Иммунологические методы анализа реферат

Обновлено: 02.07.2024

* Данная работа не является научным трудом, не является выпускной квалификационной работой и представляет собой результат обработки, структурирования и форматирования собранной информации, предназначенной для использования в качестве источника материала при самостоятельной подготовки учебных работ.

Критерии оценки методов иммунодиагностики

1. Иммуноферментный анализ

3. Генное зондирование

6. Критерии положительных и отрицательных реакций

Список используемой литературы

Любой лабораторный анализ в медицине основан на понимании любого заболевания как реакции целого организма. Патологическое изменение функции какого-либо органа, ткани, группы клеток вызывает отклонение от нормальных показателей в работе других органов, тканей, систем. Наряду с неспецифическим, т. е. свойственным для многих видов патологии проявлением таких сдвигов, в большинстве случаев наблюдаются особые, характерные лишь для данного заболевания изменения внутренней среды организма. При инфекционных заболеваниях - это, прежде всего, появление во внутренней среде организма возбудителя или его продуктов (токсины, антигены и т.д.) и иммунный ответ на возбудитель.

Иммунодиагностику инфекционных заболеваний разделяют на две части:

1) определение изменения функциональной активности различных компонентов иммунной системы, характерных для здорового организма: изменение количества лимфоцитов различных популяций, их соотношения, активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов, концентрации иммуноглобулинов и т.п.

2) специфическое распознавание маркеров возбудителя и реагирующих с ним комплементарных структур (прежде всего антител) на основе их взаимодействия с микробными антигенами.

Специфическое распознавание в более широком смысле возможно не только с помощью антител, но также и других комплементарных структур, реагирующих с микробными продуктами - различными рецепторами клеточной поверхности, лектинами, участками молекул нуклеиновых кислот и т. п. В той или иной мере эти подходы нашли технологическое осуществление в различных методах. Однако лишь методы анализа на основе реакции с участками нуклеиновых кислот нашли достаточно широкое применение в клинической практике (генное зондирование) и будут описаны более подробно. Оценка состояния иммунной системы при инфекционном процессе может включать в себя следующие методы: определение количества и соотношений Т- и В-клеток, субпопуляций лимфоцитов в периферической крови, активности лимфоцитов в реакции бласттрансформации, определение активности макрофагального звена (хемотаксис, подвижность, фагоцитоз), определение концентрации иммуноглобулинов М, G , А и Е, соотношения концентраций изотипов IgG , определение концентрации лимфокинов, монокинов, интерферонов, состояния местного иммунитета (лизоцим, секреторный Ig А) и общих неспецифических гуморальных факторов (система, комплемента, пропердин, трансферрин, церулоплазмин), концентрации тимических гормонов и др.Находят применение и методы комплексной оценки реактогенности иммунной системы по, так называемым, реакциям немедленного типа и реакции гиперчувствительности замедленного типа (кожные пробы при бактериальных инфекциях и микозах, туберкулиновая проба). Весьма перепективна оценка субпопуляционного состава лимфоцитов по специфическим поверхностным маркерам, особенно при использовании иммунофлуоресцентных методов автоматической сортировки клеток. Все перечисленные выше методы позволяют оценить динамику изменений состояний иммунной системы при инфекционном процессе, а при провокационных тестах - выявить специфическую реактивность иммунного ответа. Применение такого рода диагностических процедур демонстрирует индивидуальную реакцию иммунной системы пациента на течение инфекционного процесса, позволяет оценить эффективность применяемых методов лечения и прогнозировать исход заболевания. Однако лишь в некоторых случаях эти методы позволяют определить вид инфекционного агента. Изменение соотношения популяций и субпопуляций лимфоцитов происходит при различных видах инфекционных заболеваний, особенно при хроническом течении инфекции. Так же часто изменяется концентрация неспецифических гуморальных компонентов иммунной системы. Известно, что при некоторых паразитарных заболеваниях резко повышен уровень Ig Е в крови. При острых воспалительных процессах, вызываемых бактериями, растет концентрация С-реактивного белка в крови, тогда как при сходных клинических формах вирусной инфекции такие изменения не наблюдаются. Провокационные методы могут выявить сенсибилизацию к какому-либо инфекционному агенту, однако это может быть результатом изменения общей реактивности организма. Иммунодефицитное состояние, вызванное инфекцией, т.е. синдром вторичного иммунодефицита, является широко распространенным явлением. С другой стороны, при инфекции, вызываемой ретровирусами ВИЧ-1, ВИЧ-2, Н TLV -1, НТ LV -2 наблюдаются самые разнообразные структурные изменения иммунной системы, сопровождающиеся множественными ассоциированными инфекционными заболеваниями протозойной, бактериальной и вирусной природы.

Наиболее значимыми для специфической диагностики инфекционного процесса стали методы иммунохимического анализа ( immunoassay ) для определения антигенов и антител.

Условно методы иммунохимического анализа можно разделить на четыре большие группы.

К первой группе относятся прямые (непосредственные) методы определения реакции антиген-антитело. Образующийся при этом комплекс антиген-антитело идентифицируется визуально, либо с помощью простых оптических устройств. К таким методам относятся преципитация в растворе (в том числе - реакции турбодиметрии и нефелометрии), в геле, на полимерной пленке,

агглютинация бактериальных клеток, простейших, прямая реакция агглютинации эритроцитов антителами, вирусами.

Ко второй группе относятся реакции пассивной агглютинации, т.е. агглютинации частиц, с поверхностью которых связаны антигены или антитела. Такие препараты и получили название диагностикум. К этим методам относятся реакции пассивной гемагглютинации (РНГА) и непрямой геммагглютинации (РНГА), латексагглютинации, коагглютинации, агглютинации частиц бентонита, желатиновых капсул, частиц сефарозы и др.

К третьей группе относятся индикаторные методы, основанные на использовании различного рода меток для выявления реакции антиген-антитело. Наиболее распространены иммуноферментный, иммунофлюоресцентный, радиоиммунологический анализ.

В четвертую группу можно выделить одно из, бурно развивающихся направлений лабораторного анализа - иммуносенсоры.

Все перечисленные методы применяются не только при диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний человека, но и в ветеринарии, растениеводстве, для контроля загрязнения окружающей среды и т. п.

1. Иммуноферментный анализ

Основной отличительной чертой иммуноферментного анализа (ИФА) является то, что в качестве индикаторной молекулы, которая позволяет следить за иммунным комплексом, используется молекула фермента. В связи с тем, что фермент обладает уникальным свойством модифицировать не одну, как в обычных химических реакциях, а большое число молекул субстрата, т. е. обладает своего рода усиливающим свойством, чувствительность иммуноферментных методик может быть очень высока. В некоторых случаях, как показывают многочисленные сравнительные исследования, она выше чувствительности иммунофлуоресцентных и радиоиммунологических методов.

удобно выявлять иммунный комплекс, используя способность фермента расщеплять субстрат, который при ферментативной модификации изменяет свой цвет. В этом случае для выявления комплекса антиген - антитело обычно используют спектрофотометрию;

- иммунный комплекс можно выявлять с помощью иммуноферментного анализа, как в растворе, так и при адсорбции (или ковалентной иммобилизации) на твердом носителе. Различают два принципиально различных типа ИФА - гомогенный и гетерогенный (твердофазный) иммуноферментный анализ.

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) - наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом, и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА, занимает минуты, и даже доли минут).

Необходимо отметить, что в своей физико-химической основе твердофазный ИФА очень сходен с твердофазным РИА. Отличие касается лишь индикаторных молекул - в ТФИФА это фермент, в твердофазном РИА это радиоактивные изотопы. Остальные же принципы анализа полностью совпадают - в обоих методах используется твердая матрица, на которой адсорбируется иммунный комплекс, и идентичный способ удаления из системы не вошедших в комплекс компонентов диагностикума.

В настоящее время уже опубликованы обзоры, подробно анализирующие схемы проведения диагностических исследований с использованием метода твердофазного ИФА.

Конкретные методики диагностики и серодиагностики заболеваний бактериальной и вирусной природы, использующие иммуноферментные подходы, отличаются многими параметрами, в частности, типом и формой адсорбента, на котором иммобилизуется иммунный комплекс. В качестве твердофазного носителя может использоваться целый ряд полимеров: полиметилметакрилат, нейлон, тефлон, полипропилен и др. Однако наиболее часто в качестве адсорбента в настоящее время применяется полистирол и поливинилхлорид. Для удобства проведения анализа эти адсорбенты производятся в виде многолуночных плашек, шариков или палочек. Использование плашек, изготовленных из оптически прозрачного полистирола или поливинилхлорида, позволяет проводить все операции ТФИФА, включая конечное фотометрирование хромофорной субстратной смеси. Не менее существенным преимуществом полистироловых плашек перед другими формами адсорбента является возможность автоматизации практически всех операций анализа, включая трудоемкие этапы промывки лунок и внесения в них однотипных реагентов.

Следует отметить, что использование полистироловых плашек для целей ТФИФА имеет и некоторые недостатки - высокие требования к чистоте полимерного материала и точности изготовления плашек и нерентабельность их использования для одиночных анализов.

Большое внимание при постановке ТФИФА обычно уделяется правильному выбору фермент-субстратной системы. В современных диагностических иммуноферментных тест-системах используется большое число разнообразных ферментов и субстратов. Выбор той или иной фермент-субстратной пары для использования в конкретной тест-системе на основе ТФИФА диктуется несколькими соображениями. Во-первых, обращается внимание на стабильность в процессе анализа и хранения как крайне чувствительного к структурным внутримолекулярным перестройкам конъюгата, так и во многих случаях светочувствительного хромофорного или флуорохромного субстрата. Во-вторых, это отсутствие используемого в диагностикуме фермента или субстрата (свободного или связанного) в биологических или клинических образцах, которые предстоит анализировать. В-третьих, наличие соответствующей регистрирующей аппаратуры (спектрофотометра или спектрофлуориметра). И, наконец, в-четвертых, выбор той или иной фермент-субстратной пары диктуется естественным желанием экспериментатора или клинициста иметь в руках систему, обладающую максимальной специфичностью и чувствительностью.

Фермент-субстратные системы, наиболее часто используемые в твердофазном ИФА

Основные проявления взаимодействия антиген — антитело. Иммунологический анализ антигенов и антител с помощью меченых реагентов. Сущность активности комплемента. Методы определения эффекторных клеток. Трансгенные животные и направленная доставка генов.

Рубрика	Медицина
Вид	реферат
Язык	русский
Дата добавления	28.09.2009
Размер файла	20,3 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Иммунологические методы

В иммунологии применяется целый ряд экспериментальных методов из других областей биологии. Так, выделение антигенов и антител производят с помощью биохимических методов фракционирования белков, гены иммунологически важных молекул секвенируют обычными молекулярно-генетическими методами. Вместе с тем в иммунологии разработаны и свои специальные методы исследования, основанные на взаимодействии антиген--антитело. Эти иммунологические методы в свою очередь нашли применение в различных областях биологии. В частности, любые молекулы, обладающие антигенными свойствами, можно выявлять в тканях иммуногистохимическими методами. Для количественного определения таких молекул, присутствующих в чрезвычайно низких концентрациях, применяют радиоиммуноанализ и ферментный иммуносорбентный анализ. В настоящее время существуют сотни разнообразных иммунологических методов: наиболее широко применяемые из них описаны в этой работе.

Реакция преципитации. Одним из первых описанных проявлений взаимодействия антиген--антитело было образование преципитата при смешивании обоих реагентов в эквивалентных или близких к эквивалентным количествах. Оно наблюдается при постановке классической реакции преципитации с растворимыми антигенами и антителами. Если проводить эту реакцию в агаровом геле, можно дифференцировать отдельные реакции антиген--антитело, обусловленные различными популяциями антител, присутствующими в сыворотке. Такой метод, названный методом двойной иммунодиффузии, применяется также для проверки сходства между различными антигенами.

Однако некоторые смеси антигенов слишком сложны для разделения просто путем диффузии и преципитации, и для анализа таких смесей был разработан метод иммуноэлектрофореза -- прежде чем выявлять антигены визуально в реакции преципитации, их разделяют по заряду с помощью этого метода.

Методы, основанные на диффузии в геле, позволяют определять антигены и антитела лишь качественно, количественную же оценку реагирующих компонентов проводят разработанным позднее методом простой радиальной иммунодиффузии.

Иммунодиффузию в электрическом поле можно производить с одновременным встречным движением антигенов и антител; этот способ назван встречным электрофорезом. Аналогичная модификация простой радиальной иммунодиффузии получила название ракетный электрофорез.

Описанные методы используются для определения антигенов и антител в концентрации от 20 м кг/мл до 2 мг/мл.

Реакции гемагглютинации и связывания комплемента

Если антитела присутствуют в столь низких концентрациях, что их не удается обнаружить и количественно определить при помощи встречного и ракетного электрофореза, применяют реакцию гемагглютинации. Она основана на способности антител перекрестно связываться с эритроцитами, взаимодействуя с их поверхностными антигенами.

Реакция антиген--антитело ведет к образованию иммунных комплексов, которые связывают комплемент при его активации по классическому пути, и на этом основан один из количественных методов определения антигенов и антител. С помощью реакций гемагглютинации и связывания комплемента удается выявлять антитела, присутствующие в концентрации

Так, выделение антигенов и антител производят с помощью биохимических методов фракционирования белков, гены иммунологически важных молекул секвенируют обычными молекулярно-генетическими методами. Вместе с тем в иммунологии разработаны и свои специальные методы исследования, основанные на взаимодействии антиген—антитело. Эти иммунологические методы в свою очередь нашли применение в различных областях биологии. В частности, любые молекулы, обладающие антигенными свойствами, можно выявлять в тканях иммуногистохимическими методами.

Файлы: 1 файл

Иммунологические методы.doc

В иммунологии применяется целый ряд экспериментальных методов из других областей биологии. Так, выделение антигенов и антител производят с помощью биохимических методов фракционирования белков, гены иммунологически важных молекул секвенируют обычными молекулярно-генетическими методами. Вместе с тем в иммунологии разработаны и свои специальные методы исследования, основанные на взаимодействии антиген—антитело. Эти иммунологические методы в свою очередь нашли применение в различных областях биологии. В частности, любые молекулы, обладающие антигенными свойствами, можно выявлять в тканях иммуногистохимическими методами. Для количественного определения таких молекул, присутствующих в чрезвычайно низких концентрациях, применяют радиоиммуноанализ и ферментный иммуносорбентный анализ. В настоящее время существуют сотни разнообразных иммунологических методов: наиболее широко применяемые из них описаны в этой работе.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН- АНТИТЕЛО

Реакция преципитации. Одним из первых описанных проявлений взаимодействия антиген—антитело было образование преципитата при смешивании обоих реагентов в эквивалентных или близких к эквивалентным количествах. Оно наблюдается при постановке классической реакции преципитации с растворимыми антигенами и антителами. Если проводить эту реакцию в агаровом геле, можно дифференцировать отдельные реакции антиген—антитело, обусловленные различными популяциями антител, присутствующими в сыворотке. Такой метод, названный методом двойной иммунодиффузии, применяется также для проверки сходства между различными антигенами.

Однако некоторые смеси антигенов слишком сложны для разделения просто путем диффузии и преципитации, и для анализа таких смесей был разработан метод иммуноэлектрофореза — прежде чем выявлять антигены визуально в реакции преципитации, их разделяют по заряду с помощью этого метода.

Описанные методы используются для определения антигенов и антител в концентрации от 20 м кг/мл до 2 мг/мл.

Реакции гемагглютинации и связывания комплемента

Иммуноблоттинг и иммунопреципитация

Описанные выше методы обычно применяют для определения уровня конкретных известных антигенов и антител, однако часто необходимо идентифицировать и охарактеризовать не известные заранее антигены, содержащиеся в многокомпонентной смеси. Для этой цели особенно подходит иммуноблоттинг.

При проведении иммуноблоттинга сложную смесь антигенов вначале подвергают гель-электрофорезу, а затем фракционированные пептиды переносят на лист нитроцеллюлозы для идентификации индивидуальных антигенов при помощи специфических антисывороток. Производя предварительное разделение в геле с додецилсульфатом натрия или в геле для изо-электрического фокусирования можно получить данные о размерах и изоэлектрической точке исследуемых антигенов, а также о сходстве между ними.

В некоторых случаях в результате электрофореза в геле и процедуры блоттинга антиген денатурирует так, что некоторые из его эпитопов разрушаются и теряют способность связываться со специфическими антителами. В такой ситуации вместо блоттинга следует использовать иммунопреципитацию, чтобы установить, какой антиген связывают антитела. Данный метод может быть применен для определения как растворимых, так и мембранных антигенов.

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ АНТИТЕЛ

В иммунологических исследованиях часто возникает необходимость в получении очищенных препаратов антител, т. е. антигенспецифичных либо неспецифичных иммуноглобулинов. Выделение неспецифичных иммуноглобулинов из сыворотки обычно проводят путем последовательного фракционирования белков, которое включает следующие этапы.

• Осаждение гамма-глобулинов в 30—50% растворе сульфата аммония.

• Гель-фильтрация для получения молекул соответствующих размер ов.

• Ионообменная хроматография с целью выделения молекул, несущих суммарный положительный заряд при нейтральном рН.

• Аффинная хроматография с использованием естественных лигандов иммуноглобулинов, например стафилококкового белка А.

Получение моноклональных антител

Другим способом получения индивидуальных антител определенной специфичности служит гибридомная технология — создание иммортали-зованной линии клеток, продуцирующих антитела только одной специфичности, т. е. моноклональные. В такой культуре можно поддерживать антителообразование неопределенно долгое время. Моноклональные антитела несравнимо лучше соответствуют целям иммуноанализа, чем гетерогенные сыворотки, получаемые от иммунных животных, и поэтому нашли широкое применение в различных областях биологии в качестве высокоспецифичных зондов.

Эффективно продуцировать моноклональные антитела могут любые В-клетки, необходимо лишь сделать их для этого бессмертными и пролиферирующими. Чаще всего для этой цели получают гибридные клетки — путем слияния мышиных спленоцитов с миеломными В-клетками от мышей той же линии, не секретирующими собственных антител. Возможно также получить межлинейные или межвидовые гибриды, однако они часто нестабильны. Другой метод иммортализации — это трансформация клеток, например в случае В-клеток человека путем инфицирования вирусом Эпштейна—Барр.

Разработан также новый метод получения антител, основанный на использовании бактериофагов. С помощью этого интересного метода удается получить экспрессию на поверхности нитевидного бактериофага М13 вариабельных областей в виде фрагментов антител, связывающих антиген с определенной специфичностью и авидностью. Располагая библиотекой таких экспрессируемых бактериофагом фрагментов, можно производить отбор фаговых частиц, продуцирующих тот или иной Fv-фрагмент. Кроме того, если данным бактериофагом инфицировать соответствующие бактерии, они начинают выделять Fv-белок в большом количестве в культуральную среду. Такой подход не требует обязательной иммунизации животных или человека.

Моноклональные антитела представляют собой четко определенный реагент, но они не обладают более высокой специфичностью по сравнению с поликлональной антисывороткой, распознающей антиген в результате взаимодействия иммуноглобулинов с его различными эпитопами.

Наиболее простой способ измерения активности комплемента состоит в определении концентрации сыворотки, вызывающей гемолиз 50% клеток в стандартном препарате эритроцитов, сенсибилизированных антигеном. Реакцию проводят в пробирках или на микропланшетах. Для приблизительной оценки активности комплемента более удобен простой радиальный гемолиз. Этот метод сходен с простой радиальной им-мунодиффузией, за исключением того что в лунки вносят исследуемую сыворотку, а гель содержит ЭСА. Вокруг лунки, содержащей активный комплемент, образуется зона гемолиза, величина которой пропорциональна количеству комплемента в исследуемой сыворотке. Данный метод позволяет определять общую активность компонентов классического и литического путей активации, однако если в сыворотке обнаружен дефицит комплемента, этим методом невозможно установить, отсутствием какого компонента дефицит обусловлен.

Существуют также методы для определения различных отдельных компонентов комплемента по их содержанию или функциональной активности. Это важное различие, так как компонент может присутствовать в нормальном количестве, но быть функционально неактивным. Содержание индивидуальных белков комплемента обычно определяют при помощи радиоиммуноанализа или ферментного иммуносорбентного анализа, используя антитела, специфичные к данному белку. Для измерения функциональной активности в суспензию сенсибилизированных эритроцитов вносят все компоненты комплемента, необходимые для лизиса, за исключением исследуемого белка.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

Для проведения многих иммунологических исследований in vivo и in vitro требуются те или иные популяции лимфоцитов. Их получают от экспериментальных животных, в основном из тимуса, селезенки и периферических лимфоузлов. Некоторые специальные исследования требуют выделения клеток из других участков организма, например из пейеровых бляшек. Рециркулирующие клетки можно получить путем канюлирования грудного лимфатического протока и сбора клеток в течение нескольких часов. У человека наиболее легко выделить лимфоциты периферической крови, а хирургическим путем можно получить также клетки селезенки, миндалин и лимфоузлов. Однако хирургически отобранный материал часто содержит инфекционные агенты или опухолевые клетки, в зависимости от заболевания, которое вызвало необходимость хирургического вмешательства. Следует иметь в виду, что клеточные популяции, содержащиеся в перечисленных тканях, совершенно различны как по степени зрелости лимфоцитов, так и по численному соотношению в них клеток разных типов.

Тимус является источником довольно чистой Т-клеточной популяции, однако составляющие ее лимфоциты различаются по степени зрелости. При работе с лимфоцитами из других органов и тканей часто возникает необходимость в выделении отдельных субпопуляций для анализа их особых функций. Применение с этой целью описанного выше проточного флуоресцентного клеточного сортера, позволяющего разделять лимфоциты по их поверхностным маркерам, позволяет получать лишь ограниченное число клеток, поскольку скорость цитометрии с сортировкой весьма низка. Существует, однако, и ряд методов, позволяющих выделять лимфоциты и их отдельные субпопуляции сразу из всего объема исследуемого образца, — центрифугирование в градиенте плотности, розеткообразование, пэннинг и магнитное разделение.

Выделение в градиенте плотности основано на том, что лимфоциты имеют меньшую плотность, чем эритроциты и гранулоциты. Этот способ позволяет выделять большую часть лимфоцитов крови. Розеткообразование и пэннинг используют для выделения субпопуляций. Пэннинг представляет собой разновидность аффинной хроматографии применительно к лимфоцитам. На сходном принципе основан и способ разделения с помощью магнитных гранул, покрытых специфическими антителами. При смешивании с клетками гранулы связывают те из них, которые распознаются фиксированными антителами. Эти клетки можно затем смыть с гранул или выделить путем наложения магнитного поля.

Другой способ — он применяется для удаления ненужной клеточной популяции, — основан на использовании антител и комплемента. Если к смеси клеток добавить специфические антитела, а затем комплемент, клетки соответствующей субпопуляции будут лизированы. Конечно, для этого метода пригодны лишь такие антитела, которые связывают комплемент; кроме того, клетки-мишени должны нести на поверхности достаточное количество молекул антигена, чтобы фиксировать литическую дозу комплемента.

Серологические реакции различаются по способности выявлять отдельные классы антител. Реакция агглютинации, например, хорошо выявляет lgM-антитела, но менее чувствительна для определения lgG-антител. Реакции связывания комплемента и гемолиза, которые требуют участия комплемента, не выявляют антитела, не присоединяющие комплемент, например lgA-антитела и lgE-антитела. В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против антигенных детерминант поверхности вириона, связанных с патогенностью. Чувствительность иммунулогических методов превосходит все другие методы исследования антигенов и антител, в частности радиоиммунный и иммуноферментный анализы позволяют улавливать присутствие белка в количествах, измеряемых в нанограммах и даже в пикограммах.

С помощью предложенного способа определяют группу и проверяют безопасность крови (гепатит В и ВИЧ-инфекция). При трансплантации тканей и органов, иммунологический метод позволяет определять совместимость тканей и тестировать методы подавления несовместимости. В судебной медицине используют реакцию Кастеллани для определения видовой специфичности белка и реакцию агглютинации для определения группы крови.

Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Этиологию заболевания устанавливают также на основании прироста антител к возбудителю в сыворотке крови реконвалесцента по сравнению с пробой, взятой в первые дни болезни. На основе исследования изучают иммунитет населения по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

Развитию иммунологических методов способствовало создание моноклональных антител, продуцируемых гибридомой, полученной в результате слияния иммунокомпетентной клетки В-лимфоцита и клетки миеломы мышей. Моноклональные антитела несут только одну химически однородную популяцию антител, комплементарную специфической детерминанте антигена, что позволяет осуществлять тонкую дифференциацию белков. Развитие иммунологического метода исследования идет как по линии совершенствования реагентов (чистоты антигенов и антител), так и по линии создания автоматизированных систем постановки реакций и их инструментального учета.

Виды реакций метода иммунологического исследования.

В зависимости от их механизма и учета результатов, иммунологический метод исследования можно подразделить на 5 видов реакции.

1.Реакции, основанные на феномене агглютинации.

Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек — носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену.

Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t 37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа.

Реакции агглютинации для определения группы крови и резус-фактора основаны на взаимодействии аллоантител (изоантител) и антигенов эритроцитов. Антитела против резус-фактора являются неполными, они не способны к прямой реакции с резус-положительными эритроцитами, поэтому для их обнаружения используют реакцию Кумбса, основанную на выявлении неполных антител с помощью антиглобулиновых сывороток. К эритроцитам известной специфичности добавляют исследуемую сыворотку крови, а вслед за этим антиглобулиновую сыворотку против lgG (непрямая реакция Кумбса). Fab-фрагменты неполных антител исследуемой сыворотки крови присоединяются к эритроцитам, а к свободным Fc-фрагментам этих антител присоединяются антитела против lgG, и происходит агглютинация эритроцитов.

Реакция пассивной или непрямой гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами, называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.

Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на феномене предотвращения (торможения) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами, например, для серодиагностики клещевого энцефалита, в лунки панели разливают двукратные разведения сыворотки больного на щелочном боратном буферном растворе. Затем добавляют определенное количество, обычно 8 АЕ (агглютинирующих единиц), антигена клещевого энцефалита и после 18 ч экспозиции при t 4° вносят взвесь гусиных эритроцитов, приготовленную на кислом фосфатно-буферном растворе. Если в сыворотке крови больного есть антитела к вирусу клещевого энцефалита, то антиген нейтрализуется и агглютинация эритроцитов не происходит.

2.Реакции, основанные на феномене преципитации.

Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез), которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии, в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы — полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген-антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.

Для постановки двойной иммунодиффузии наливают слой растопленного геля на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают лунки диаметром 1,5–3 мм. В расположенные по кругу лунки помещают исследуемые антигены, а в центральную лунку — иммунную сыворотку известной специфичности. Диффундируя навстречу друг другу, гомологичные сыворотки и антигены образуют преципитат.

При радиальной иммунодиффузии (по методу Манчини), иммунную сыворотку вносят в агар. Антиген, помещенный в лунки, диффундирует через агар, и в результате преципитации с иммунной сывороткой, вокруг лунок образуются непрозрачные кольца, внешний диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод используют для определения классов иммуноглобулинов, а модификации метода можно применять для определения противомикробных антител, относящихся к различным классам иммуноглобулинов.

Иммуноэлектрофорез основан на усилении миграции в геле антигенов и антител путем помещения пластины геля с реагентами в электрическое поле. При этом достигается разделение антигенов и антител на компоненты в соответствии с их подвижностью и зарядом.

Разновидностью иммуноэлектрофореза является радиоиммунофорез. В этом случае после электрофоретического разделения антигенов в канавку, вырезанную параллельно движению антигенов в геле, наливают сначала меченную радиоактивным йодом иммунную сыворотку против определяемых антигенов, а затем иммунную сыворотку против lgG-антител, которая преципитирует образовавшиеся комплексы антитела с антигеном. Все несвязавшиеся реагенты вымывают, а комплекс антиген-антитело обнаруживает методом авторадиографии.

3.Реакции с участием комплемента.

В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки, основанную на способности субкомпонента комплемента Clq и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам.

Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген-антитело. Эта реакция состоит из двух фаз: взаимодействия антигена с испытуемой сывороткой крови (исследуемая система) и взаимодействия гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (индикаторная система). При положительной реакции в исследуемой системе происходит связывание комплемента, и тогда при добавлении сенсибилизированных антителами эритроцитов, гемолиза не наблюдается. Реакцию применяют для серодиагностики сифилиса (реакция Вассермана), вирусных и бактериальных инфекций.

Реакция радиального гемолиза эритроцитов может протекать в геле. Взвесь эритроцитов барана помещают в агарозный гель с комплементом; в застывшем на стекле слое делают лунки и вносят в них гемолитическую сыворотку. Вокруг лунок в результате радиальной диффузии антител образуется зона гемолиза, радиус которой прямо пропорционален титру сыворотки. Если сорбировать на эритроцитах какой-либо антиген, например гликопротеиновый гемагглютинин вируса гриппа, краснухи или клещевого энцефалита, то можно воспроизвести феномен гемолиза иммунными сыворотками к этим вирусам. Реакцию радиального гемолиза в геле применяют в диагностике вирусных инфекций. Она характеризуется простотой постановки, нечувствительностью к сывороточным ингибиторам, позволяет титровать сыворотки крови по диаметру зоны гемолиза, не прибегая к серийным разведениям.

Иммунное прилипание. Эритроциты, тромбоциты и другие клетки крови имеют на поверхности рецепторы к третьему компоненту комплемента (СЗ). Если к антигену (бактериям, вирусам и др.) добавить соответствующую иммунную сыворотку и комплемент, то образуется комплекс антиген-антитело, покрытый СЗ-компонентом комплемента. Эту реакцию применяют при изучении ряда вирусных инфекций (клещевого энцефалита, денге), которые сопровождаются иммунопатологическими процессами и циркуляцией в крови вирусных антигенов в комплексе с антителами.

4.Реакция нейтрализации.

Основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. В бактериологии эту реакцию используют для обнаружения антистрептолизинов, антистрептокиназы и антистафилолизинов. Реакцию нейтрализации токсинов можно оценивать по биологическому эффекту, так, например, титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки. Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, не вызывает их гибели. Различные варианты реакции нейтрализации применяют в вирусологии. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры, патогенность вирусов нейтрализуется и при этом животные не заболевают, а клетки культур не подвергаются деструкции.

5.Реакции с использованием химических и физических меток (ИФА).

Иммунофлюоресценция заключается в использовании меченых флюорохромом антител, точнее, иммуноглобулиновой фракции антител lgG. Меченое флюорохромом антитело образует с антигеном комплекс антиген-антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в УФ-лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках. Так, для диагностики бешенства, отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате, в цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки ярко-зеленого цвета. На обнаружении антигенов вирусов в клетках отпечатков со слизистой оболочки носа основана экспресс-диагностика гриппа, парагриппа и аденовирусной инфекции.

Более широко применяют метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью люминесцирующей иммунной сыворотки против lgG-антител и используемой для обнаружения не только антигенов, но и титрования антител. Метод нашел применение в серодиагностике герпеса, цитомегалии, лихорадки Ласса. Препараты с наслоенной исследуемой сывороткой крови помещают в термостат при t 37° для образования иммунных комплексов, а затем, после отмывания несвязавшихся реагентов, выявляют эти комплексы меченой люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека. Применяя меченые иммунные сыворотки против lgM- или lgG-антител, можно дифференцировать тип антител и обнаруживать ранний иммунный ответ по наличию lgM-антител.

Иммунофлюоресценцию широко используют не только в бактериологии, вирусологии, паразитологии, но и в иммунопатологии для обнаружения антител к тканевым антигенам человека.

Иммуноферментные или энзим-иммунологические методы основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Чтобы обнаружить соединение меченых антител с антигеном, добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к lgG ферментом, с окрашиванием в желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфатаза) цвет. Используют также ферменты, разлагающие не только хромогенный, но и люмогенный субстрат. В этом случае при положительной реакции появляется свечение. Подобно иммунофлюоресценции, иммуноферментный метод применяют для обнаружения антигенов в клетках или титрования антител на антигенсодержащих клетках.

Наиболее популярной разновидностью иммуноферментного метода является иммуносорбция. На твердом носителе, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют антиген. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. В лунки с сорбированным антигеном вносят исследуемую сыворотку крови, затем меченую ферментом антисыворотку и субстрат. Положительные результаты учитывают по изменению цвета жидкой среды. Для обнаружения антигенов, на носитель сорбируют антитела, затем вносят в лунки исследуемый материал и проявляют реакцию меченой ферментом антимикробной сывороткой. Повышению чувствительности иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов способствует введение в систему реакции авидина и биотина.

Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов. Первоначально он был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. Тест-системой являлись меченый радионуклидом гормон (антиген) и антисыворотка к нему. Если к такой антисыворотке добавить материал, содержащий искомый гормон, то он свяжет часть антител, при последующем внесении меченого титрованного гормона с антителами свяжется уменьшенное по сравнению с контролем его количество. Результат оценивают по сопоставлению кривых связанной и несвязанной радиоактивной метки. Эта разновидность метода носит название конкурентной реакции. Существуют и другие модификации радиоиммунологического метода.

Иммуногистологические методы предназначены для определения антигенов на поверхности или внутри клетки, например для обнаружения маркеров лимфоцитов и иммунокомплексов при гломерулонефритах и других заболеваниях почек. В этой реакции для выявления антигенов пользуются или иммунофлюоресценцией, или иммуноферментными конъюгатами с пероксидазой. Количество специфических антигенов определяют по интенсивности окрашивания. Иногда используют автоматическую регистрацию с помощью спектрофотометра.

В современное время широко используют методы, основанные на взаимодействии антиген – антитело. К данным методам относятся методы иммунодиффузии, нефелометрии, иммунодот и иммуноспот. Они широко используются для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными. Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных.

В слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для антигена и антисыворотки и заполняют их соответствующими растворами. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в полях геля и становятся видимыми как линии преципитации.

1.2. Проведение иммунодиффузии

Расплавляют агар (1,5 г) на водяной бане в 100 мл одного из предлагаемых растворителей (0,15 М раствор NaCl, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1). Горячий агарозный гель разливают по 3 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально.

Чтобы усилить сцепление геля с поверхностью стекла, предметные стекла рекомендуется покрыть агаровой пленкой. Для этого на стекло наносят 1%-ный водный агаровый золь и высушивают при 70°С.

В зависимости от задачи иммунохимического анализа для вырезания лунок в геля применяют либо специальные штампы разного профиля, либо инъекционные иглы, металлические или стеклянные трубочки с разными краями. Лунки для антигенов и антисыворотки располагают на расстоянии не менее 4 и не более 10 мм.

Заполнив лунки соответствующими растворами, пластинки помещают во влажную камеру. Иммунодиффузию можно проводить при 4, 20 и 37°С. Она длится не менее 24ч и может продолжаться до 6-7 дней. Образование новых линий преципитации следует наблюдать ежедневно. Продолжительность иммунодиффузии зависит от конкретной задачи исследования и от ряда других факторов. Результаты иммунодиффузии учитывают непосредственно на влажном препарате или сначала удаляют непреципитировавшие белки. Для этого препараты 2-3 раза погружают на 12 ч в ванночку с 0,15 М раствором NaCl, затем поверхность геля накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде, и высушивают при комнатной температуре. Высушенные препараты окрашивают, например амидо-черным 10В, и учитывают результаты иммунодиффузии.

1.3. Оценка результатов

Число линий преципитации

У разных антигенов часто бывают сходные коэффициенты диффузии. Поэтому в многокомпонентных системах антиген-антитело в одном и том же участке геля могут появиться преципитаты разной специфичности, образующие одну линию преципитации. В других случаях концентрации антигенов и антител и их соотношения могут оказаться настолько неблагоприятными, что заметной преципитации просто не произойдет. Поэтому число видимых линий преципитации обычно меньше числа систем антиген-антитело и лишь в лучшем случае равно ему.

Расположение преципитатов между лунками

При оптимальном соотношении между антигеном и антителом линия преципитации располагается почти посередине между лунками. Количественное преобладание одного из реагентов сдвигает линию преципитации к лунки другого реагента. Относительная концентрация реагентов в месте первоначальной преципитации может изменится, например из-за дополнительного поступления одного из них; тогда происходит сдвиг фронта преципитации, но часть иммунных агрегатов, особенно на стороне избытка антител остается в прежнем положении, и их можно обнаружить в виде вуали или отдельной зоны преципитации. Возможность подобных явлений заставляет при длительной иммунодиффузии ежедневно просматривать препараты.

Взаимное расположение линий преципитации: сравнительный анализ

Для выявления полной или частичной идентичности в геле обычно вырезают три лунки, расположенные треугольником. В две из низ помещают сравниваемые растворы антигенов, а в третью – антисыворотку.

Если линии полностью сливаются, то антигены полностью идентичны. Если линии пересекаются, то антигены не идентичны. Если одна из линий длиннее другой, и выходя из нее образует шпору, то антигены частично идентичны. Оба антигена имеют некоторые общие детерминанты, но у одного антигена имеются детерминанты, которых нет у второго, именно они образуют шпору. Если две линии преципитации пересекаются, частично сливаясь, антигены имеют как одинаковые, так и различные детерминанты.

1.4. Определение титра

Готовят последовательные двукратные разведения изучаемого антигена и равные объемы каждого разведения вносят в лунки, расположенные по периферии той лунки, в которой антисыворотка (стандартный объем). При оценке результатов иммунодиффузии учитывают:

1. расстояние, отделяющее линию преципитации от центральной и периферических лунок;

2. последнее разведение антигена, которое еще дает видимый преципитат;

3. интенсивность и ширину полос преципитации.

Последнее разведение антигена, дающее преципитат, считают его титром. Подобным образом можно титровать содержание антител в антисыворотке.

1.5. Область применения

Качественный анализ, например для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными.

Метод обладает высокой специфичностью, при количественных вариантах иммунодиффузии ошибка метода составляет 3-7%.

2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену

2.1. Принцип

Гель, содержащий антисыворотку, помещают в стеклянные трубки или пробирки. Трубки вертикально погружают в раствор антигена, и в пробирках раствор антигена наслаивают на гель. Антигены диффундируют в гель со скоростью, пропорциональной их концентрации, и, соединившись со специфическими антителами, образуют с ними беловато-мутные преципитаты. Число линий преципитации зависит от числа реагирующих систем антиген-антитело. Чем продолжительнее диффузия, тем дальше фронт преципитации каждой линии удаляется от границы, разделяющей гель и жидкость. Расстояние, которое он проходит за определенное время при строго постоянной концентрации антисыворотки в геле, зависит только от концентрации диффундирующего антигена. При постоянных условия опыта (температура, серия антисыворотки и ее концентрация в геле, концентрация самого геля) с помощью простой линейной иммунодиффузии можно определять количество антигена.

2.2. Проведение иммунодиффузии

Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки, стандартные растворы антигенов и рабочий стандарт, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1. Специальный агар Noble; стеклянные капилляры для определения гематокрита длиной около 50 мм, с внутренним диаметром 1-1,5 мм; измерительная лупа с точностью до 0,1 мм.

В стеклянные капилляры насасывают и выдувают обратно 1%-ный горячий золь агара на воде. Затем капилляры высушивают при 70°С. Образовавшаяся агаровая пленка усиливает сцепление геля со стеклом и препятствует образованию щелей, в которые мог бы проникнуть антиген.

В 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендируют 2 г сухого агара и нагревают на водяной бане до расплавления. Агар охлаждают до 48°С и смешивают с равным объемом подогретой до 48°С антисыворотки. В эту смесь погружают капилляры, с тем чтобы она заполнила их на 2-3 см. Когда гель затвердеет, капилляры готовы к употреблению.

Капилляры погружают в растворы антигенов, но перед погружением капилляров в антиген следует довести температуру всех реагентов до нужной величины, например до 4°С. Реакция длится 48 ч. Затем измеряют расстояние, которое прошел фронт преципитации в каждом капилляре.

Для того, чтобы антиген мог диффундировать в гель, содержащий антитела, он должен быть в избытке. Скорость миграции преципитата К можно вычислить, разделив расстояние h, на квадратный корень из времени диффузии t.

При постоянном времени диффузии между логарифмом концентрации антигена и расстоянием, которое проходит фронт преципитации, существует прямая линейная зависимость. Наклон калибровочной кривой прямо пропорционален квадрату коэффициента диффузии антигена и обратно пропорционален концентрации антител в геле и вязкости геля.

Критическим фактором является температура. Продолжительность инкубации зависит от величины диффундирующих молекул, чаще всего длится 12, 24 или 48 часов.

На ровную поверхность равномерным слоем наносят гель, содержащий антитела. В геле вырезают лунки и заполняют их раствором антигена. Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации.

Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки; стандартные растворы антигенов; рабочий стандарт; веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1; агар; рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, кюветы для элюции из комплекта для электрофореза; измерительный инструмент с точностью до 0,1 мм; микрошприц.

Нагревают 1,5 г агара до полного расплавления в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяной бане и, охладив до 48°С, смешивают в нужной пропорции с антисывороткой, подогретой до той же температуры. Смесь разливают по 2 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально. Золь должен равномерно распределиться по поверхности стекла. Чтобы усилить сцепление геля со стеклом, рекомендуется предварительно покрыть стекло тонкой агаровой пленкой.

В пластинке геля вырезают лунки, рассчитанные на 2 мкл антигенного раствора каждая. После внесения антигена пластинки геля помещают во влажную камеру и проводят иммунодиффузию при комнатной температуре. Кольца преципитации можно измерять прямо на влажной пластинке. Если преципитаты видны недостаточно четко, то сначала элюируют непреципитировавшие белки в двух сменах 0,15 М раствора NaCl по 12 ч, затем гель высушивают и окрашивают красителями, например амидо-черным, и высушивают вновь.

Площадь, занимаемая преципитатом к концу диффузии, прямо пропорциональна исходной концентрации антигена в лунке. Для построения калибровочной кривой берут либо площадь преципитата как функцию концентрации антигена, либо логарифм диаметра преципитата как функцию логарифма концентрации антигена:

где S – площадь преципитата, включая S₀ , S₀ – площадь стартовой лунки и Q_A _Г -- количество антигена.

Наклон К полученной прямой обратно пропорционален концентрации антител в геле. Уменьшив содержание антисыворотки в агаре, можно увеличить К. В результате возрастет диаметр преципитата, что повысит чувствительность и экономность метода. Оптимальная концентрация антисыворотки в геле зависит прежде всего от титра антител.

Результаты иммунодиффузии существенно не зависят от температуры. Опыт может быть поставлен при 4, 20 или 37°С. Следует избегать только резких (более 5°) колебаний температуры.

Необходимая продолжительность иммунодиффузии зависит от природы изучаемого антигена. Первый ориентировочный замер преципитатов можно сделать уже через 24 ч.

В пределах своей чувствительности радиальная иммунодиффузия пригодна для количественного определения любого антигена, если имеются соответствующие моноспецифические антисыворотки и чистые или стандартные антигены, чтобы построить калибровочную кривую для данной системы.

При помощи этого метода чаще определяют белковые антигены, например белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, секретов желез. Радиальная иммунодиффузия пригодна также для сравнительного качественного и количественного анализа иммунохимически близких белков.

Раствор антигена смешивают с соответствующей моноспецифической антисывороткой и смесь инкубируют. При этом образуются иммунные агрегаты, способные рассеивать проходящий свет. Интенсивность рассеивания или поглощения проходящего света прямо пропорциональна количеству комплексов антиген-антитело, и ее можно измерять фотометрически.

Если объемы реагентов, разведение антисыворотки, время и температура инкубации постоянны и единственной переменной величиной является концентрация антигена, то последнюю можно определить по кривой экстинкции. Чтобы построить такую кривую, с антисывороткой инкубируют растворы антигена возрастающей концентрации. Сначала с увеличением концентрации антигена кривая экстинкции идет вверх, затем, после некоторого максимума, снижается. При постоянном количестве антител подъем концентрации антигена увеличивает не только количество, но и величину иммунных агрегатов. При оптимальном соотношении антигена и антител количество и размер иммунных агрегатов достигает максимума. Область оптимальных соотношений называют зоной эквивалентности. Дальнейший подъем концентрации антигена ведет к уменьшению агрегатов.

Реагенты и приборы

Забуференный фосфатами раствор NaCl. 11,9 г Na₂ HPO₄ ·2H₂ O растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl; 9,1 г KH₂ PO₄ растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl. Получается буфер с pH 7,5.

Стандартные растворы. Используются стандартные сыворотки с известным содержанием белков или стандартные растворы, приготовленные из чистых белков.

Рабочий стандарт, если требуется определить содержание различных белков в сыворотке или сывороточных белков в других жидкостях организма.

Стандартные растворы, исследуемые образцы и антисыворотки разводят забуференным раствором NaCl с pH 7,5. Определение антигенов производят с кроличьими антисыворотками в разведении 1:5-1:20. Для построения кривой экстинкции сначала готовят серию разведений антигена от 0,5 до 10 мг на 100 мл. К последним разведениям стандартной сыворотки или раствора чистого белка прибавляют равный объем разбавленной антисыворотки, перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20°С) на 2 ч. После этого определяют экстинкцию растворов в проходящем свете при 450 нм в микрокювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (буфер + антисыворотка). С исследуемым образцом поступают так же, как со стандартными растворами. Определяют его экстинкцию и по восходящей части кривой устанавливают концентрацию антигена. Если приходится исследовать мутные или окрашенные растворы антигенов, следует предварительно измерить их собственную экстинкцию, чтобы учесть ее при оценке результатов. Затем с учетом разведения исходного материала вычисляют концентрацию исследуемого антигена.

Полную уверенность в том, что полученная величина экстинкции соответствует области избытка антител, дает исследование, проведенное с несколькими разведениями антигена. Условия инкубации должны быть строго постоянными. Для фотометрии следует выбирать длину волны, лежащую за пределами областей поглощения гемоглобина (400 – 420 нм). Необходимо также учитывать спектр собственного поглощения реагентов и их смеси до образования иммунных агрегатов.

Преимущества нефелометрии – относительная простота и быстрота процедуры, а также возможность ее автоматизации. Однако этот метод предъявляет особые требования к качеству антисыворотки. Она должна содержать достаточно антител, чтобы в разведении антител не менее 1:5 обеспечить величину максимальной экстинкции выше 0,2. Антисыворотка должна быть прозрачной.

5. Иммунодот и иммуноспот

Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных. Однако этот метод имеет ряд недостатков. В модифицированном варианте для адсорбции различных антигенов используют нитроцеллюлозные фильтры. Такую модификацию называют dot-ELISA (точечный твердофазный иммуноферментный анализ). В dot-ELISA минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку в виде серии точек. Преципитирующие хромогенные субстраты на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют цветные пятна. Фильтры с результатами анализа могут храниться в темноте в течение многих лет без потери окраски.

В dot-ELISA можно применять различные препараты антигенов. На нитроцеллюлозных мембранах можно сорбировать как жизнеспособные или фиксированные формалином простейшие, так и супернатанты, полученные после разрушения клеток.

Пятно антигена наносят в объеме от 0,1 до 3 мкл. В случае препаратов солюбизированных антигенов предпочтительнее использовать мембраны с малым диаметром пор. При применении целых клеток величина пор не играет большой роли.

Все стадии инкубации и промывки выполняют при комнатной температуре. Сначала диски с антигеном обрабатывают блокирующим раствором (3 – 5%-ный раствор очищенного бычьего сывороточного альбумина в солевом триэтаноламиновом буферном растворе). Можно успешно применять и цельную лошадиную сыворотку или 1%-ный раствор нормальной сыворотки кролика в фосфатном буферном растворе с NaCl. При обнаружении антител 50 мкл сыворотки в 1%-ном растворе БСА-СТБ инкубируют на диске. Антитела специфически связываются с антигеном, сорбированном на диске. Затем диски трижды промывают в растворе детергента (0,05%-ный раствор нонидета Р-40 в СТБ, 0,05%-ный раствор твина-20 в солевом растворе трис- НCl). После промывки диски инкубируют с 50 мкл конъюгата аффинно очищенных антивидовых антител с ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза).

После отмывки несвязавшегося материала добавляют преципитирующий хромогенный субстрат. При окислении субстрата ферментом в присутствии пероксида водорода образуется четкое пятно.

При определении антигенов пробы наносят непосредственно на подложку, затем проводят иммунологическую реакцию или со специфическими антителами и конъюгатом вторичных антител с ферментом и хромогенным субстратом, или с конъюгатом специфических антител с ферментом-маркером и субстратом.

В двухсайтовом dot-ELISA при определении антигенов сначала на подложку наносят специфические антитела. Антигены в пробе связываются с антителами. Потом добавляют меченые специфические антитела против другого эпитопа антигена и проводят реакцию с преципитирующим субстратом. Для таких методик характерна высокая специфичность.

Важным преимуществом метода dot-ELISA является возможность его применения для самых разнообразных медицинских целей. Все модификации dot-ELISA отличаются экономичным расходом реагентов, не требуют приборов с электропитанием для регистрации результатов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. Новые методы иммуноанализа. – М.: Мир, 1991. – С.116.

2. Иммунологические методы. Под ред. Х.Фримеля. – М.:Мир, 1979. – С. 31 – 55.

Читайте также: