Гибридизация нуклеиновых кислот реферат

Обновлено: 04.07.2024

Гибридизация нуклеиновых кислот, как и ПЦР, позволяет идентифицировать возбудителя в пробе без предварительного выделения. Для проведения анализа синтезируют одноцепочечный ДНК- или РНК-зонд, комплементарный специфическим нуклеотидным последовательностям возбудителя. Зонд метят радионуклидом, ферментом или другой легко распознаваемой меткой. Исследуемый материал подвергают обработке с целью лизиса микроорганизмов, находящихся в биопробе, выделения и денатурации ДНК. Далее проводят инкубацию зонда с исследуемым образцом и измерение количества меченой ДНК, вступившей в гибридизацию с ДНК, находящейся в исследуемой пробе. Реакция может происходить как на твердофазных сорбентах, так и в растворе, однако обязательным условием является отмывка несвязавшихся количеств меченого зонда. Чувствительность метода гибридизации нуклеиновых кислот уступает таковой ПЦР и составляет 10 3 микробных клеток в пробе.

Делись добром ;)

Похожие главы из других работ:

4.3. Секвестранты желчных кислот

Секвестранты (или сорбенты) желчных кислот (СЖК) холестирамин и колестипол применяются для лечения ГЛП более 30 лет и представляют собой анионообменные смолы (полимеры), не растворимые в воде и не всасывающиеся в кишечнике.

6. Препараты, способствующие синтезу нуклеиновых кислот

Это средства, содержащие нуклеотиды, участвующие в образовании рибо- и дезоксирибонуклеиновых кислот (РНК и ДНК), способствующие таким образом синтезу новых белков хрусталика. К препаратам данной группы относятся глазные капли Витасик.

5. Ингибиторы транскрипции и синтеза нуклеиновых кислот.

Тормозят ДНК-зависимую РНК-полимеразу, что приводит к торможению синтеза любых видов бактериальной РНК (актидин), сшивание цепей ДНК, что вызывает невозможность её расплетания (рубомицин), ингибирование ферментов.

1.1.4 Образование пенилловой и пенициленовой кислот, их использование в анализе

Под действием кислот пенициллины инактивируются с образованием пенилловой (при рН 2,0) и пеницилленовой (при рН 5,0) кислот. В обоих случаях на 1-м этапе расщепляется в-лактамный цикл с образованием пенициллоиновой кислоты.

Молекулярная гибридизация имеет большое преимущество перед остальными системами идентификации, и прежде всего в тех случаях, когда по разным причинам изменено внешнее проявление диагностического признака, так как в генетическом материале очень редко происходят столь большие изменения, которые бы привели к ложноотрицательному результату.

Есть и другие доводы в пользу гибридизации:

с помощью зондов (зонд — определенный фрагмент ДНК, содержащего известный ген — генетический маркер) можно обнаружить микроорганизмы, которые трудно культивируются in vitro;
зонды позволяют отличить вирулентные штаммы от авирулентных in vitro;
быстрая идентификация микроорганизма непосредственно в биологическом материале от больных животных, пробах из окружающей среды и в фиксированных спиртом или формалином образцах после хранения;
нет необходимости направлять образцы для идентификации в специализированные лаборатории и институты;
высокая достоверность выявления единичных микробных клеток.

Принцип метода. Метод основан на специфическом взаимодействии (гибридизации) двух образцов ДНК: меченого ДНК-зонда и участка плазмидной или хромосомной ДНК (Г. Бантинг и др., 1990). Образовавшиеся двухцепочечные ДНК отделяют от одноцепочечных и определяют присутствие метки. В качестве контроля используют ДНК известного штамма микроорганизма. Степень реассоциации таких гомологичных одноцепочечных ДНК принимают условно за 100 %. При 60…100 % гомологии ДНК можно говорить о принадлежности сравниваемых бактерий к одному виду.

Проведение реакции. Разработаны два способа гибридизации: в растворе или с использованием нерастворимого носителя. Гибридизация на носителях применяется значительно шире: анализируемый образец связывается с нитроцеллюлозным или нейлоновым фильтром.

Для микробиологов больше подходит метод гибридизации in situ, позволяющий быстро проводить идентификацию бактерий. Сначала исследуемые бактерии подращивают на фильтре, либо переносят на фильтр с агара, либо наносят на фильтр небольшие количества бактериальной взвеси. Затем клетки лизируют, высвободившуюся ДНК фиксируют прогреванием. Следующий этап — проведение гибридизации на фильтре с внесенным меченым ДНК-зондом. После гибридизации фильтр несколько раз промывают специальными растворами и проводят детекцию метки.

Существует несколько разных методов мечения комплекса между зондом и ДНК-мишенью. Традиционным способом является радиоактивное мечение зонда с помощью введения в ДНК радиоактивных изотопов 33 Р, 32 Р, 35 S. После гибридизации образцы-мишени выявляют с помощью радиоавтографии. Этот метод обладает высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать около 1 пг ДНК. Недостаток радиоактивных зондов — их нестабильность из-за непродолжительного времени жизни изотопов ( 32 Р — 14,5 сут) и быстрого радиолиза зонда. Использование изотопов с более продолжительным периодом полураспада приводит к снижению чувствительности и удлиняет время, необходимое для радиоавтографии. Кроме того, для работы с изотопами необходимы специально оснащенные лаборатории.

Наиболее широко используют нерадиоактивное мечение. Для нерадиохимической детекции применяют методы, основанные на присоединении к зондам остатков биотина (G. Gebeyehu et al., 1987). Биотин (витамин Н), широко распространенный в природе и синтезируемый кишечными микроорганизмами, сам по себе меткой не является, но он обладает высоким сродством с авидином (стрептавидином). Авидин — глюкопротеид яичного белка, связывающий биотин с образованием нерастворимого комплекса биотин—авидин. Используя биотинилированный фермент и зонд, несущий один или несколько остатков биотина, можно осуществить ферментативную детекцию связанного с мишенью зонда. Авидин связывается с образовавшимся комплексом из двух гомологичных цепей ДНК и присоединяет биотинилированный фермент, который выявляют с помощью соответствующего окрашенного субстрата. Метод обладает более низкой чувствительностью, чем радиохимический. Повысить чувствительность можно, увеличив число остатков биотина, введенных в зонды.

Метод дот-гибридизации. В случаях, когда необходимо установить наличие или отсутствие в ДНК выявляемой последовательности, применяют метод дот-гибридизации. В этом случае очищенную денатурированную ДНК наносят непосредственно на фильтр, иммобилизуют, гибридизируют с зондом и регистрируют на автографах положительные сигналы.

В настоящее время используют зонды для обнаружения бактерий родов Salmonella, Campylobacter, Mycobacterium и др. Успешно разрабатываются зонды и для представителей рода Yersinia. Предложен зонд для идентификации вирулентных Yersinia enterocolitica (V. Е. Hill et al., 1983). В качестве зонда протестированы 8 перекрывающихся областей плазмиды вирулентности (pYV) Y. enterocolitica, а также inv- и ail-области хромосомы, ответственные за способность к инвазии Y. enterocolitica (R. М. Rohins-Browne et al., 1989). Зонды на основе mv-гена Y. enterocolitica гибридизовались со всеми видами и биотипами иерсиний (но не других бактерий). Зонды из ail-области Y. enterocolitica давали положительный сигнал исключительно с патогенными Y. enterocolitica.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Развитие генной инженерии. Создание рекомбинантных молекул. Введение в клетку хозяина. Выделение клеток, содержащих выделенный ген. Гибридизация нуклеиновых кислот. Количество плазмид в клетке. Метод использования бактериофага. Изменение фенотипа клетки.

Рубрика	Биология и естествознание
Вид	реферат
Язык	русский
Дата добавления	12.09.2013
Размер файла	348,3 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Подобные документы

Понятие и основные методы генной инженерии. Методика выделения ДНК на примере ДНК плазмид. Принципы действия системы рестрикции-модификации. Перенос и обнаружение клонируемых генов в клетках. Конструирование и введение в клетки рекомбинантных молекул ДНК.

реферат [22,1 K], добавлен 23.01.2010

Расщепление цепей ДНК эндонуклеазами рестрикции. Осуществление молекулярного клонирования ферментами ДНК-лигазы. Встраивание фрагмента ДНК в плазмидный вектор. Метод получения рекомбинантных плазмид. Основные этапы клонирования фрагментов чужеродной ДНК.

презентация [242,3 K], добавлен 24.01.2016

Исследование сущности и предназначения генной инженерии - метода биотехнологии, который занимается исследованиями по перестройке генотипов. Метод получения рекомбинантных, то есть содержащих чужеродный ген, плазмид - кольцевых двухцепочных молекул ДНК.

презентация [264,8 K], добавлен 19.02.2012

Понятие генетической инженерии, ее основные цели и задачи, порядок применения при получении рекомбинантных белков. Биологическая природа и типы плазмид, их разновидности и отличительные черты. признаки присутствия плазмид в бактериальной клетке.

реферат [20,1 K], добавлен 23.01.2010

Виды вставок при конструировании рекомбинантных молекул ДНК, лигирование вектора со вставкой. Инфекция, трансфекция и клонирование. Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул. Виды ДНК-библиотек, стратегии клонирования генов и кДНК.

Для учеников 1-11 классов и дошкольников
Бесплатные сертификаты учителям и участникам

Государственное бюджетное образовательное учреждение

средняя общеобразовательная школа №225 Адмиралтейского района Санкт-Петербурга

Шаповалова Валентина Александровна

Воронаев Иван Геннадьевич

Сегодня мы разберем тему нуклеиновые кислоты, так как она затрагивает жизненноважные процессы, происходящие в организме. В задачи данного реферата входит :

-пояснить, что такое нуклеиновые кислоты и какие их виды существуют;

-разобраться, чем отличаются виды нуклеиновых кислот;

-подробнее разобрать функции ДНК и РНК.

Что такое нуклеиновые кислоты?

Чем ДНК отличается от РНК?

Названия отличаются тем, что молекула ДНК содержит моносахарид дезоксирибозу, а РНК — рибозу.

Нуклеиновые кислоты ,подобно белкам, имеют первичную, вторичную и третичную структуру.

Чередование нуклеотидов в полимерной цепи образует первичную структуру нуклеиновой кислоты. Так, в состав РНК входят такие азотистые основания как: аденин (А), гуанин (Г), урацил (У), цитозин (Ц),а в состав ДНК входят: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), цитозин (Ц).

ДНК и РНК также отличаются вторичной структурой: молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепочек, спирально закрученных одна относительно другой, а РНК- из одной полинуклеотидной цепочки.

Две спирали в молекуле ДНК удерживаются вместе водородными связями между парами оснований. Двойная спираль ДНК строится по принципу комплиментарности: напротив аденинового нуклеотида одной цепи располагается тиминовый нуклеотид другой цепи, а против гуанинового- цитозиновый.

В РНК гуанин (Г) может образовывать водородные связи как с урацилом (У), так и с цитозином (Ц). Поэтому двухцепочечные участки РНК некомплементарны, и нуклеотидный состав РНК может меняться в широких пределах.

Вторичная структура ДНК (а); комплементарность между двумя цепями ДНК (б)

Третичная структура нуклеиновых кислот — это пространственное расположение ДНК и РНК. ДНК находится преимущественно в хромосомах клеточного ядра,а также митохондриях и хлоропластах.ДНК является основным строительным материалом генов, в которых хранится наследственная информация организма. РНК входит в состав ядрышек, митохондрий, рибосом, пластид, цитоплазмы. РНК выполняет различные функции, по причине того ,что существует в виде трех разновидностей: рибосомные РНК (рРНК), транспортные РНК (тРНК) и информационные ,или матричные РНК (иРНК).

3) Три разновидности РНК. Функции РНК.

1) Рибосомные РНК (рРНК).

Составляют 85% всей РНК клетки. Они определяют структуру и функционирование рибосом.

2) Транспортные РНК (тРНК).

Составляют примерно 10% от всех клеточных РНК. Они подносят аминокислоты к месту образования белковых молекул-рибосомам.

3) Информационные РНК (иРНК).

Не смотря на низкое процентное содержание в общей массе РНК клетки, всего 5%, они стоят на первом месте по значению. Они программируют синтез белков; осуществляют непосредственную передачу кода ДНК к месту синтеза белков.

4) Фукнции ДНК.

ДНК-главная молекула в живом организме. В ней хранится генетическая информация, передающаяся из поколения в поколение, но в синтезе белка ДНК не участвует.

В молекулах ДНК в закодированном виде записан состав всех белков организма. Каждая аминокислота, присутствующая в составе белка, имеет свой собственный код в ДНК-кодон.[2]

Читайте также: