Общие принципы взятия бактериологических анализов реферат
Обновлено: 05.07.2024
Взятие анализов и их транспортировка являются одним из ответственных этапов в работе лабораторий, обеспечивающим успех исследований. Если допущена ошибка на самом первом этапе взятия и траспортировки проб, вся работа лаборатории может оказаться не только бесплодной, но и послужить причиной назначения неадекватного лечения пациенту, от коготорого получен биоматериал.
Общими требованиями к процедуре отбора и транспортировки проб являются:
- Знание оптимальных сроков для взятия материала на исследование;
- Отбор материала из места максимальной локализации возбудителя;
- Отбор материала для исследования в необходимом и достаточном объеме с обеспечением условий, исключающих контаминацию проб;
- По возможности, взятие материала производится до применения антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов или после отмены антибиотиков через 10 дней (кроме исследования на дисбактериоз);
- Материал для бактериологических исследований забирают только в стерильную, маркированную посуду;
- Материал доставляется в контейнерах, не допуская опрокидывания и расгерметизации.
- Материал доставляется в лабораторию немедленно или в течение 1-2 часов. При увелечении времени доставки проб до 48 часов необходимо использовать специальные транспортные среды.
Правила отбора проб клинического материала для бактериологических исследований
Разнообразие материала и своеобразие микрофлоры отдельных тканей требует применения определенных методических приемов отбора проб:
- Материал от больных необходимо брать до лечения антибактериальными препаратами или не ранее 10 дней после окончания курса лечения.
- Следует брать материал непосредственно из очага инфекции или исследовать клинический материал, отражающий воспалительный процесс в тех или иных органах и тканях (например, мочу при уроинфекциях, кал при дисбактериозах кишечника и т.д.).
- Важно соблюдать правила асептики для исключения контаминации пробы посторонней микрофлорой.
- При взятии проб можно использовать стерильные ватные тампоны, транспортные среду, шприцы (для крови, гнойного отделяемого и т.д.).
- Материал для бактериологического исследования должен быть доставлен в лабораторию не позже 1-2 часов после отбора проб, так как более длительное пребывание при комнатной температуре приводит к гибели ряда микроорганизмов, в том числе возбудителей инфекционного процесса и размножению в этих материалах посторонней гнилостной микрофлоры.
В случае хранения материала в холодильнике срок хранения можно увеличить до 3-4 часов (это не относится к пробам крови и спиномозговой жидкости). Пренебрежение сроками доставки материала приводит к искажению результатов исследования. Использование транспортных сред удлиняет сроки хранения материала до 24-48 ч.
Правила сбора мочи для женщин
Помыть руки с мылом. Вымойте область наружных половых органов. Во избежание попадания в мочу выделений из влагалища, во время сбора мочи женщинам, живущим половой жизнью, рекомендуется ввести во влагалище тампон. Снять крышку с контейнера и взять его в руку, стараясь не касаться краев. Удерживая половые губы разведенными, выпустите немного мочи в унитаз, приостановите мочеиспускание, а затем, подставив контейнер под струю мочи, наполните его до половины объема (10-30 мл). Не прикасаться контейнером к телу. Плотно закрыть. Доставить в лабораторию в течении 1,5-2 часов.
Правила сбора мочи у грудных детей
Провести туалет наружных половых органов, собирать мочу в одноразовый мочеприемник. Моча выжатая из одноразовых подгузников, исследованию не подлежит. Доставить в лабораторию в течении 1,5-2 часов.
Правила сбора мочи для мужчин
Вымойте руки с мылом. Отведите назад крайнюю плоть (если она не обрезана), головку полового члена вымыть с мылом теплой кипяченой водой, просушить с помощью чистой салфетки. Подготовить контейнер для мочи, слегка открутить крышку так, чтобы ее легко можно было снять. Не дотрагиваться руками до внутренних стенок контейнера и крышки. Выпустить небольшое количество мочи в унитаз (или судно). Приостановите мочеиспускание. Удерживая крайнюю плоть в отведенном положении, направьте струю мочи в контейнер и наполните его до указанного уровня. Тщательно закройте контейнер крышкой. Доставить в лабораторию в течении 1,5-2 часов.
1 Бактериологический метод
2 Питательная Среда
3 Классификация
4 Этапы бактериологического исследования
5 Сбор и транспартировка проб биологических материалов
6 Выделение и идентификация чистой культуры бактерий
7 Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Вложенные файлы: 1 файл
Бактериол.метод исслед.docx
РЕФЕРАТ на тему:
Бактериологический метод исследования
Студентка 101 гр
1 Бактериологический метод
2 Питательная Среда
4 Этапы бактериологического исследования
5 Сбор и транспартировка проб биологических материалов
6 Выделение и идентификация чистой культуры бактерий
7 Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Бактериологический метод
Бактериологическое исследование основано на культивировании бактерий на питательных средах, выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации.
Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов одного вида, как правило выращенную из изолированной колонии на плотной питательной среде.
Выбор метода культивирования, состава питательной среды зависит главным образом от типа питания и дыхания (биологического окисления) микроорганизмов. На рисунке показан наиболее распространенный способ посева исследуемого материала с целью выделения чистой культуры: механическое разобщение клеток микроорганизмов по поверхности плотной питательной среды с помощью бактериологической петли.
Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Состав сред определяется метаболическими потребностями той или иной группы бактерий. Все питательные среды должны отвечать следующим требованиям:
- содержать основные питательные вещества в легкоусвояемой форме;
- быть влажными, изотоничными и нетоксичными (для исследуемых микробов);
- иметь определенную вязкость;
- иметь оптимальный показатель pH и окислительно-восстановительный (редокс) потенциал;
- обладать буферными свойствами;
- быть стерильными;
- по возможности быть прозрачными.
- По исходным компонентам:
- натуральные среды — готовят из продуктов животного и растительного происхождения(мясо, костная и рыбная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.)
- синтетические среды — готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.
- жидкие
- полужидкие
- плотные
- простые: мясопептонный бульон(МПБ), мясопептонный агар(МПА), питательный желатин,
- сложные — готовят прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества.
- основные — служат для культивирования большинства патогенных микробов. МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода.
- специальные — служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах.
- селлективные(избирательные) — служат для выделения определённого вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Среды становятся селлективными при добавлении к ним определённых антибиотиков, солей, изменения pH.Жидкие элективные среды называют средами накопления.
- дифференциально- диагностические — позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности.
- консервирующие — предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала.
Этапы бактериологического исследования
1) Сбор и транспортировка проб биологических материалов
2) обработка исследуемого материала физическими или химическими факторами в целях удаления или уменьшения посторонней микрофлоры.
3) посев исследуемого материала на питательные среды для получения изолированных колоний;
4) инкубация засеянных питательных сред.
5) исследование колоний . Для изучения выбирают однородные изолированные колонии, располагающиеся далеко от краев чашки и по штриху петли, окружают их чертой, нумеруют и делают с них мазки;
6) пересев с выбранных колоний на среды накопления.
7) инкубация посевов в термостате до появления сплошного роста (обычно 1 -2 дня);
8) определение чистоты выросшей на скошенных средах путем макроскопического осмотра роста и микроскопии мазка из него;
9) идентификация выделенной чистой к-ры и в случае необходимости
10) заключение о видовой принадлежности выделенной колонии и ее свойствах.
Сбор и транспортировка проб биологических материалов
Основные требования, предъявляемые к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования:
- взятие материала до начала этиотропного лечения:
- соблюдение условий стерильности при сборе;
- техническая правильность сбора;
- достаточное количество материала;
- обеспечение температурного режима хранения и транспортировки;
- сведение к минимуму промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.
Транспортировку материала в лабораторию необходимо осуществить как можно скорее (желательно немедленно, но не более чем через 1-2 ч после его взятия). Следует соблюдать определённый температурный режим. Стерильные в норме материалы (кровь, СМЖ) хранят и доставляют в лабораторию при температуре 35-37 °С. Нестерильные материалы (моча, отделяемое дыхательных путей и др.) хранят при комнатной температуре не более 1-2 ч или не более 18 ч при 4 °С (условия бытового холодильника). При невозможности доставить пробы в лабораторию в регламентированные сроки рекомендовано использовать транспортные среды, предназначенные для сохранения жизнеспособности возбудителей в условиях консервации.
для исследования следует брать у больного в период подъёма температуры тела. Рекомендовано исследовать 4-6 проб крови, взятых с интервалом 4 ч.
Пробу крови (10 мл у взрослого и 5 мл у ребёнка) засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10.
для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3-5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала необходимо начать как можно быстрее после доставки его в лабораторию (не позже чем через 2 ч).
При отборе испражнений желательно направлять для исследования патологические примеси (слизь, частицы эпителия и др.), избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.
Среднюю порцию свободно выпущенной мочи в количестве 3-5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительно отбирать утренние порции мочи.
собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете, отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.
Промывные воды желудка
собирают в стерильные банки в количестве 20-50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами, лучше кипячёной водой без добавления соды, перманганата калия и др.
утреннюю мокроту, выделяемую во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипячёной водой в целях механического удаления остатков пищи, .спущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.
Отделяемое глотки, ротовой полости и носа.
Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 часа после еды стерильным ватным тампоном или ложечкой со слизистой оболочки или ее пораженных участков у выхода протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки ее снимают стерильным пинцетом.
Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным тампоном.
Выделение и идентификация чистой культуры бактерий
- Аэробные и факультативно-анаэробные бактерии.
- На первом этапе из исследуемого материала готовят мазки, микроскопируют их, затем сеют материал на плотную среду в чашки Петри шпателем или бактериологической петлей. При этом достигается механическое разъединение микроорганизмов на поверхности питательной среды, что позволяет получить их рост в виде изолированных колоний
На втором этапе изучают культуральные свойства бактерий (характер их роста на питательных средах).
- Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете.
Чашку поворачивают дном к себе и рассматривают колонии в проходящем свете. При наличии различных видов колоний их нумеруют и описывают каждую в отдельности. Обращают внимание на следующие свойства:
а) величину колоний (крупные — более 4 мм в диаметре, средние — 2—4 мм, мелкие — 1 — 2 мм, карликовые — менее 1 мм);
б) форму очертаний колоний (правильно и неправильно округлая, розеткообразная, ризоидная и др.);
в) степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная).
Микроскопическое изучение колоний.
Чашку устанавливают вверх дном на предметном столике микроскопа, опускают конденсор и с помощью объектива 8х изучают колонии, фиксируя в протоколе их структуру (гомогенная или аморфная, зернистая, волокнистая и др.) и характер краев (ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые и др.).
Из части колоний готовят мазки (при взятии материала из колонии отмечают ее консистенцию — сухая, слизистая, пастообразная), окрашивают по Граму и микроскопируют, выясняя тинкториальные свойства микроорганизмов. При наличии однородных бактерий остаток колоний пересевают на скошенный агар для получения чистой культуры в достаточном количестве. Пробирки с посевами помещают в термостат на 18 — 24 ч при температуре 37 °С.
На третьем этапе изучают образовавшиеся в чашках изолированные колонии и из наиболее типичных делают мазки. Остаток колонии засевают в среду Китта—Тароцци. для накопления чистой культуры и инкубируют при 37 °С.
На четвертом этапе выросшую на среде Китта—Тароцци культуру проверяют на чистоту и идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным и другим свойствам.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам обычно применяют:
• Метод диффузии в агар.
Метод дисков — качественныйи позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату
• Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет invitroпредотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов.
Резюме: Статья направлена на расширение знаний врачей-клиницистов правилам забора материала и обоснованием необходимости соблюдения их для получения адекватного качественного результата исследования. Совместная работа врачей клинического и лабораторного профиля приведет к успешному выбору терапии у пациента.
Клиническая микробиология - это раздел медицинской микробиологии, изучающий основы этиологии, патогенеза, иммунитета, лабораторную диагностику микробных заболеваний, возникающих у неинфекционных (соматических) больных - терапевтических, онкологических, хирургических, гинекологических, урологических и пр. [1].
Микробиологические исследования позволяют определить присутствие в организме возбудителей инфекционных заболеваний, а также выявить уровень их чувствительности к антибактериальным препаратам.
Предметом исследования клинической микробиологии являетсяусловно-патогеннаямикрофлора, которая симбиотическивзаимодействует с человеком. Макро-микробиологическое сосуществование чаще всего взаимовыгодно, но иногда эти микробы становятся болезнетворными. К ним относятся стафилококки, стрептококки, некоторые нейссерии, эшерихии, клебсиеллы, протей, энтеробактеры, цитобактеры, псевдомонады, бактероиды, грибы.
Материал для микробиологического исследования разнообразен, им являются кровь, моча, ликвор, грудное молоко, гной, мокрота, кал, желчь, сперма, плевральная жидкость, отделяемое слизистых и ран, соскоб, пунктат, смыв, аспират, операционный материал, биоптат, трупный материал, катетеры, а также образцы воздуха, воды и т.д. Огромное количество видов исследуемых образцов определяет сложность подхода к преаналитическому этапу в бактериологии.
Анализ – это комплексная процедура, состоящая из большого количества этапов и зависящая от многих факторов, обеспечивающих ее выполнение. За последние несколько десятилетий показано, что пре- и постаналитические этапы аналитического процесса в целом более подвержены ошибкам, чем аналитический этап. Большая часть ошибок выявлена на пре-преаналитическом и пост-постаналитическом этапах за пределами лаборатории. Только аналитическая фаза контролируется лабораторией, а преаналитический и постаналитический этапы относятся к сфере действия других ответственных сторон, таких как врачи, медсестры, пациенты и прочие лица, вовлеченные в идентификацию пациента, ввод данных, сбор и транспортировку образцов [2].
Бактериологическое исследование предъявляет жесткие требования к качеству исходного материала, а также срокам его транспортировки и хранения. Именно по этой причине, биоматериал, который сдает пациент, максимально оперативно должен попасть на изучение в лабораторию, что гарантирует получение достоверного и актуального для назначения эффективного лечения результата. Погрешности в правилах сбора материала для микробиологического исследования приводят к ошибкам в диагностике возбудителя.
Чаще всего забор биоматериала выполняется врачом, но иногда эти процедуры проводятся пациентом самостоятельно. Сотрудники лаборатории должны проводить обучение персонала клиник по сбору материала, обращению с пробами, маркировке, транспортировке. Для тех проб, которые пациент собирает сам (к примеру, моча, кал), должны быть разработаны памятки для пациентов.
Для получения достоверных результатов микробиологических исследований необходимо четкое выполнение всех этапов исследования:
1. Назначение анализа строго по клиническим показаниям. Если врач подозревает у пациента инфекционный процесс, вызванный простейшими, вирусами, то не следует назначать бактериологическое исследование.
2. Проведение исследования и сбора материала до начала лечения антибиотиками, антисептиками, противогрибковыми препаратами. Когда забор исследуемого материала проводиться не в первые дни заболевания, а уже на фоне этиотропной терапии, возбудитель может быть не выделен из-за угнетения его жизнеспособности или гибели под действием проводимого лечения.
3. Выбор материала для микробиологического исследования должен быть клинически обоснован. Врач должен иметь предварительный клинический диагноз, понимать, что он хочет получить из лаборатории. Материал для бактериологического исследования берут непосредственно из тех мест, где на данной стадии заболевания наиболее вероятно присутствие возбудителей или исследуют клинически значимый биологический материал.
4. Отбор и доставку проб проводят с учетом специфики работы с конкретным биологическим субстратом, что снижает вероятность контаминации сапрофитной флорой и обеспечивает сохранение потенциальных патогенов. В большинстве случаев материал отбирают стерильными инструментами в стерильный контейнер и доставляют в лабораторию в термоконтейнере.
Жидкий биологический материал можно транспортировать непосредственно в шприце, на кончик которого надет стерильный колпачок. Для исследования на анаэробы биологический материал необходимо помещать в анаэробные условия. Для крови, образцов из стерильных полостей, ликвора используют специальные флаконы с жидкой питательной средой, заполненные газовой смесью определенного состава, куда из шприца уколом иглы через резиновую крышку вносят материал.
Должны быть правильно составлены сопроводительные документы. Они разрабатываются лабораторией в соответствии с нормативно-правовыми актами, принятыми в Республике Казахстан. В направлении указывают наименование, источник и метод получения биологического материала, дату и время его взятия; ФИО, пол и возраст больного; название учреждения, отделения, номер палаты; предполагаемый диагноз инфекционной патологии и предшествующую антибактериальную терапию; фамилию и подпись врача, направившего материал для проведения бактериологического исследования. Обязательная маркировка пробирок, контейнеров, флаконов и транспортных сред с указанием Ф.И.О., даты рождения, даты и времени взятия материала и локализации, откуда получен образец. Информация на бланке и материале должна совпадать.
5. Соблюдение сроков и режима хранения биологических проб, полученных для исследований. Нативный материал доставляют в лабораторию в максимально короткие сроки (для большинства образцов не позднее 1,5-2 ч после их получения). Допускается хранение материала в холодильнике при 4° С (это не относится биологическому материалу, полученному из стерильных в норме локусов: ликвору, крови, внутрисуставной и плевральной жидкости).
Если посев может быть выполнен не ранее чем через 48 ч или при доставке проб в отдаленные лаборатории рекомендуют использовать транспортные среды. В настоящее время существует множество модификаций тупферов, представляющих собой пробирку с транспортной питательной средой (Амиеса, Кэри-Блэйра, Стюарта, тиогликолевой средой) и стерильный тампон для забора материала.
При транспортировке материал следует оберегать от действия света, тепла, холода, механических повреждений, чтобы исключить гибель микроорганизмов и контаминацию материала посторонней микрофлорой [3].
6. Перед проведением микробиологического исследования в лаборатории проводят бракераж проб, включающий оценку качества заполнения сопроводительных документов, визуальный контроль, а в ряде случаев – микроскопию нативного материала. При нарушении правил по отбору и доставке, а также при несоответствии критериям пригодности проба исследованию не подлежит. Анализ рекомендуют повторить, соблюдая правила взятия и доставки материала. Информацию передают телефонограммой лечащему врачу, делают соответствующую запись в бракеражном журнале и направлении. Если повторная проба не может быть получена, материал берут в работу, но при выписке результата отмечают нарушения, которые могут влиять на качество выполнения анализа.
7. Интерпретацию результатов проводят с учетом этиологической значимости при данной патологии выделенных патогенов и их количественной характеристики. Лабораторное исследование является одним из многих объективных методов, и пользоваться им следует рационально. Неправильная оценка данных лабораторного исследования может привести к диагностическим ошибкам. Индикация условно-патогенных микроорганизмов из патологического материала не всегда является доказательством их этиологической роли в генезе заболевания. Получение отрицательного результата — еще не основание для исключения предполагаемого диагноза. Отрицательный результат может быть следствием неправильного забора материала, несвоевременной доставки его в лабораторию, несовершенной методики бактериологического исследования.
Поэтому при постановке диагноза заболеваний, вызванных условно-патогенными возбудителями, надо исходить из 4 критериев: многократности обнаружения данных видов, массивности их роста в посевах на плотные питательные среды, антигенной и фаговаровой однородности выделяемых субкультур и диагностического нарастания титров гомологичных антител при серологических исследованиях.
8. При выделении этиологически значимых микроорганизмов из стерильных жидкостей (кровь, ликвор и др.), раневого отделяемого требуется экстренная передача результатов лечащему врачу.
2. Плебани М. Выявление и предотвращение ошибок в лабораторной медицине. - Annals of Clinical Biochemistry. - 2010. - № 47. – С. 101-110.
3. Практическое руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях. - Всемирная Организация Здравоохранения, Женева, 2004 г. – 201 с.
Т?йіндеме: Б?л ма?ала зерттеуді? адекватты сапалы н?тижесін алу ?шін ж?не материалды жинау ережесін білу ?шін д?рігер- клиницисттерді? білімін ке?ейту. Клиникалы? ж?не лабороториялы? профильдегі д?рігерлерді? бірігіп ж?мыс істеуі нау?асты емдеудегі с?тті та?дауы.
Summary: The article is aimed at expanding the knowledge of clinicians about the rules of collection of samples and rationale to follow them to obtain an adequate quality of research results. Teamwork of doctors of clinical and laboratory specializations will lead to a successful choice of therapy in a patient.
Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования
Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.Файлы: 1 файл
Бактериологический метод исследования микробиото.docx
Бактериологический метод исследования
Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования
Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.
В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18— 24 часов
При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.
Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.
При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий — элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально- диагностические среды.
Например, при бактериологической диагностике кишечных инфекций — среду Эндо, для выделения дифтерийной палочки используют теллуритовые среды, и т. д. При выделении условно-патогенных микроорганизмов при бактериологическом методе посев взятого материала осуществляют на универсальные питательные среды. Примером такой среды может служить кровяной агар.
Все манипуляции, которые связанны с выделением бактериальных культур, проводятся над пламенем горелки.
При бактериологическом методе посев материала на питательные среды производят либо стеклянным или металлическим шпателем, либо бактериальной петлей таким образом, чтобы находящиеся в исследуемом материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В результате такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок среды.
При выделении из патологического материала чистой культуры возбудителя, который существенно загрязнен посторонней микрофлорой, часто пользуются биологическим методом выделения чистой культуры. Делают это следующим образом: заражают исследуемым материалом чувствительных к возбудителю лабораторных животных. Еще один пример биологического метода — при исследовании больного на содержание в мокроте пневмококков, материал внутрибрюшинно вводят белым мышам. Из их крови через 4-6 часов получают чистую культуру пневмококка.
В том случае, если в результате бактериологического метода исследования предполагается в исследуемом материале содержание малого количества возбудителя, посев производят на жидкую питательную среду для его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной среды на плотные среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем среду помещают в термостат обычно при определенной температуре, что важно для бактериологического метода.
На втором этапе бактериологического метода исследования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.
Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет, характер краев и поверхности, структуру, консистенцию. Далее для приготовления мазков используют часть каждой из намеченных колоний. Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и проверяя одновременно ее чистоту.
Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для данного вида средой, например, скошенным агаром, с целью накопления чистой культуры для более полного ее изучения. Пробирки перемещают на 18–24 часа в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных исследований, нередко подсчитывают количество выросших колоний.
Это имеет особенное значение при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. При таких заболеваниях судить о ведущей роли какого-либо возбудителя допустимо лишь по его содержанию в патологическом материале в достаточно большом количестве и преобладанию этого возбудителя над другой флорой.
Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные разведения взятого исследуемого материала, из которых на чашки с питательной средой производят высев, подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение, из чего определяют содержание микроорганизмов в материале.
Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам — третий этап бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным свойствам.
Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий. Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения биохимических свойств.
Ферментативные, или биохимические, свойства бактерий обусловлены ферментами, которые участвуют в расщеплении белков, углеводов, вызывающими восстановление и окисление различных субстратов.
Причем каждый из видов бактерий производит постоянный для него набор ферментов. Чаще всего при изучении антигенных свойств используют реакцию агглютинации на стекле.
С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in vitro определяют токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и другие факторы вирулентности. Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или вид возбудителя.
В том числе для обнаружения источника инфекции, с целью выявления эпидемической цепочки заболевания, осуществляют внутривидовую идентификацию бактерий. Суть внутривидовой идентификации бактерий заключается в определении фаговара или фаготипа, изучении различных свойств выделенных антигенных бактерий. Процесс определения фаготипа называют фаготипирование. Фаготипирование осуществляют при брюшном тифе, стафилококковой инфекции, паратифе В.
На чашку с питательной средой, которая засеяна с помощью шпателя выделенной чистой культурой, наносят различные диагностические фаги по капле. В случае, если культура чувствительна к данному фагу, в результате бактериологического исследования наблюдаются так называемые негативные колонии (бляшки), которые выглядят как образования округлой формы участков разрушенных бактерий. Культура возбудителя может быть чувствительна к нескольким или одному фагам.
В связи с широким распространением лекарственно-устойчивых форм бактерий, для назначения рациональной химиотерапии необходимо определение антибиотикограммы — устойчивости или чувствительности к химиотерапевтическим препаратам выделенной чистой культуры возбудителя. Для антибиотикограммы используют либо метод бумажных дисков, либо наиболее точный, но громоздкий метод серийных разведений.
Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений химический препарат — антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и эпидемиологическим целям.
Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции материала.
В настоящее время в современном мире существуют ускоренные методы определения вида и рода бактерий. Так, в России применяют систему индикаторных бумажек — СИБ, позволяющую через 6-12 часов и без использования большого числа питательных сред выделить чистую бактериальную культуру. Также широко используют иммунофлюоресцентный метод для экспресс-диагностики инфекционных болезней
Бактериологическое исследование — исследование, предназначенное для выделениябактерий и изучения их свойств с целью постановки микробиологического диагноза.
Исследуемый материал следует брать в асептических условиях в стерильную посуду и доставлять в лабораторию возможно скорее. В случае необходимости пробы следует хранить на холоде. Методика взятия проб зависит от объекта, характера заболевания и свойств микроорганизма. Одним из распространенных приемов бактериологического исследования является бактериоскопия.
Для изучения нефиксированных бактерий пользуются двумя методами: раздавленной (между предметным и покровным стеклами) капли и висячей капли. Следует помнить, что препараты нефиксированных бактерий заразны.
Для бактериоскопии фиксированных препаратов используют мазки. Для их приготовления каплю исследуемой жидкости распределяют по поверхности предметного стекла, а затем высушивают. Наиболее распространенным методом фиксации препарата является пронесение его через пламя газовой горелки. В некоторых случаях используют фиксирующие составы. Фиксированные препараты, как правило, окрашивают (см. Окраска микроорганизмов). К числу важнейших элементов бактериологического исследования относятся посевы и пересевыбактериальных культур, производимые бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. Петлю стерилизуют прокаливанием в пламени, затем ее остужают прикосновением к участку незасеянного агара или ополаскивая в стерильной жидкости. При использовании пастеровской пипетки ее кончик обламывают пинцетом, несколько раз проносят пипетку через пламя горелки и дают остыть. При посевах используют жидкие и твердые питательные среды. При посеве на скошенный агар культуру бактерий растирают петлей по поверхности агара. При посеве в толщу агарового или желатинового столбика питательную среду прокалывают до дна пробирки петлей или особой иглой. При посеве в жидкую среду надо следить, чтобы жидкость не выливалась и не смачивала края пробирок и пробки. Посевы и пересевы следует проводить вблизи пламени газовой горелки, пробирки не должны долго оставаться открытыми, петля или пастеровская пипетка с культурой не должна ни к чему прикасаться; перед тем как закрывать пробирку, края ее следует прожечь. Засеянные пробирки необходимо тотчас же надписать.
Важнейшим этапом бактериологического исследования является идентификация — определение видовой или типовой принадлежности бактерий, полученных в виде чистой культуры. При идентификации бактерий производится изучение их физиологических и биохимических свойств, токсинообразования. Широко используют серологические методы идентификации бактерий (реакции агглютинации ипреципи тации). Во многих случаях эффективным оказывается биологический метод идентификации микроорганизмов, основанный на заражении лабораторных животных исследуемым материалом или полученной культурой бактерий и выявлении у животных характерных патологических изменений.
Для выделения чистых культур используют механические и биологические методы. Пример механического метода: каплю исследуемого материала растирают одним и тем же стерильным шпателем или бактериальной петлей по поверхности плотной питательной среды, последовательно в первой, второй и третьей чашках Петри. Выделение чистой культуры производится из выросших отдельных колоний и заключается в их исследовании и отсеве на свежую питательную среду. Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете того или иного свойства выделяемого микроба, отличающего его от других микробов, находящихся в исследуемом материале.
При биологическом методе используют такого рода питательные среды, в которых созданы условия, благоприятные для развития определенного вида микробов. К числу биологических методов относится также заражение лабораторных животных, чувствительных к выделяемому виду бактерий.
Выращивание бактерий производят в термостатах, в которых поддерживается постоянная температура, обычно 37°. В большинстве случаев выращивание продолжают около суток, но в зависимости от вида бактерий бывают необходимы и другие сроки выращивания. Разные виды бактерий нуждаются при выращивании в разных количествах кислорода. Для поддержания необходимой концентрации кислорода в среде пользуются разнообразными методами аэрации. См. такжеПитательные среды.Бактериологическое исследование — комплекс методов для выявления патогенных микроорганизмов у больного, у носителя или на объектах внешней среды. Бактериологические исследования пользуются также для обнаружения условно патогенных и санитарно-показательных микробов, характеризующих степень загрязнения внешней среды, для изучения микробного пейзажа определенной среды (объекта). Бактериологическое исследование может быть использовано для диагностики, профилактики инфекционных заболеваний, для сан.-гиг. характеристики среды, окружающей человека, для научного исследования.
Материал и метод бактериологического исследования зависят от цели анализа, условий среды, патогенеза и течения заболевания. При наличии бактериемии микроб обнаруживают при помощи посева крови. В случаях выраженных местных поражений возбудителя следует искать в отделяемом или выделениях пораженного органа (дифтерия, дизентерия, гонорея и др.). Наконец, при заболеваниях со сложным течением, когда (как, например, при брюшном тифе) бактериемия сменяется поражениями тонких кишок, на каждом этапе применяют соответствующий метод исследования: в течение первой недели заболевания производят посев крови, на второй наиболее достоверно серологическое исследование, начиная с третьей недели положительный результат получают при посеве испражнений; последним методом пользуются и в качестве контрольного исследования для обнаружения бактерионосителей среди реконвалесцентов и для наблюдения за ними.
Выполнение любой из указанных задач осуществляют применением методов, предназначенных для выделения и определения микроорганизмов. В зависимости от
характеристики микроба используют весь комплекс методов или его части.
Бактериоскопия — наиболее достунный прием, основанный на микроскопическом изучении материала. При микроскопии свежих препаратов можно пользоваться некоторыми микрохимическими реакциями (например, окраска йодофильных бактерий раствором Люголя) или избирательной окраской разных структурных частей бактерий.
Более четко бактерии можно выявить в окрашенном препарате. Исследуемый материал наносят на предметное стекло тонким и по возможности ровным слоем. Дают препарату высохнуть на воздухе и фиксируют одним из общепринятых методов, но чаще всего фламбированием, т. е. двух-, трехкратным быстрым проведением препарата над пламенем горелки так, чтобы стекло было теплое, но не горячее. Препарат, остуженный после фиксации, окрашивают простой или дифференциальной окраской (см. Окраска микроорганизмов). При флюоресцентной микроскопии используют как нативные, так и сухие препараты. В этом случае обработка определенными красителями вызывает свечение структур микробного тела или всего микроба в ультрафиолетовых или коротких синих лучах. В другой модификации микробов обрабатывают специфическими сыворотками, меченными флюоресцентами (красителями). Бактерии, соответствующие сыворотке, будут светиться, так как на них осядет меченая сыворотка. Гетерологичные бактерии не будут светиться.Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.
Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.
- бактериологические;
- серологические;
- метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.
У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.
Бактериологические методы исследования
Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.
Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.
Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.
Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.
- микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
- выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
- идентификацию бактерий;
- определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.
Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.
Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале, а также дают предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.
Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.
Микроскопия мазков, окрашенных по Граму
1 - стрептококки; 2 - стафилококки; 3 - диплобактерии Фридленда; 4 - пневмококки
Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.
Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.
Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов, имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.
Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 10 5 , свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.
Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.
Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.
Серологические методы исследования
В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.
2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.
Серологические исследования не обладают 100%-й чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.
В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.
Авидность - характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген.
Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях.
Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.
Метод полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать.
Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы.
Введение в реакцию дополнительного этапа - синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы - позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР - это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.
В ПЦР может быть использован различный биологический материал - сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.
Читайте также: