Способы выращивания клеток животных реферат

Обновлено: 07.07.2024

Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры среду посевного материала и до завершения процесса роста клеток или биосинтеза целевого продукта. По окончании ферментации образуется сложная смесь, состоящая из клеток продуцента, раствора непотребленных питательных компонентов и накопившихся в среде продуктов биосинтеза. Такую смесь называют культуральной жидкостью.

В зависимости от цели производства — получение клеток или продуктов их жизнедеятельности — способы ведения основной ферментации различаются. Если процесс направлен на получение биомассы, то назначение ферментации — получить максимально возможный титр клеток, а в случае получения метаболитов их накопление осуществляют одновременно, причем максимумы образования продуцента и целевого продукта всегда сдвинуты по времени. Поэтому продолжительность ферментации в первом случае всегда меньше, чем во втором.

Если целью является получение биомассы промышленного штамма в периодическом процессе, то время культивирования не превышает 24 ч. При производстве первичных метаболитов время биосинтеза составляет 48–72 ч, а вторичных — 72–144 ч.
При культивировании различных микроорганизмов интервал рабочих температур варьирует в пределах 25–60°С, значения рН — 2,9, расход воздуха в аэробных процессах — 0,15–2,5 м3/1 м3 среды/мин.

Выделяют несколько способов проведения ферментации – периодические, полупериодический, непрерывный и многоциклический.

Периодический процесс — это такой процесс, когда в ферментер подается посевной материал, задаются определенные технологические параметры (температура, рН, обороты мешалки) и процесс проходит самостоятельно с образованием целевого продукта. Этот процесс экономически не выгоден, т.к. образуется мало целевого продукта.

Полупериодический процесс отличается от периодического процесса тем, что в процессе ферментации в ферментер добавляются различные питательные вещества (источники углеводов, азота), регулируется рН в процессе ферментации, добавляется предшественник в определенный момент ферментации. Полупериодический процесс является экономически выгодным, имея большой выход продукции.

Сущность непрерывного процесса в том, что из ферментера в процессе биосинтеза берется определенное количество культуральной жидкости и вносится в другой ферментер, в котором тоже начинается биосинтез. Культуральная жидкость выполняет функции посевного материала. В ферментер, из которого взяли часть культуральной жидкости, добавляется такое же количество воды и процесс биосинтеза в нем продолжается. Эта операция постоянно повторяется. Используя необходимое количество ферментеров и постоянно перенося часть культуральной жидкости из одного ферментера в другой достигается замкнутый цикл. Преимущество непрерывного процесса в том, что сокращается стадия выращивания посевного материала.

В конце ферментации многоциклического процесса 90% культуральной жидкости сливается из ферментера, а оставшаяся часть выполняет роль посевного материала.

Особенности культивирование клеток животных.

Клетки животных во многом отличаются от прокариотических и грибных клеток: они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореакторов и ферментеров, в особенности системы перемешивания и аэрации, которые при работе не должны создавать стрессовых условий для культуры.

Перемешивание должно быть гомогенным, чтобы избежать градиентов температуры и рН, повышенных концентраций субстрата и продуктов. При этом необходимо учитывать чувствительность клеток к ранению. Обычно перемешивание осуществляется большими лопастными мешалками при низких скоростях. Пневматическое (воздушное) перемешивание в эрлифтных реакторах или гидравлическое перемешивание с помощью внешних насосов в реакторах с взвешенной твердой фазой так же решает проблемы, связанные с культивированием.

Для предотвращения пенообразования и повреждения клеток пузырьками воздуха можно уменьшить объем подаваемой газовой смеси, использовать поверхностную продувку или безпузырьковую аэрацию через мембраны. При сокращении объема подаваемого газа необходимо увеличить в нем концентрацию кислорода. Оптимальное снабжение кислородом, азотом, воздухом и углекислым газом создается с помощью систем перемешивания газов.

Выращивание животных клеток можно осуществлять в стационарной (batch), стационарной с подпиткой (fed- batch) или непрерывной (continuous) культуре с задержанием биомассы или без. При стационарном культивировании клетки растут без добавления субстрата после посева культуры. Однако, недостаток субстрата или образование токсичных продуктов метаболизма может снизить продуктивность. Чтобы избежать этих проблем применяют стационарное культивирование с подпиткой, при котором субстрат или другие необходимые вещества добавляют порциями или непрерывно. При непрерывном культивировании продукты метаболизма, ингибирующие рост — лактат, аммоний, удаляют, добавляя компенсирующий объем свежей среды, чтобы избежать недостатка субстрата для роста.

Из-за низкой продуктивности, связанной с медленным ростом, для клеток животных предпочтителен непрерывный процесс культивирования с задержанием клеток (перфузионная система). Это приводит к большей плотности культуры клеток и большему контакту с ними среды, что увеличивает продуктивность. Для задержания биомассы и предотвращения ее выноса с удаляемыми объемами культуральной жидкости используют различные системы фильтрации, например, роторные или вращающиеся фильтры.

Многие клетки млекопитающих растут только будучи прикрепленными к поверхности. Такие опорнозависимые клетки иммобилизуют на микроносителях, таких как стекло, целлюлоза, коллаген, желатин или пластик. Если носитель пористый, клетки могут расти внутри него, при этом они защищены от раневого стресса, что позволяет использовать более высокие скорости перемешивания и продувки в процессе культивирования.

Применение анализаторов Bioprofile FLEX при культивировании клеток животных.

Своевременная подача субстрата в ферментер и вы вывод продуктов метаболизма обеспечивают стабильный рост культуры и повышают эффективность процесса культивирования. Аппаратный комплекс современных ферменетров позволяет контролировать такие параметры культивирования как концентрация кислорода, pH, температуру, но контроль прямых показателей концентрации субстрата (например, глюкозы) или метаболита (например, лактата) осуществляется дополнительным способами и аппаратами. Все большую распространенность для решения этой задачи получают многопараметровые биохимические анализаторы (Bioprofile FLEX), принцип измерения которых основан на технологии биосенсоров. Такие приборы позволяют измерять сразу несколько параметров из одного образца. Время одного анализа составляет 1-2 мин. Анализатор может быть интегрирован в контроллер ферментера, подача питательной среды может осуществляться по показаниям анализатора. Таким образом, современные биотехнологические анализаторы (NOVA Bioprofile FLEX) позволяют решать задачи оптимизации подачи подпитки в ферментер и вывод метаболитов из среды ферментации, и, в конечном счете, добиваться увеличения выхода целевого продукта.

Описание биотехнологического анализатора Bioptofilr FLEX.

Рис.1 Пример результатов измерения биохимического модуля Bioprofile FLEX.

Анализатор BioProfile FLEX сочетает в себе функциональность трех офф-лайн анализаторов (биохимический анализатор, анализатор подсчета клеток, осмометр) в одном устройстве. Анализатор имеет модульную конструкцию, в том числе модули газов/электролитов, питательных веществ/метаболитов, плотности клеток/жизнеспособности, и осмометрический модуль. Газово/электролитный модуль и модуль питательных веществ/метаболитов используют ион-селективные электроды, потенциометрию, амперометрию, и ферментацию, в зависимости от биосенсоров.

Рис.2 Пример результатов измерения модуля осмометрии Bioprofile FLEX.

Модуль плотности/жизнеспособность клеток был разработан Нова Биомедикал для подсчета клеток и оценки жизнеспособности, основанный на традиционном триптофановом синем методе исключения. Сначала образец клеток смешивается с триптофановым синим, и смесь инкубируется так, что мертвые клетки поглощают триптофановый синий. Образец затем оседает на полупрозрачной нижней части проточной ячейки. Проточная ячейка перемещается в фиксированный объектив микроскопа с помощью прецизионной системы управления движением, с высоким разрешением изображений. Подсчет клеток и жизнеспособность определяется путем обработки изображений на основе определяемых пользователем ограничений, таких как живые/мертвые клетки, яркость и средние размеры ячеек.

Рис.3 Пример результатов измерения модуля жизнеспособности/плотности клеток Bioprofile FLEX.

Каждый модуль может быть выбран индивидуально, использование всех модулей BioProfile FLEX требуют всего 1 мл образца культуральной жидкости и 7,5 мин для выполнения анализов. Результаты и пользовательские данный экспортируются в электронном виде в формате электронной таблицы.

Хотя интегрированный анализатор с вводом данных отчасти упорядочивает ручной труд, но только новая уникальная автоматическая система отбора проб, разработанная специально на BioProfile Flex (NOVA Biomedical), позволяет полностью исключить ручной труд.

Многочисленные исследования доказывают успешное применение нового интегрированного многофункционального анализатора и автоматической системы отбора проб для мониторинга клеточных культур млекопитающих. Полученные результаты свидетельствуют, что система имеет потенциал для сокращения ручного труда и связанных с ним погрешностей. При этом процесс измерения может происходить в онлайн режиме без прерывания/нарушения ферментации.

История

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор, содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней. Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. В 1910 г. Пейтон Раус, работая с культурой клеток саркомы цыплёнка, индуцировал образование опухолей у здоровых животных. Позже это привело к открытию онкогенных вирусов (Нобелевская премия по физиологии или медицине 1966 г.).

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов, как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс. Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными. Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Культивирование клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др. Факторы роста, используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста.

Клетки можно выращивать в суспензии, либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно изменённых таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности; это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения адгезивных свойств, а также для стимулирования роста и дифференцировки. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяются органотипические культуры клеток, которые представляют собой трёхмерную среду, в отличие от обычной лабораторной посуды. Эта система культивирования физически и биохимически наиболее сходна с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии). С целью обеспечения необходимых физических условий для культивирования адгезивных культур и заселения объёма внеклеточного матрикса тканеинженерных конструкций используются системы динамического культивирования на основе роторных и вихревых биореакторов, биореакторов с непосредственным на скаффолд: компрессионных биореакторов, биореакторов с механическим натяжением и гидростатическим давлением, специальных биореакторов для электростимуляции клеток и тканей, а также комбинированных биореакторов.

Перекрёстное загрязнение клеточных линий

При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
По той же причине может начаться клеточное дифференцирование.

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).

Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH.

Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.

Пассирование клеток

Пассирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма. Суспензивные культуры пассировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует отделить от субстрата и разделить их скопления. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТА или другие ферментные смеси, иногда достаточно только ЭДТА в физиологическом растворе (раствор Версена). Если культура растет медленно, её обычно подкармливают без переноса в другой сосуд, периодически (обычно раз в 2-3 дня) отбирая часть использованной среды и добавляя свежую.

Трансфекция и трансдукция

В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путём трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов. Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК.

ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов. Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла. Этот метод называется трансдукция.

Линии клеток человека

Гибридома

Использование клеточных культур

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии.

Продукты биотехнологии

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты, синтетические гормоны, моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин. Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений.

Тканевые культуры

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo.

Вакцины

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки. Вследствие угрозы пандемии гриппа, вызываемого штаммом вируса H5N1, в настоящий момент правительство Соединённых Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

Культуры клеток не млекопитающих

Культуры клеток растений

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определённого баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов.

Бактериальные, дрожжевые культуры

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара. Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры

Культуры вирусов выращивают на культурах клеток млекопитающих, растений, грибов или бактерий, в зависимости от природного хозяина конкретного типа вирусов. Но при некоторых условиях могут быть выращены и в клетках другого типа.

В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.

Виды клеточных линий

Краткий перечень клеточных линий

Приведённый здесь список наиболее распространённых клеточных линий не является полным и исчерпывающим.

Содержание

Введение
Культуры клеток и тканей
Методы культивирование вирусов
Вирусологические методы исследования
Заключение
Список используемой литературы

Вложенные файлы: 1 файл

срс 7 микруша.docx

Введение
Культуры клеток и тканей
Методы культивирование вирусов
Вирусологические методы исследования
Заключение
Список используемой литературы

Культура тканей — способ вегетативного размножения растений.

На питательную среду помещается немного клеток образовательной ткани. Клетки начинают делиться, и вскоре молодое растение можно высаживать в грунт. По сути дела это клонирование. Так можно разводить однолетники, а также ценные Орхидные.

В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.

1. Культуры клеток и тканей

Культура клеток и тканей, метод сохранения в жизнеспособном состоянии клеток, участков тканей, органов или их частей вне организма. Во 2-й пол. 19 в. развитие микробиологии, прежде всего медицинской (необходимость выделения и изучения микробов, вызывающих инфекционные болезни), а также производств, основанных на процессах брожения (виноделие и др.), привело к созданию методов культивирования клеток бактерий, дрожжей и других микроорганизмов, т. е. методов их выделения, выращивания, размножения и сохранения в искусственных условиях. Были разработаны составы жидких и твёрдых питательных сред, методы, обеспечивающие их стерильность, способы выращивания чистых культур, состоящих из клеток одного вида, и т. д. К сер. 20 в. было освоено культивирование микроорганизмов в промышленных масштабах.

Первые опыты по выращиванию клеток и тканей животных вне организма были сделаны в нач. 20 в. Дальнейшее совершенствование метода шло параллельно успехам цитологии, биохимии, генетики, эмбриологии, молекулярной биологии. Его возможности возросли после того, как научились получать изолированные клетки из различных животных тканей (путём их обработки специальными ферментами, растворяющими межклеточное вещество и разрушающими межклеточные контакты) и выяснили потребности разных клеток в гормонах, факторах роста и др. веществах, вносимых в искусственные питательные среды. Очевидные преимущества работы с генетически однородными клетками и тканями в контролируемых условиях вне организма по сравнению с проведением исследований на целых организмах сделали этот метод одним из наиболее универсальных в биологии. Столь же плодотворным оказалось его применение в медицине и при решении ряда задач сельского хозяйства и биотехнологии.

Совместное культивирование клеток разных линий (клонов) привело к рождению нового важного раздела в экспериментальной биологии – генетики соматических клеток и прежде всего метода гибридизации соматических клеток.

Клеточные культуры служат также удобными объектами для изучения тканевой несовместимости и других иммунных реакций. Они используются в диагностике вирусов и для получения вакцин. Таким образом, культура клеток и тканей применяется для решения как фундаментальных теоретических проблем (таких, напр., как клеточная дифференцировка), так и различных практических задач, особенно в области медицины. Этот метод – неотъемлемая составная часть генной инженерии, клеточной инженерии, клонирования и других направлений экспериментальной биологии.

2. Методы культивирование вирусов

Для культивирования вирусов используют ряд методов. Это культивирование в организме экспериментальных животных, развивающихся куриных вибрионах и культурах тканей (чаще — эмбриональные ткани или опухолевые клетки). Для выращивания клеток тканевых культур используют многокомпонентные питательные среды (среда 199, среда Игла и др.). Они содержат индикатор измерения рН среды и антибиотики для подавления возможного бактериального загрязнения.

Культуры тканей могут быть переживающими, в которых жизнеспособность клеток удается сохранить лишь временно, и растущими, в которых клетки не только сохраняют жизнедеятельность, но и активно делятся.

В роллерных культурах клетки ткани фиксированы на плотной основе (стекло) — чаще в один слой (однослойные), а в суспензированных —взвешены в жидкой среде. По количеству пассажей, выдерживаемых растущей культурой тканей, среди них различают:

• первичные (первично-трипсинизированные) культуры тканей, которые выдерживают не более 5—10 пассажей;
• полуперевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются не более чем в 100 генерациях;
• перевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются в течение неопределенно длительного срока в многочисленных генерациях.
Чаще всего используются однослойные первично-перевиваемые и перевиваемые тканевые культуры.

О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по ци-топатическому действию (ЦПД):
• деструкции клеток;
• изменению их морфологии;
• формированию многоядерных симпластов или синтиция в результате слияния клеток.
• в клетках культуры ткани при размножении вирусов могут образовываться включения — структуры, не свойственные нормальным клеткам.

Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.
По локализации в клетке различают:
• цитоплазматические;
• ядерные;
• смешанные включения.

Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения — вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тельца Бабеша-Негри) и др.

При культивировании вирусов, обладающих гемагглютжирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти молекулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбировать на себе эритроциты — феномен гемадсорбции.

При размножении в питательной среде с индикатором незараженных
клеток культуры ткани вследствие образования кислых продуктов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.

3. Вирусологические методы исследования

Методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом.

Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур.

Тканевые культуры давно нашли применение для решения различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня.

Культивирование клеток сильно зависит от условий. Они изменяются для каждого типа клеток, но обычно состоят из подходящего сосуда с субстратом или средой, которые обеспечивают необходимые питательные вещества (аминокислоты, углеводы, витамины, минералы), факторы роста, гормоны и газы (CO2, O2) и регулируют физико-химическую среду (буфер рН, осмотическое давление, температуру). Большинство клеток требуют поверхности или искусственного субстрата (адгезивная или монослойная культура), тогда как другие могут быть свободно размножены в культуральной среде (суспензионная культура). Продолжительность жизни большинства клеток генетически определена, но некоторые объекты культивирования клеток были трансформированы в бессмертные клетки, которые будут воспроизводиться бесконечно, если для этого будут созданы оптимальные условия.

Определение

История

Лабораторная техника получения и культивирования клеток, отделенных от исходного источника ткани, стала более устойчивой в середине 20 века. Основные прорывы в этой области были совершены учеными из Йельского университета.

Прорыв в середине века

Изначально получение и культивирование клеток практиковалось для того, чтобы найти панацею от множества опасных вирусов. Рядом исследователей было открыто, что многие штаммы вирусов могут спокойно жить, процветать и размножаться на искусственно выращиваемых клетках животных или даже целых органах, которые удерживаются автономно в специальных колбах. Как правило, для подобных испытаний используются клетки органов животных, максимально приближенных к человеку - к примеру, высших приматов вроде шимпанзе. Все эти открытия были совершены в 1940-х годах, когда эксперименты над людьми в силу определенных причин были наиболее актуальны.

Методология

Клетки могут быть выделены из тканей для культуры ex vivo несколькими способами. Они могут быть легко очищены от крови, однако только белые клетки способны к росту в культуре. Клетки могут быть выделены из твердых тканей путем переваривания внеклеточного матрикса с использованием ферментов, таких как коллагеназа, трипсин или проназа, перед перемешиванием ткани для высвобождения клеток в суспензию. Альтернативно кусочки ткани могут быть помещены в ростовые среды, а клетки, которые растут, доступны для культуры. Этот метод известен как культура эксплантатов.

Клетки, которые культивируются непосредственно у субъекта, известны как первичные клетки. За исключением некоторых, полученных из опухолей, большинство первичных клеточных культур имеют ограниченный срок службы.

Бессмертные и стволовые клетки

Установленная или иммортализованная клеточная линия приобрела способность размножаться бесконечно либо через случайную мутацию, либо преднамеренную модификацию, такую как искусственная экспрессия гена теломеразы. Многочисленные клеточные линии хорошо известны как типичные типы клеток.

Массовая культура линий клеток животных имеет основополагающее значение для производства вирусных вакцин и других продуктов биотехнологии. Культура стволовых клеток человека используется для расширения их числа и дифференциации клеток на различные типы, пригодные для трансплантации. Культивирование клеток человека (стволовых) также используется для сбора молекул и экзосом, высвобождаемых стволовыми клетками для целей терапевтического использования.

Связь с генетикой

Биологические продукты, полученные с помощью технологии рекомбинантной ДНК (рДНК) в культурах животных, включают ферменты, синтетические гормоны, иммунобиологические (моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины) и противораковые агенты. Хотя многие более простые белки могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, которые гликозилированы (модифицированы углеводами), в настоящее время должны быть сделаны в клетках животных.

Важным примером такого комплексного белка является гормон эритропоэтин. Расходы на выращивание клеточных культур млекопитающих высоки, поэтому ведутся исследования по созданию таких сложных белков в клетках насекомых или на высших растениях. Использование отдельных эмбриональных клеток и соматических эмбрионов в качестве источника прямого переноса генов путем бомбардировки частицами, экспрессии транзитных генов, и конфокальная микроскопия является одной из областей ее применений. Культивирование растительных клеток является самой распространенной формой этой практики.

Тканевые культуры

История тканевой культуры

В 1885 году Вильгельм Ру снял участок медуллярной пластины эмбриональной курицы и несколько дней поддерживал ее в теплом солевом растворе, устанавливая основной принцип тканевой культуры. В 1907 году зоолог Росс Гранвилл Харрисон продемонстрировал рост эмбриональных клеток лягушки, которые привели бы к возникновению нервных клеток в среде свернувшейся лимфы. В 1913 году Э. Штайнхардт, C. Исраэль и Р. А. Ламберт выращивали вирус коровьей оспы в фрагментах роговой ткани морской свинки. Это уже было чем-то куда более продвинутым, чем культивирование клеток растений.

От прошлого к будущему

В современном использовании тканевая культура обычно относится к росту клеток из ткани многоклеточного организма in vitro. Условия культивирования клеток при этом не очень важны. Эти клетки могут быть выделенными из донорского организма, первичными клетками или иммортализованной клеточной линией. Клетки омывают культуральной средой, которая содержит питательные вещества и источники энергии, необходимые для их выживания. Термин "тканевая культура" часто используется взаимозаменяемо с клеточной культурой.

Применение

Буквальное значение культуры тканей относится к культивированию кусочков ткани, то есть к эксплантационной культуре.

Тканевая культура является важным инструментом для изучения биологии клеток из многоклеточных организмов. Она обеспечивает in vitro модель ткани в четко определенной среде, которой можно легко манипулировать и анализировать ее.

В культуре тканей животных клетки можно выращивать в виде двумерных монослоев (обычная культура) или внутри волокнистых лесов или гелей для достижения более натуралистических трехмерных тканеподобных структур (3D-культура). Эрик Саймон в докладе гранта NIH SBIR 1988 года показал, что электроспиннинг можно использовать для получения полимерных волокнистых каркасов нано- и субмикронного масштаба, специально предназначенных для использования в качестве клеточных и тканевых субстратов in vitro.

Это раннее использование электропроводных волокнистых решеток для клеточной культуры и тканевой инженерии показало, что различные типы клеток будут прилипать и размножаться на поликарбонатных волокнах. Было отмечено, что, в отличие от сплюснутой морфологии, обычно наблюдаемой в 2D-культуре, клетки, выращенные на электрошнурных волокнах, демонстрируют более округлую 3-мерную морфологию, обычно наблюдаемую в тканях in vivo.

Культура растительной ткани, в частности, связана с выращиванием целых растений из мелких кусочков растительных волокон, культивируемых в среде.

Различия в моделях

Исследования в тканевой инженерии, в области стволовых клеток и молекулярной биологии в первую очередь включают в себя выращивание клеточных культур на плоских пластиковых блюдах. Этот метод известен как двумерная (2D) клеточная культура и впервые был разработан Вильгельмом Ру, который в 1885 году удалил часть медуллярной пластинки эмбриональной курицы и поддерживал ее в теплом физиологическом растворе в течение нескольких дней на плоском стекле.

От продвижения полимерной технологии возникла современная стандартная пластиковая посуда для двумерной клеточной культуры, широко известная как чашка Петри. Юлий Рихард Петри, немецкий бактериолог, как правило, упоминается в научной литературе как автор этого изобретения, работал помощником Роберта Коха. Сегодня различные исследователи также используют культуральные лабораторные колбы, конические и даже одноразовые мешки, подобные тем, которые используются в одноразовых биореакторах.

Помимо культуры хорошо устоявшихся иммортализованных клеточных линий, клетки из первичных эксплантов множества организмов могут культивироваться в течение ограниченного периода времени до появления чувствительности. Культурные первичные клетки широко использовались в исследованиях, как в случае кератоцитов рыб в исследованиях миграции клеток. Среды для культивирования клеток при этом могут использоваться самые разные.

Культуры растительных клеток обычно выращивают в виде культур клеточной суспензии в жидкой среде или в культурах каллюса на твердой среде. Культура недифференцированных растительных клеток и калли требует надлежащего баланса гормонов роста растений ауксина и цитокинина.

Читайте также: