000 опухолей, и обнаружил, что диагнозы в половине случаев были ошибочными. Иммуногистохимия зарекомендовала себя как эффективный метод диагностики.

Какие задачи в онкологии помогает решать иммуногистохимия?

Иммуногистохимический анализ помогает врачам-онкологам:

Отнести злокачественную опухоль к тому или иному типу.
Выяснить, в каких генах опухолевых клеток произошли мутации, какие белки способствуют прогрессированию рака.
Выявить первичную опухоль и ее метастазы.
Определить, произошла ли злокачественная трансформация клеток.
Определить прогноз для пациента.
Разобраться, поможет ли в данном случае таргетная терапия.
Определить, чувствительны ли опухолевые клетки к химиотерапии, лучевой терапии.

Как это работает?

Иммуногистохимия бывает прямой и непрямой. В первом случае используют один вид антител, которые должны вступить в связь с определенной молекулой-мишенью. Если молекула-мишень присутствует в ткани, и реакция произошла, опухолевая ткань окрашивается:

Чаще всего к антителу присоединяют фермент, например, пероксидазу. Этот фермент катализирует химическую реакцию, которая приводит к изменению цвета.
Иногда к антителу присоединяют флюоресцин или родамин, при этом окрашивание выявляют с помощью флюоресцентной микроскопии.
всего применяют непрямую иммуногистохимию. При этом используют два антитела. Одно соединяется с антигеном, второе — с полученным комплексом антиген-антитело. Маркер, который вызовет изменение цвета, связывают со вторым антителом.

Непрямой метод имеет некоторые преимущества:

Как проводят исследование?

Для того чтобы выполнить иммуногистохимический анализ, нужно получить опухолевую ткань, то есть провести биопсию. В качестве материала можно использовать столбик ткани, полученный во время трепан-биопсии, фрагмент тканей или даже целый орган, удаленный во время операции.

Образец ткани фиксируют с помощью формальдегида (иногда используют метанол, ацетон и другие фиксаторы — это зависит от того, какой антиген нужно выявить, и реагирует ли он с теми или иными фиксаторами) и погружают в парафин. Парафинизация помогает законсервировать ткань, сохранить ее структуру на длительное время.

Затем ткань, помещенную в парафин, нарезают с помощью специального инструмента — микротома — на слои толщиной 3–5 мкм. Эти тонкие срезы помещают на стекло, покрытое, специальным клеем.

Некоторые образцы слишком чувствительны к реагентам, которые применяют во время вышеописанной процедуры. Их нельзя помещать в парафин. Такие ткани замораживают жидким азотом. Этим альтернативным методом пользуются редко, только в случае необходимости, так как у заморозки есть некоторые недостатки: она делает изображение под микроскопом не таким четким, требует специальных условий хранения образцов. Фиксацию ткани в таких случаях проводят уже после нанесения на стекло и размораживания, ацетоном или формальдегидом.

После того как срезы нанесены на стекло, из них нужно удалить весь парафин, иначе антитела не прореагируют с антигеном. Эта процедура называется депарафинизацией. Ее проводят с помощью ксилола. Затем выполняют еще некоторые подготовительные процедуры, чтобы антитела могли успешно прореагировать с нужными антигенами, и, наконец, проводят непосредственно иммуногистохимический анализ. Обработанную антителами ткань рассматривают под микроскопом, чтобы проверить, окрасилась ли она.

Какие молекулы-мишени выявляют во время иммуногистохимии?

Количество возможных мишеней измеряется сотнями. Перед исследованием врач должен понимать, что он ищет, и использовать соответствующие антитела. В онкологии мишенями являются опухолевые маркеры — вещества, которые в здоровых клетках отсутствуют вообще или присутствуют в значительно меньшем количестве. Вот некоторые примеры:

Рецепторы к эстрогенам и прогестерону помогают идентифицировать гормонально-позитивный рак молочной железы и разобраться, помогут ли женщине гормональные препараты.
Простатспецифический антиген (ПСА) имеет значение в диагностике рака простаты.
Альфа-фетопротеин — присутствует в гепатоцеллюлярной карциноме (рак печени).
Цитокератины помогают в диагностике рака и некоторых сарком (злокачественных опухолей соединительной ткани).
Фермент CD10 (CALLA) связан с карциномой почек, лимфобластным лейкозом.

Какова роль иммуногистохимии в современной онкологии?

Иммуногистохимический анализ помогает изучить характеристики злокачественной опухоли, которые не могут выявить другие методы диагностики. Зачастую это играет важную роль в уточнении диагноза и назначении правильного лечения. Врач может определить, какие комбинации препаратов будут наиболее эффективны для конкретного больного, иными словами, реализуется принцип персонализированного лечения. Зачастую это помогает улучшить результаты, подобрать эффективное лечение для пациентов, которым не помогает стандартная терапия.

Иммуногистохимия — способ исследования биологического материала после окрашивания с помощью специфических антител, которые связываются с определяемым веществом. Этот метод был разработан еще в первой половине ХХ века и к настоящему времени получил колоссальное развитие.

Выделяют два способа проведения реакции:

Прямая иммуногистохимия — маркированные антитела специфически связываются с определяемым веществом.
Непрямая иммуногистохимия. Она проводится в два этапа. Сначала немаркированные антитела связываются с определяемым в ткани веществом, а потом этот комплекс детектируется с помощью вторичных меченных антител. Таким образом, первичный комплекс выступает для вторичных антител как антиген. Этот метод является более чувствительным и специфичным. Соответственно, он обладает большей информативностью.

Антитела, используемые в иммуногистохимии, могут быть маркированы следующим способом:

флуоресцентными красителями. Для их обнаружения необходимы специальные микроскопы;
ферменты. Например, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза. Детекцию такого результата проводят с помощью обычного оптического микроскопа;
электронно-плотные частицы — золото, ферритин. Для таких реакций требуются электронные микроскопы.

Применение технологии в репродуктивной медицине

Иммуногистохимия в репродуктивной медицине применяется для диагностики причин бесплодия и оценки потенциальной эффективности ЭКО. Известно, что беременность при применении вспомогательных репродуктивных технологий наступает у 35–45 % пациенток после первой попытки. Около 30 % пациенток имеют многократные неудачи, причины которых различны, в том числе неблагоприятное состояние эндометрия.

Долгое время для изучения патологии эндометрия использовался гистологический метод исследования. Однако он не позволял достоверно оценить рецептивную способность эндометрия, что породило потребность в поиске более информативных методов диагностики. Одним из них стала иммуногистохимия, которую в настоящее время используют в следующих целях:

Исследование структурных особенностей эндометрия.
Определение способности эндометрия к имплантации.
Определение негативных факторов наступления беременности, например, гиперэкспрессии альфа-эстрогеновых рецепторов в железистых и стромальных клетках в среднелютеиновую фазу, снижение прогестерон+ стромальных клеток.
Определение благоприятных факторов наступления беременности — оптимальное соотношение прогестероновых и эстрогеновых рецепторов, количество эндометриальных эпителиоцитов с пиноподиями более 50 %.
Оценка восприимчивости эндометрия к гормонам. На основании полученной информации корректируют дозу гормональных препаратов, используемых на этапах планирования и проведения ЭКО.
Определение иммунокомпетентных клеток-киллеров, препятствующих наступлению беременности.

Акушер -гинеколог, репродуктолог. Гинеколог-эндокринолог. Врач высшей категории. Кандидат медицинских наук.

Иммуногистохимия представляет собой гораздо более информативный метод диагностики, чем классическая гистология. Методика позволяет с точностью определить состояние эндометрия и выявить причины бесплодия или множественных неудач ЭКО. Кроме того, она может использоваться в прогнозировании результатов экстракорпорального оплодотворения. Несмотря на относительную техническую сложность реализации, иммуногистохимические исследования получают все большее распространение в сфере репродуктивной медицины.

Как проводится иммуногистохимия

Для проведения исследования требуется фрагмент эндометрия, который получают во время проведения биопсии (раздельного диагностического выскабливания или пайпель-биопсии). Этот материал помещается в забуференный формалин и направляется в лабораторию, где проходит несколько этапов обработки:

Фиксация и проводка. Эти процедуры необходимы, чтобы сохранить структуру ткани максимально неповрежденной.
Изготовление парафиновых блоков. Подготовленный материал заливают парафином. С этого момента блок может храниться неограниченное количество времени, не теряя своих свойств. При необходимости, в любой момент из него могут быть приготовлены гистологические препараты.
Изготовление гистологических препаратов. Ткань нарезают с помощью микротома на тонкие пластинки, толщиной несколько микрометров (это в десятки раз меньше, чем толщина волоса), фиксируют на стекле и окрашивают красителями для гистологического и иммуногистохимического исследования.
На финальной стадии препараты оценивает врач-патоморфолог.

В заключении выдаются результаты как гистологического, так и иммуногистохимического исследования. На этом основании лечащий врач выбирает оптимальный метод лечения.

Как забеременеть в 35?

По рекомендациям ВОЗ оптимальным возрастом для беременности является промежуток от 20 до 30 лет, однако по разным причинам женщины могут планировать ее позже.

Лечение бесплодия у женщин

В наше время бесплодие является не только медицинской, но и социальной проблемой.

Повышенный уровень тестостерона у женщин

Тестостерон — один из главных мужских гормонов, однако в определенном количестве он вырабатывается яичниками и надпочечниками у женщин.

Иммуногистохимия (ИГХ) – это метод локализации специфических антигенов в тканях, основанный на распознавании антигена соответствующим антителом и выявления результатов этого связывания на светооптическом уровне.

История ИГХ началась в 1940-х годах, когда Coons с соавторами разработали технику иммунофлуоресценции для выявления антигенов в замороженных срезах. Позже были разработаны и внедрены антитела, меченые не флуоресцентными красителями, а ферментами. Нанесение ферментной метки (пероксидаза хрена) на антитело, открытое Avrameas и Nakane с последующим воздействием визуализирующей системы, позволило увидеть окрашенный продукт реакции отмеченного антитела в световой микроскоп. Таким образом стало возможным идентифицировать клетки различных типов по их уникальным признакам (маркерам). Кроме того, метод позволил выявлять гормоны и рецепторы к ним, а также изучать синтетические и секреторные процессы.

Метод получил широкое распространение в диагностической патологии только в 1990-х. Taylor и Burns первыми успешно продемонстрировали метод на фиксированной в формалине заключенной в парафин ткани (т.е. на гистологических препаратах, приготовленных стандартным способом).

Существуют различные способы проведения реакции. Так, наиболее часто используют прямой метод, при котором маркированные антитела антитела связываются непосредственно с выявляемым веществом. Более чувствительным является непрямой метод, основанный на том, что немаркированные первичные антитела связываются с искомым антигеном, а затем обнаруживаются при помощи вторичных меченых антител.

Для повышения чувствительности метода начали использовать многоступенчатую визуализацию (пероксидазно-антипероксидазный, авидин-биотиновый, биотин-стрептавидиновый метод) и в итоге были разработаны высокочувствительные “полимерные” методы амплификации.

С момента внедрения метода в диагностическую практику, его применение значительно расширилось, иммуногистохимическое исследование перестало быть предметом только научных исследований. ИГХ стало существенным компонентом процесса постановки диагноза и классификации опухоли. Кроме того, с помощью ИГХ стало возможным прогнозировать дальнейшее биологическое поведение заболевания, определять возможности таргетной терапии, резистентность и чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии.

Иммуногистохимическое исследование является очень важной частью верификации диагноза. Особенно актуальным имуногистохимическое исследование является для диагностики лимфом (в подавляющем большинстве случаев диагноз без ИГХ поставить невозможно), рака молочной железы, простаты, опухолей мягких тканей, для определения гистологической принадлежности недифференцированных опухолей и метастазов из невыясненного первичного очага.

ИГХ исследование выполняется после гистологического исследования окрашенных гематоксилином и эозином препаратов. После оценки изменений патолог интерпретирует полученную информацию и только на этом этапе назначает панель антител, применимую специально для опухолей данного гистологического типа. Обычно для постановки диагноза используется несколько антител, так как важными являются не только положительные, но и отрицательные окраски. Иногда проводится один или несколько дополнительных этапов исследования. В результате гистологическое строение опухоли сопоставляется с совокупностью полученных результатов и на основании этого выставляется окончательный диагноз.

Длительность проведения ИГХ исследования зависит от метода (вручную либо с помощью специальных аппаратов для автоматической окраски) и составляет от суток до нескольких дней, а иногда и недель. Кроме того, необходимо учитывать время, затрачиваемое патологом на интерпретацию полученных данных.

Еще одним очень важным нюансом является стандартизация и воспроизводимость результатов ИГХ исследований. Так как ИГХ – это сложный и многоступенчатый процесс, то существует огромное количество факторов, влияющих на результат. Техническая ошибка, низкое качество реагентов, нарушение фиксации проводки и/или фиксации биологического материала, неправильно выбранная панель антител, неверная интерпретация материала - всё это может привести к неверным или неполным результатам исследования. Именно поэтому желательно проведение важных исследований в хорошо оснащённых (автоматизация снижает влияние “человеческого фактора”) лабораториях с опытным персоналом.

Читайте также: