Первая трансгенная мышь сообщение

Обновлено: 28.06.2024

Корректирующие вмешательства в генетический материал лабораторных животных осуществляются на ранних стадиях эмбрионального развития, причем вмешательство это может быть различного рода: например, в какой-либо участок генома может быть произведено встраивание нового гена (развивающаяся из эмбриона мышь обозначается как трансгенная); если некий интересующий нас ген мыши будет определенным образом модифицирован у эмбриона, то мышь будет обозначаться как „knock-in“ или „knock-out“ (в зависимости от того, усиливается или подавляется экспрессия данного гена, соответственно). Некоторые более сложные линии трансгенных мышей, характеризующиеся клеточноспецифической регулируемой генной экспрессией и претерпевшие сразу несколько генетических модификаций, выводятся при спаривании мышей отдельных линий (compound transgenic).

Чтобы поместить в геном клеток мыши новый ген, можно прибегнуть к ретровирусным векторным системам или микроинъекции интегрируемого гена в оплодотворенные ооциты (в пронуклеус, эмбриональные стволовые клетки). Внесенная ДНК, достигая ядра клетки, встраивается в геном в случайном месте. После инъецирования ДНК эмбрионы вынашиваются самками, а после появления на свет последующих поколений внедренные мутации отслеживаются с помощью ПЦР и блот-гибридизации. Чтобы определить, находится ли внесенный трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь можно скрестить с другой мышью. Например, если эмбриональные стволовые клетки взять от мышей гомозигот по гену, ответственному за черный цвет шерсти и ввести в бластоцисту мыши-альбиноса, а родившихся химерных мышей скрестить впоследствии с мышами-альбиносами, можно легко выявить гетерозигот по цвету шерсти. Скрещивание таких мышей между собой поможет получить в последующих поколениях чистые линии трансгенных мышей.

Ретровирусные векторы

Эффективность доставки генов в составе ретровирусных векторов заключается в известной способности ретровирусов встраивать свой геном в геном инфицированных клеток. Вносимый с помощью вирусного вектора участок ДНК защищен с двух сторон длинными терминальными повторами (long terminal repeats, LTR), которые, кроме прочего, кодируют информацию об упаковке и экспрессии вирусной РНК. В клетках вспомогательных линий вирусная РНК запаковывается в вирусную оболочку, и после центрифугирования вирус легко выделить и очистить из супернатанта. После получения вируса мышиные эмбрионы инфицируют в течение 2-4 дней. РНК вируса переписывается обратными транскриптазами для построения на ее основе ДНК, которая, как правило, по прошествии первого или второго деления зиготы интегрируется в геном. Таким образом, инфицированные вирусом эмбрионы состоят из нескольких клеточных популяций – клеток, в геном которых интегрирован трансген, и клеток, в которых интеграции чужеродного участка ДНК не произошло. Ориентировочно через 6 недель после рождения потомства первого поколения, эти мыши спариваются. И только после того, как зародышевые клетки этих мышей также получают трансген, он может быть переда потомству следующего поколения и так далее. Таким образом, всех этих потомков можно будет отнести к одной трансгенной линии мышей. Изначально ретровирусные векторы применялись для выявления исключительно функционально важных генов, которые, например, уничтожались или инактивировались при интеграции вирусного генома, после чего проводился анализ трансгенных животных, которые отбирались по возникшими аномалиям. Уничтоженный/инактивированный ген должен был быть впоследствии индентифицирован, чтобы установить, какова же генетическая предпосылка развившейся аномалии. Также необходимо было понимать, какой фенотип лежит в основе той или иной аномалии – представлен ли трансген в гомо- или же в гетерозиготном состоянии.

Микроинъекции

Помимо векторных транспортных систем, полученных на основе ретровирусов, доставка мини-генов может быть произведена в виде микроинъекции в оплодотворенные ооциты. Введенные мини-гены точно так же интегрируются в случайных местах генома клеток зиготы. Преимуществом инъекции в пронуклеус является то, что величина вносимого гена не ограничена, как в случае ретровирусных векторов, размером вирусной оболочки. Обычно мини-гены производятся при участии E.coli и представляют собой единицы, состоящие из промотора, синтетического интрона, кодирующего региона гена, представляющего интерес, и терминатора транскрипции.

Для осуществления инъекции ооциты извлекаются из организма самки-донора. Но прежде, за пару дней до спаривания донорные женские особи получают интраперитонеальные инъекции сыворотки беременных мышей, и в день спаривания индуцируется процесс суперовуляции за счет дополнительной стимуляции введением хорионического гонадотропина. За счет создаваемого гормонального фона количество ооцитов увеличивается с 5-8 до 40. На следующий день после спаривания оплодотворенные ооциты изолируют из организма самки-донора, проводя процедуру промывания яйцевода. В только-только оплодотворенных ооцитах после внедрения сперматозоидов их пронуклеус не сливается с ядром яйцеклеток, пока процесс их мейотического деления не завершится образованием женского пронуклеуса. Кстати, на этой стадии мужской пронуклеус легко можно различить, глядя в световой микроскоп. Соответственно, микроинъекция осуществляется сразу после выделения ооцитов от донорской мыши. Яйцеклетку фиксируют на капилляре и тоненькой инъекционной пипеткой микроманипулятора в мужской пронуклеус вводится 1-2 пл раствора ДНК, содержащей мини-ген. После этого презиготы выдерживают в культуре и только после начала деления зиготы производят ее имплантацию, подсаживая мыши-акцептору, которая предварительно была спарена со стерильным самцом, что необходимо для успешной нидации. И после всех приложенных усилий, надо сказать, только 0-15% новорожденных мышат будут трансгенными (в зависимости от умельцев, проводивших процедуру).

Что ж, несмотря на то, что получение трансгенных мышей путем микроинъекции ДНК сейчас довольно рутинная процедура, тем не менее, существуют определенные проблемы, которые ученые решают каждый свой рабочий день, постоянно совершенствуя свои навыки и применяемые методики. И хочется верить, что эти труды не напрасны. Ведь каждая таблетка, прописанная вам лечащим врачом, когда-то была проверена на каком-нибудь модельном трансгенном животном, чтобы сегодня вы чувствовали себя лучше, чтобы ваша болезнь не помешала вам сделать то, что вы задумали.

Ученые Института цитологии и генетики (ИЦиГ) СО РАН создали первых в России мышей, восприимчивых к коронавирусу. Животные помогут в испытаниях вакцин и лекарств против COVID-19. На них уже есть огромный спрос, как в России, так и за рубежом.

Работа над созданием трансгенных мышей в ИЦиГ началась еще весной. На тот момент в России не было грызунов, восприимчивых к коронавирусам. Их, вообще, было мало во всем мире. Наличием таких мышек могли похвастаться лишь в США, и, возможно, в Китае.

У исследователей в США в лабораториях были не живые мыши, а материал в виде яйцеклеток. Ими нужно было сначала оплодотворить мышку-родителя, дождаться появления мышат, и ждать 45 дней – время, после которого животных передают в другие лаборатории. Российские ученые решили создавать собственных мышей. Но уже на этапе подготовки столкнулись с проблемами.

Пипетки и вибрация

Для создания трансгенных мышей необходимо было специальное оборудование и расходные материалы. Сначала катастрофически не хватало ни того, ни другого.

Вопрос с доставкой специального оборудования из-за рубежа и расходных материалов решили. Но в планы ученых вмешался неожиданный фактор — вибрация в здании вивария, где содержаться мышки.

Здание расположено возле оживленной трассы, и в лабораториях есть колебания. Для человека они не ощутимы, но на итог эксперимента могут повлиять весьма негативно.

Ювелирная работа генетика

С самками немного сложнее. В естественной среде у них выделяется немного яйцеклеток и ученым приходится проводить гормональную стимуляцию, чтобы организм выбрасывал их больше. Их также помещают в специальную питательную среду и ждут созревания.

Затем специалист с помощью пипетки с дозатором соединяет сперматозоиды и яйцеклетки, дожидается оплодотворения и промывает их от ненужного мусора. Делается это с помощью ротовой пипетки и капилляра под микроскопом.

Мыши-прародители

После того как создан генномодифицированный эмбрион, его пересаживают самке. Она должна выносить и родить мышат. И именно эти мышки будут носителями необходимого гена.

Возраст уникальных мышат, выведенным в ИЦиГ, три-четыре недели. Скоро они начнут размножаться. И в сентябре генетики планируют передать первую партию дефицитных грызунов в другие организации.

Проявляют заинтересованность к сибирским мышам и коллеги из Германии. Они уже заявили, что готовы встать в очередь, чтобы получить дефицитных и очень нужных науке грызунов.

Генетически модифицированная мышь, у которой был отключен ген, влияющий на рост волос (слева), рядом с нормальной лабораторной мышью.

А генетически модифицированная мышь или же генно-инженерная модель мыши (GEMM) [1] это мышь (Mus musculus), который имел геном изменено за счет использования генная инженерия техники. Генетически модифицированные мыши обычно используются для исследований или в качестве животных моделей болезней человека, а также для исследования генов. Вместе с ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (PDX), GEMM являются наиболее распространенными in vivo модели в исследования рака. Оба подхода считаются взаимодополняющими и могут использоваться для повторения различных аспектов болезни. [2] GEMM также представляют большой интерес для разработка лекарств, поскольку они облегчают проверку целей и изучение реакции, устойчивости, токсичности и фармакодинамика. [3]

Содержание

История

В 1974 г. Беатрис Минц и Рудольф Яениш создал первое генетически модифицированное животное, внедрив ДНК-вирус в мышь на ранней стадии эмбрион и показывая, что вставленные гены присутствовали в каждой клетке. [4] Однако мыши не прошли трансген к их потомству, поэтому влияние и применимость этого эксперимента были ограничены. В 1981 г. лаборатории Фрэнк Раддл [5] из Йельский университет, Фрэнк Костантини и Элизабет Лейси из Оксфорд, и Ральф Л. Бринстер и Ричард Палмитер в сотрудничестве с Пенсильванский университет и Вашингтонский университет вводили очищенную ДНК в одноклеточный мышиный эмбрион с использованием методов, разработанных Бринстером в 1960-х и 1970-х годах, впервые продемонстрировавших передачу генетического материала последующим поколениям. [6] [7] [8] В течение 1980-х годов Палмитер и Бринстер разработали и возглавили область трансгенеза, усовершенствовав методы зародышевый модификации и использования этих методов для выяснения активности и функции генов способом, невозможным до их уникального подхода. [9]

Методы

Существует два основных технических подхода к производству генетически модифицированных мышей. Первый предполагает пронуклеарная инъекция, метод, разработанный и усовершенствованный Ральф Л. Бринстер в 1960-х и 1970-х годах в единственную клетку эмбриона мыши, где она случайным образом интегрируется в геном мыши. [10] Этот метод создает трансгенный мыши и используется для вставки новой генетической информации в геном мыши или для сверхэкспрессии эндогенный гены. Второй подход, впервые предложенный Оливер Смитис и Марио Капеччи, предполагает изменение эмбриональные стволовые клетки с Конструкция ДНК содержащие последовательности ДНК гомологичный к целевому гену. Эмбриональные стволовые клетки, которые рекомбинировать с геномной ДНК отбираются и затем вводятся мышам бластоцисты. [11] Этот метод используется для манипулирования одним геном, в большинстве случаев. "выбивание" целевого гена, хотя могут происходить все более тонкие и сложные генетические манипуляции (например, гуманизация определенного белка или изменение только одного нуклеотиды).

Использует

Трансгенные мыши, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, который светится зеленым в синем свете. Центральная мышь дикого типа.

Генетически модифицированные мыши широко используются в исследованиях в качестве моделей болезней человека. [12] Мыши - полезная модель для генетических манипуляций и исследований, поскольку их ткани и органы похожи на человеческий и несут практически все те же гены, что и у человека. [13] У них также есть преимущества перед другими млекопитающими с точки зрения исследований, поскольку они доступны в виде сотен генетически однородных штаммов. [13] Кроме того, благодаря их размеру их можно хранить и размещать в большом количестве, что снижает затраты на исследования и эксперименты. [13] Самый распространенный тип - это нокаутирующая мышь, где удаляется активность одного (или в некоторых случаях нескольких) генов. Они использовались для изучения и моделирования ожирения, болезней сердца, диабета, артрита, злоупотребления психоактивными веществами, беспокойства, старения, температуры и восприятия боли, а также болезни Паркинсона. [14] [15] Трансгенные мыши, созданные для переноса клонированных онкогены и нокаутирующих мышей не хватает гены, подавляющие опухоль предоставили хорошие модели для человеческих рак. Сотни из них онкомис были разработаны, охватывая широкий спектр видов рака, поражающих большинство органов тела, и в настоящее время дорабатываются, чтобы стать более репрезентативными для рака человека. [9] Симптомы болезни и потенциальные лекарственные средства или методы лечения могут быть протестированы на этих мышах.

Мышь была генетически сконструирована так, чтобы увеличивать мышечный рост и силу за счет сверхэкспрессии инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I) в дифференцированном мышечные волокна. [16] [17] У другой мыши был изменен ген, который участвует в метаболизм глюкозы и бегает быстрее, живет дольше, более сексуально активен и ест больше, не становясь толще, чем средняя мышь (см. Метаболические супермыши). [18] [19] У другой мыши был Рецептор TRPM8 заблокирован или удален в исследовании с участием капсаицин и ментол. [15] После удаления рецептора TRPM8 мышь не могла обнаруживать небольшие изменения температуры и связанную с этим боль. [15]

ЧИТАЙТЕ ТАК ЖЕ

Ради спасения от коронавируса ученые подсадят мышкам человеческий ген

Это нужно, чтобы впоследствии заразить подопытных COVID-19 и выяснить, как действует коварный вирус (подробнее)

Ради спасения от коронавируса: ученые сделали самцу белой мыши вазэктомию и сняли это на видео

В Институте цитологии и генетики создают трансгенных мышей для опытов с новой вакциной. Из процесса решили сделать познавательное ютуб-шоу (подробнее)

К ЧИТАТЕЛЯМ

Если вы стали очевидцем ЧП или чего-то необычного, сообщите об этом в редакцию:

Редакция: (383) 289-91-00

Возрастная категория сайта 18 +

Читайте также: