Физико химические свойства днк реферат

Обновлено: 05.07.2024

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ – биологические полимерные молекулы, хранящие всю информацию об отдельном живом организме, определяющие его рост и развитие, а также наследственные признаки, передаваемые следующему поколению. Нуклеиновые кислоты есть ядрах клеток всех растительных и животных организмов, что определило их название (лат. nucleus – ядро).

Состав полимерной цепи нуклеиновых кислот.

Полимерная цепь нуклеиновых кислот собрана из фрагментов фосфорной кислоты Н₃РО₃ и фрагментов гетероциклических молекул, представляющих собой производные фурана. Есть лишь два вида нуклеиновых кислот, каждая построена на основе одного из двух типов таких гетероциклов – рибозы или дезоксирибозы (рис. 1).

Рис. 1. СТРОЕНИЕ РИБОЗЫ И ДЕЗОКСИРИБОЗЫ.

Название рибоза (от лат. Rib – ребро, скрепка) имеет окончание – оза, что указывает на принадлежность к классу сахаров (например, глюкоза, фруктоза). У второго соединения нет группы ОН (окси-группа), которая в рибозе отмечена красным цветом. В связи с этим втрое соединение называют дезоксирибозой, т.е., рибоза, лишенная окси-группы.

Структура ДНК.

Молекула ДНК служит отправной точкой в процессе роста и развития организма. На рис. 2 показано, как объединяются в полимерную цепь два типа чередующихся исходных соединений, показан не способ синтеза, а принципиальная схема сборки молекулы ДНК.

В окончательном варианте полимерная молекула ДНК содержит в боковом обрамлении азотсодержащие гетероциклы. В образовании ДНК участвуют четыре типа таких соединений, два из них представляют собой шестичленные циклы, а два – конденсированные циклы, где шестичленное кольцо спаяно с пятичленным (рис. 3).

Рис. 3. СТРОЕНИЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ, входящих в состав ДНК

На втором этапе сборки к свободным группам ОН дезоксирибозы присоединяются показанные выше азотсодержащие гетероциклические соединения, образуя у полимерной цепи боковые подвески (рис. 4).

Присоединенные к полимерной цепи молекулы аденина, тимина, гуанина и цитозина обозначают первыми буквами названий исходных соединений, то есть, А, Т, Г и Ц.

Сама полимерная цепь ДНК имеет определенную направленность – при мысленном продвижении вдоль молекулы в прямом и обратном направлении одни и те же группировки, входящие в состав цепи, встречаются на пути в разной последовательности. При движении в одном направлении от одного атома фосфора к другому вначале на пути следования идет группа СН₂, а затем две группы СН (атомы кислорода можно не принимать во внимание), при движении в противоположном направлении последовательность этих групп будет обратной (рис. 5).

Рис. 5. НАПРАВЛЕННОСТЬ ПОЛИМЕРНОЙ ЦЕПИ ДНК. При описании того, в каком порядке чередуются присоединенные гетероциклы, принято использовать прямое направление, то есть от группы СН₂ к группам СН.

На следующей стадии две молекулы ДНК объединяются, располагаясь таким образом, чтобы начало и концы цепей были направлены в противоположные стороны. В этом случае гетероциклы двух цепей обращены навстречу друг другу и оказываются расположенными неким оптимальным образом, имеется в виду, что между парами группировок С=О и NH₂ , а также между є N и NH=, входящими в состав гетероциклов, возникают водородные связи (см. ВОДОРОДНАЯ СВЯЗЬ). На рис. 6 показано, как располагаются две цепи относительно друг друга и как при этом возникают водородные связи между гетероциклами. Самая важная деталь – состоит в том, что пары, связанные водородными связями, жестко определены: фрагмент А всегда взаимодействует с Т, а фрагмент Г – всегда с Ц. Строго определенная геометрия этих групп приводит к тому, что эти пары исключительно точно подходят друг другу (как ключ к замку), пара А-Т связана двумя водородными связями, а пара Г-Ц – тремя связями.

Водородные связи заметно слабее обычных валентных связей, но из-за большого их количества вдоль всей полимерной молекулы соединение двух цепей становится достаточно прочным. В молекуле ДНК содержится десятки тысяч групп А, Т, Г и Ц и порядок их чередования в пределах одной полимерной молекулы может быть различным, например, на определенном участке цепи последовательность может иметь вид: -А-А-Т-Г-Ц-Г-А-Т-. Поскольку взаимодействующие группы строго определены, то на противолежащем участке второй полимерной молекулы обязательно будет последовательность –Т-Т-А-Ц-Г-Ц-Т-А-. Таким образом, зная порядок расположения гетероциклов в одной цепи, можно указать их размещение в другой цепи. Из этого соответствия следует, что суммарно в сдвоенной молекуле ДНК количество групп А равно количеству групп Т, а количество групп Г – количеству Ц (правило Э.Чаргаффа).

Две молекулы ДНК, связанные водородными связями, показаны на рис. 5 в виде двух плоско лежащих цепей, однако в действительности они располагаются иным образом. Истинное направление в пространстве всех связей, определяемое валентными углами и стягивающими водородными взаимодействиями, приводит к определенном изгибам полимерных цепей и повороту плоскости гетероциклов, что приблизительно показано в первом видеофрагменте рис. 7 с помощью структурной формулы. Гораздо точнее всю пространственную конструкцию можно передать только с помощью объемных моделей (рис. 7, второй видеофрагмент). При этом возникает сложная картина, поэтому принято использовать упрощенные изображения, которые особенно широко применяют при изображении структуры нуклеиновых кислот или белков. В случае нуклеиновых кислот полимерные цепи изображают в форме плоских лент, а гетероциклические группировки А, Т, Г и Ц – в виде боковых стержней или простых валентных штрихов, имеющих различные цвета, либо содержащих на конце буквенные обозначения соответствующих гетероциклов (рис. 7, третий видеофрагмент).

Во время поворота всей конструкции вокруг вертикальной оси (рис. 8) отчетливо видна спиральная форма двух полимерных молекул, которые как бы навиты на поверхность цилиндра, это широко известная двойная спираль ДНК.

При таком упрощенном изображении не исчезает основная информация – порядок чередования группировки А, Т, Г и Ц, определяющий индивидуальность каждого живого организма, вся информация записана четырехбуквенным кодом.

Строение полимерной цепи и обязательное присутствие четырех типов гетероциклов однотипно для всех представителей живого мира. У всех животных и высших растений количество пар А – Т всегда несколько больше, чем пар Г – Ц. Отличие ДНК млекопитающих от ДНК растений в том, что у млекопитающих пара А – Т на всем протяжении цепи встречается ненамного чаще (приблизительно в 1,2 раза), чем пара Г – Ц. В случае растений предпочтительность первой пары гораздо более заметна (приблизительно в 1,6 раза).

ДНК – одна из самых больших известных на сегодня полимерных молекул, у некоторых организмов ее полимерная цепь состоит из сотен миллионов звеньев. Длина такой молекулы достигает нескольких сантиметров, это очень большая величина для молекулярных объектов. Т.к. поперечное сечение молекулы всего 2 нм (1нм = 10 –9 м), то ее пропорции можно сопоставить с железнодорожным рельсом длиной в десятки километров.

Химические свойства ДНК.

В воде ДНК образует вязкие растворы, при нагревании таких растворов до 60° С или при действии щелочей двойная спираль распадается на две составляющие цепи, которые вновь могут объединиться, если вернуться к исходным условиям. В слабокислых условиях происходит гидролиз, в результате частично расщепляются фрагменты –Р-О-СН₂- с образованием фрагментов –Р-ОН и НО-СН₂ , соответственно результате образуются мономерные, димерные (сдвоенные) или тримерные (утроенные) кислоты, представляющие собой звенья, из которых была собрана цепь ДНК (рис. 9).

Рис. 9. ФРАГМЕНТЫ, ПОЛУЧАЕМЫЕ ПРИ РАСЩЕПЛЕНИИ ДНК.

Более глубокий гидролиз позволяет отделить участки дезоксирибозы от фосфорной кислоты, а также группировку Г от дезоксирибозы, т.е., более детально разобрать молекулу ДНК на составляющие компоненты. При действии сильных кислот (помимо распада фрагментов –Р(О)-О-СН₂-) отщепляются и группировки А и Г. Действие иных реагентов (например, гидразина) позволяет отделить группировки Т и Ц. Более деликатное расщепление ДНК на компоненты проводят с помощью биологического препарата – дезоксирибонуклеазы, выделяемой из поджелудочной железы (окончание -аза всегда указывает на то, что данное вещество представляет собой катализатор биологического происхождения – фермент). Начальная часть названия – дезоксирибонуклеаза – указывает, какое именно соединение расщепляет этот фермент. Все указанные способы расщепления ДНК ориентированы, в первую очередь, на детальный анализ ее состава.

Самая важная информация, содержащаяся в молекуле ДНК, – порядок чередования групп А, Т, Г и Ц , ее получают с помощью специально разработанных методик. Для этого создан широкий набор ферментов, которые находят в молекуле ДНК строго определенную последовательность, например, Ц-T-Г-Ц-A-Г (а также соответствующую ей последовательность на противоположной цепи Г-А-Ц-Г-Т-Ц) и вычленяют ее из состава цепи. Таким свойством обладает фермент Pst I (торговое наименование, оно образуется из названия того микроорганизма Providencia stuartii, из которого получают этот фермент). При использовании другого фермента Pal I удается найти последовательность Г-Г-Ц-Ц. Далее сопоставляются результаты, полученные при действии широкого набора различных ферментов по заранее разработанной схеме, в результате удается определить последовательность таких групп на определенном участке ДНК. Сейчас подобные методики доведены до стадии широкого применения, они используются в самых разнообразных областях, далеких от научных биохимических исследований, например, при идентификации останков живых организмов или установлении степени родства.

Структура РНК

во многом напоминает ДНК, отличие в том, что в основной цепи фрагменты фосфорной кислоты чередуются с рибозой, а не с дезоксирибозой (рис.). Второе отличие – к боковому обрамлению присоединяется гетероцикл урацил (У) вместо тимина (Т), остальные гетероциклы А, Г и Ц те же, что у ДНК. Урацил отличается от тимина отсутствием метильной группы, присоединенной к циклу, на рис. 10 эта метильная группа выделена красным цветом.

Рис. 10. ОТЛИЧИЕ ТИМИНА ОТ УРАЦИЛА – отсутствие у второго соединения метильной группы, выделенной в тимине красным цветом.

Фрагмент молекулы РНК показан на рис. 11, порядок следования группировок А, У, Г и Ц, а также их количественное соотношение может быть различным.

Рис.11. ФРАГМЕНТ МОЛЕКУЛЫ РНК. Основное отличие от ДНК – наличие группировок ОН в рибозе (красный цвет) и фрагмента урацила (синий цвет).

Полимерная цепь РНК приблизительно в десять раз короче, чем у ДНК. Дополнительное отличие в том, что молекулы РНК не объединяются в двойные спирали, состоящие из двух молекул, а обычно существуют в виде одиночной молекулы, которая на некоторых участках может образовывать сама с собой двухцепные спиральные фрагменты, чередующиеся с линейными участками. На спиральных участках взаимодействие пар соблюдается также строго, как в ДНК. Пары, связанные водородными связями и формирующие спираль (А-У и Г-Ц), возникают на тех участках, где расположение групп оказывается благоприятным для такого взаимодействия (рис. 12).

Для подавляющего большинства живых организмов количественное содержание пар А-У больше чем Г-Ц, у млекопитающих в 1,5–1,6 раза, у растений – в 1,2 раза. Существует несколько типов РНК, роли, которых в живом организме различны.

Химические свойства РНК

напоминают свойства ДНК, однако наличие дополнительных групп ОН в рибозе и меньшее (в сравнении с ДНК) содержание стабилизированных спиральных участков делает молекулы РНК химически более уязвимыми. При действии кислот или щелочей основные фрагменты полимерной цепи Р(О)-О-СН₂ легко гидролизуются, группировки А, У, Г и Ц отщепляются легче. Если нужно получить мономерные фрагменты (подобные тем, что на рис. 9), сохранив при этом химически связанные гетероциклы, используют деликатно действующие ферменты, называемые рибонкулеазами.

Участие ДНК и РНК в синтезе белков

– одна из основных функций нуклеиновых кислот. Белки – важнейшие компоненты каждого живого организма. Мышцы, внутренние органы, костная ткань, кожный и волосяной покров млекопитающих состоят из белков. Это полимерные соединения, которые собираются в живом организме из различных аминокислот. В такой сборке управляющую роль играют нуклеиновые кислоты, процесс проходит в две стадии, причем на каждой из них определяющий фактор – взаимоориентация азотсодержащих гетероциклов ДНК и РНК.

Основная задача ДНК – хранить записанную информацию и предоставлять в тот момент, когда начинается синтез белков. В связи с этим понятна повышенная химическая устойчивость ДНК в сравнении с РНК. Природа позаботилась о том, чтобы сохранить по возможности основную информацию неприкосновенной.

На первой стадии часть двойной спирали раскрывается, освободившиеся ветви расходятся, и на группах А, Т, Г и Ц, оказавшихся доступными, начинается синтез РНК, называемой матричной РНК, поскольку она как копия с матрицы точно воспроизводит информацию, записанную на раскрывшемся участке ДНК. Напротив группы А, принадлежащей молекуле ДНК, располагается фрагмент будущей матричной РНК, содержащий группу У, все остальные группы располагаются друг напротив друга в точном соответствии с тем, как это происходит при образовании двойной спирали ДНК (рис. 13).

По указанной схеме образуются полимерная молекула матричной РНК, содержащая несколько тысяч мономерных звеньев.

На втором этапе матричная ДНК перемещается из ядра клетки в околоядерное пространство – цитоплазму. К полученной матричной РНК подходят так называемые транспортные РНК, которые несут с собой (транспортируют) различные аминокислоты. Каждая транспортная РНК, нагруженная определенной аминокислотой, приближается к строго обусловленному участку матричной РНК, нужное место обнаруживается с помощью все того же принципа взаимосоответствия групп А-У, и Г-Ц. В конечном итоге две аминокислоты, оказавшиеся рядом, взаимодействуют между собой, так начинается сборка будущей белковой молекулы (рис. 14).

Важная деталь состоит в том, что временное взаимодействие матричной и транспортной РНК проходит всего по трем группам, например, к триаде Ц-Ц-У матричной кислоты может подойти только соответствующая ей тройка Г-Г-А транспортной РНК, которая непременно несет с собой аминокислоту глицин (рис. 14). Точно также к триаде Г-А-У может приблизиться лишь набор Ц-У-А, транспортирующий только аминокислоту лейцин. Таким образом, последовательность групп в матричной РНК указывает, в каком порядке должны соединяться аминокислоты. Кроме того, система содержит в закодированном виде дополнительные регулирующие правила, некоторые последовательности из трех групп матричной РНК указывает на то, что в этом месте синтез белка должен остановиться, т.е. молекула достигла необходимой длины.

Показанный на рис. 14 синтез белка проходит с участием еще одного – третьего вида РНКислот, они входят в состав рибосом и потому их называют рибосомными. Рибосома, представляющая собой ансамбль определенных белков рибосомных РНК, обеспечивает взаимодействие матричной и транспортной РНК, играя роль конвейерной ленты, которая передвигает матричную РНК на один шаг после того, как произошло соединение двух аминокислот.

Основной смысл двухстадийной схемы, показанной на рис. 13 и 14, состоит в том, что полимерная цепь белковой молекулы собирается из различных аминокислот в намеченном порядке и строго по тому плану, который был записан в закодированном виде на определенном участке ДНК. Таким образом, ДНК представляет собой отправную точку всего этого запрограммированного процесса.

В процессе жизнедеятельности белки постоянно расходуются, и потому они регулярно воспроизводятся по описанной схеме, весь синтез белковой молекулы, состоящей из сотен аминокислот, проходит в живом организме приблизительно в течение одной минуты.

Первые исследования нуклеиновых кислот были проведены во второй половине 19 в., понимание того, что в ДНК зашифрована вся информация о живом организме, пришло в середине 20 в., структуру двойной спирали ДНК установили в 1953 Дж.Уотсон и Ф.Крик на основании данных рентгеноструктурного анализа, что признано крупнейшим научным достижением 20 столетия. В середине 70-х годов 20 в. появились методики расшифровки детальной структуры нуклеиновых кислот, а вслед за тем были разработаны способы их направленного синтеза. Сегодня ясны далеко не все процессы, происходящие в живых организмах с участием нуклеиновых кислот, и сегодня это одна из самых интенсивно развивающихся областей науки.

ДНК представляют собой многоосновные сильные кислоты, щелочные соли которых образуют в воде очень вязкие прозрачные коллоидные растворы, застывающие при концентрации выше 0,25%. Растворы ДНК характеризуются аномальной (структурной) вязкостью, объясняющейся удлиненной формой молекул, и в потоке обладают двойным, лучепреломлением.

Химически ДНК представляют собой высокомолекулярные полимеры монодезоксирибонуклеотидов (мононуклеотидов), являющиеся мономерами, из которых построены молекулы

ДНК. Каждый мононуклеотид ДНК состоит из остатков фосфорной кислоты, 2-П-дезоксирибозы и пуринового или пиримидинового азотистого основания. Углеводно-фосфатный остаток одинаков во всех мономерах ДНК, азотистое основание же может быть представлено аденином (А), гуанином (Г), цитозином (Ц) или тимином (Т). В ДНК разных организмов имеется некоторое количество так называемых, минорных оснований, например 5-метил-цитозина, частично заменяющего цитозин. У высших животных и человека содержание этого основания достигает 1,5%, у высших растений 5—7% , у бактерий — не более 0,6% . В ДНК бактерий встречается также 6-метиладенин и иногда другие метилированные азотистые основания. В ДНК Т-четных бактериофагов (Т2, Т4 и Т6) цитозин полностью замещен 5-оксиметилцитозином, в ДНК вирусов SP01 и SP8 тимин замещен 5-оксиметилурацилом, а у фага PBS1 — урацилом.

В мононуклоотидах 2-П-дезокси-рибоза присоединена гликозидной связью через первый углеродный атом к атому азота в 9-м положении пуринового основания (аденина или гуанина) или в 3-м положении пиримидинового основания (цитозина или тимина). Остаток фосфорной кислоты присоединен эфирной связью к 5'-му или З'-му атому углерода дезоксирибозы. Таким образом, мононуклеотидные остатки соединены между собой через фосфорную кислоту, которая соединена с 5'-С-атомом дезоксирибозы одного нуклеотида и с 3'-С-атомом дезоксирибозы соседнего нуклеотида и т. д. (схема 1).

Схема 1. Соединение нуклеотидов в молекуле ДНК.

ДНК из различных источников отличаются друг от друга по соотношению входящих в их состав азотистых оснований, то есть по нуклеотидному составу, однако нуклеотидный состав всех ДНК подчиняется определенным закономерностям — правилам Чаргаффа, согласно которым:

1) число молекул аденина равно числу молекул тимина; 2) число молекул гуанина равно числу молекул цитозина; 3) число молекул пуриновых оснований равно числу молекул пиримидиновых оснований;

4) число 6-аминогрупп в молекуле ДНК равно числу 6-кетогрупп, то есть сумма аденин + цитознн равна сумме гуанин + тимин. Записав правила Чаргаффа буквенными обозначениями, получим следующие выражения: 1) А - Т; 2) Г - Ц; 3) А + Г = Т + Ц; 4) А + Ц = Г + Т. Эти правила сохраняют силу и в том случае, если приведенные азотистые основания замещены их метилированными или другими производными (минорными основаниями). Таким образом, нуклеотидный состав ДНК характеризуется молярным отношением (фактором специфичности) или процентом ГЦ-пар, т.е. . Величина этого показателя одинакова для ДНК различных органов и тканей одного организма и практически не отличается у разных видов животных и растений в пределах одного класса. Она достаточно близка у высших растений и животных (позвоночных) — от 0,55 до 0,93. У бактерий, по данным А. С. Спирина и А. Н. Белозерского, величина фактора специфичности колеблется от 0,35 до 2,73 или от 26,8 до 74,2% ГЦ-пар.

Рентгеноструктурный анализ ДНК показал, что пуриновые и пиримидиновые основания нуклеотидных остатков ДНК лежат в одной плоскости, перпендикулярной продольной оси молекулы, тогда как циклы дезоксирибозы находятся в плоскости, почти перпендикулярной той, в которой лежат циклы оснований. Расстояния между азотистыми основаниями отдельных нуклеотидов составляют 3,4 А. В соответствии с этими данными и с правилами Чаргаффа Дж. Уотсон и Ф. Крик построили модель молекулы ДНК (схема 2). Дальнейшие исследования подтвердили их правоту. Установление строения молекулы ДНК явилось крупнейшим открытием в области молекулярной биологии. Согласно модели Уотсона - Крика, молекула ДНК представляет собой двойную спираль, построенную из двух полинуклеотидных цепочек, направленных антипараллельно, то есть если в одной цепочке остаток фосфорной кислоты связывает отдельные нуклеотиды от 5'- к 3'-С-атомам снизу вверх, то в другой цепочке эти связи направлены сверху вниз. Каждая цепочка состоит из углеводно-фосфорного скелета, присоединенные к углеводному компоненту азотистые основания ориентированы внутрь и соединены между собой попарно водородными связями, а именно А– с Т и Г – с Ц. Аденин с тимином соединены двумя Н-связями, тогда как гуанин с цитозином соединены еще третьей водородной связью (схема 3). Двойная спираль закручена вправо, причем полному витку спирали соответствуют 10 пар нуклеотидных остатков, занимающих расстояние в 34 А,— В-форма. В-форма устойчива в среде с высокой влажностью (97% насыщенного пара). Вся молекула ДНК представляет собой жесткий, неветвящийся линейный полимер. В условиях низкой влажности (с 76% насыщения) двойная спираль ДНК принимает А-форму, в которой полный виток спирали занимает расстояние в 28 А, причем меняется также положение плоскости, в которой расположены азотистые основания, и число оснований на полный виток (один виток содержит 11 нуклеотидов).

В хроматине ДНК образует комплексы с гистонами. Такие нуклеогистоны находятся в сверхспирализованном состоянии, причем суперспираль имеет радиус 50 А и расстояние между витками 120 А. В хромосомах и частично в хроматине такие суперспирали дезоксирибонуклеопротеида закручены в спирали высших порядков с диам. 250 и 500 А.

Молекулярный вес (масса) ДНК неодинаков и зависит от источников получения образца ДНК. Помимо этого, даже при самых тщательных и щадящих процедурах выделения ДНК подвергается некоторой деградации и ее молекулярный вес может быть ниже, чем в клетках. Препараты, получаемые современными методами из тканей животных н растений, имеют мол. вес 6-106—10-106, однако истинный мол. вес ДНК животных и растений, как показывают методы определения мол. веса по вязкости и по длине молекул (lA двуспиральной ДНК в В-форме соответствует 197 единицам молекулярного веса), значительно выше и может достигать десятков миллиардов. Таким образом. молекулы ДНК хромосом являются самыми крупными молекулами из всех известных биополимеров.

Схема 2. Двойная спираль молекулы ДНК (модель Уотсона—Крика): А — аденин; Т — тимин, Г — гуанин; Ц — цитозин; Д — дсзоксирибоза; Ф — фосфат; 34 А — величина витка, спирали; 10 А — радиус спирали; 3, 4 А — расстояние между нуклеотидами; стрелки указывают направление витка спирали.

Схема 3. Соединение пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле ДНК (точками обозначены водородные связи).

Методом молекулярной гибридизации показано, что в ядерной ДНК плодовой мушки Drosophila melanogaster около 75% всей ДНК представлено уникальными последовательностями, около 15% — очень часто (до 1 000 000 раз) повторяющимися и около 10% — относительно часто (1000—100 000 раз) повторяющимися нуклеотидными последовательностями. Очень часто повторяющиеся последовательности расположены главным образом в плотном хроматине, цитологически описываемом как гетерохроматин; они встречаются чаще всего в так называемой сателлитной ДНК, обычно отличающейся от основной массы ДНК по нуклеотидному составу и отделяемой от нее при равновесном центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия. Такие сателлиты содержатся почти у всех эукариотов и составляют от 1% до половины всей массы генома. Даже у близкородственных видов количество сателлитной ДНК может существенно отличаться. Относительно часто повторяющиеся последовательности распределены между гетеро- и эухроматином. Значительная часть дезоксирибонуклеопротеида хроматина состоит из чередующихся участков повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК. Заметные количества ДНК, содержащей относительно часто повторяющиеся последовательности, находятся также в хроматине, ассоциированном с ядрышками и кодирующем рибосомные РНК.

Первичная структура ДНК трудно поддается изучению уже потому, что молекулы ДНК имеют огромные размеры. Некоторую информацию о последовательности нуклеотидов дает изучение пиримидиновых блоков. При обработке ДНК концентрированной муравьиной кислотой, содержащей дифениламин, происходит отщепление пуриновых оснований и дальнейший гидролиз ДНК. В молекуле сохраняются пиримидиновые последовательности, остающиеся в блоках, представляющих собой олигодезоксинуклеотиды, лишенные пуриновых мономеров. Такие блоки разделяют с помощью хроматографии на изоплиты — олигомеры, содержащие одинаковое число нуклеотидных остатков, затем их в свою очередь разделяют и анализируют. Подобным образом изучают пуриновые блоки, получаемые обработкой ДНК гидразином. Однако наибольший прогресс в изучении структуры ДНК достигнут в результате применения дезоксирибонуклеаз, расщепляющих определенные последовательности нуклеотидов, и в особенности рестриктаз, обладающих узкой специфичностью в отношении коротких нуклеотидных последовательностей в 6—7 нуклеотидов. Более детальную информацию в отношении нуклеотидной последовательности в молекулах ДНК, представляющих собой структурные гены, получают путем анализа нуклеотидной последовательности в соответствующих им РНК и белках. Удалось установить последовательность нуклеотидов в небольших молекулах сателлитной ДНК у высших организмов, выяснена также нуклеотидная последовательность в довольно значительных участках ДНК у некоторых вирусов, бактерий и др.

Метилирование азотистых оснований в составе ДНК происходит уже после синтеза молекулы и относится к так называемом постсинтетическим изменениям или модификациям.

Особенности структуры нуклеотидов и их роль в человеческом организме. Физико-химические свойства и биологические функции дезоксирибонуклеиновой кислоты. Типы рибонуклеиновых кислот, их биологические функции и значение в передачи генетической информации.

Рубрика	Биология и естествознание
Вид	реферат
Язык	русский
Дата добавления	27.05.2012
Размер файла	473,1 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Министерство образования и науки

МОУ “Академический лицей”

Нуклеиновые кислоты

ученик 10 в класса

Содержание

Физико-химические свойства ДНК

Биологические функции ДНК

Структура и физико-химические свойства РНК

Типы РНК и их биологические функции

Термин нуклеиновые кислоты был предложен немецким химиком Р. Альтманом в 1889г после того, как эти соединения были открыты в 1868г. швейцарским врачом Ф. Мишером. Он экстрактировал клетки гнойного пневмококка разбавленной соляной кислотой в течение нескольких недель и получил в остатке почти чистый ядерный материал, назвав его нуклеином (от лат. nucleus - ядро). По своим свойствам нуклеин резко отличался от белков: он был кислым, не содержал серы, было много фосфора. Нуклеин хорошо растворялся в щелочах, но не растворялся в разбавленных кислотах.

Впоследствии из животных, растительных объектов и микроорганизмов были выделены разные нуклеиновые кислоты. Их наилучшим источником оказались клетки, имеющие большие ядра.

Химически нуклеиновые кислоты представляют собой биополимеры, состоящие из мономерных звеньев - нуклеотидов. Каждый нуклеотид содержит три различных компонента: азотистое (пуриновое или пиримидиновое) основание, моносахарид пентозу (рибозу или дезоксирибозу) (Rb), остаток фосфорной кислоты (P). Как показал специфический гидролиз (кислотный, щелочной), а также гидролиз ферментами-нуклеазами, эти компоненты соединены друг с другом в такой последовательности: азотистое основание - пентоза - фосфат. Соседние нуклеотиды связаны друг с другом посредством эфирной связи между моносахаридом и фосфатом другого нуклеотида.

Поскольку остаток пентозы и фосфат соединены эфирной связью, то при образовании полинуклеотидной цепи связь Rb-P-Rb называется фосфодиэфирной.

Азотистые основания не участвуют в образовании никаких других ковалентных связей, помимо связывающей их с остатками пентозы сахарофосфатной цепи. Именно последовательность азотистых оснований в полинуклеотидной цепи определяет уникальную структуру и специфическую функцию молекул нуклеиновых кислот.

Гидролиз нуклеиновых кислот, выделенных из ядер клеток, показал, что они состоят из пуриновых (аденина, гуанина) и пиримидиновых (цитозина, тимина) оснований, 2-дезоксирибозы и фосфорной кислоты. Эта нуклеиновая кислота была названа дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК). Из дрожжей была получена другая по химическому составу нуклеиновая кислота, содержащая вместо тимина урацил и вместо дезоксирибозы рибозу. Ее назвали рибонуклеиновой кислотой (РНК).

Биологическая функция нуклеиновых кислот оставалась неизвестной в течение почти столетия. Только в 40-х гг. XX в. О.Т. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти установили, что эти биополимеры ответственны за хранение, репликацию (воспроизведение), транскрипцию (передачу) и трансляцию (воспроизведение на белок) генетической (наследственной) информации. В 1953г., когда Дж. Уотсон и Ф. Крик сообщили о расшифровке молекулярной структуры ДНК, биохимия и вообще биология начала отсчет новой эры познания живой материи.

Структура нуклеотидов

Строение пуриновых оснований

Сам пурин не входит в состав нуклеотидов, а входят его производные - аденин (А) и гуанин (G).

Строение пиримидиновых азотистых оснований

Пиримидин также не входит в состав нуклеотидов, а входят его производные - урацил (U), тимин (Т), цитозин (С).

В составе ДНК и РНК встречаются более редкие азотистые основания, например, 5-метилцитозин, 4-тиоурацил и дигидроурацил; они получили название минорных оснований.

В состав ДНК входят в-D-2-дезоксирибоза, в состав РНК - в-D-рибоза. И в том, и в другом случае эти монозы являются пентозой (пять углеродных атомов), различия касаются лишь второго углеродного атома. В рибозе углерод-2 связан с ОН-группой, тогда как в дезоксирибозе на месте ОН-группы находится Н, отсюда префикс "дезокси". Буквы в и D отражают специфическую конфигурацию при атомах С-1' и С-4' фуранозного цикла:

Нуклеозиды - соединения, в которых пуриновые или пиримидиновые основания связаны с рибозой (рибонуклеозиды) или дезоксирибозой (дезоксирибонуклеозиды).

Нуклеозиды относятся к N-гликозидам: атом С-1' рибозы или дезоксирибозы связан с N-9 пуринового или N-1 пиримидинового основания:

Аденозин и дезоксиаденозин

В состав ДНК входят следующие нуклеозиды, что описывается формулами:

Аденин + дезоксирибоза = дезоксиаденозин.

Гуанин + дезоксирибоза = дезоксигуанозин.

Цитозин + дезоксирибоза = дезоксицитидин.

Тимин + дезоксирибоза = дезокситимидин.

В состав РНК входят следующие нуклеозиды, что описывается формулами:

Аденин + рибоза = аденозин.

Гуанин + рибоза = гуанозин.

Цитозин + рибоза = цитидин.

Урацил + рибоза = уридин.

Кроме выше перечисленных главных нуклеозидов встречаются и минорные нуклеозиды, из которых наиболее распространены дигидроуридин, псевдоуридин; в последнем отсутствует обычная N-гликозидная связь: в нем атом С-1' рибозы соединен с атомом С-5 урацила.

Нуклеозиды лучше растворимы в воде, чем исходные азотистые основания. Их легко можно разделить и идентифицировать методом тонкослойной хроматографии. Они устойчивы к щелочам, но легко гидролизуются кислотами, а также ферментом нуклеозидазой.

Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды с присоединенной эфирной связью к остатку рибозы или дезоксирибозы фосфатной группой. В образовании связи участвует 5'-углеродный атом пентозы. В зависимости от строения пентозы все нуклеотиды можно разделить на рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды:

Рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды

В зависимости от числа остатков фосфорной кислоты нуклеотиды подразделяются на нуклеозид-5'-монофосфаты, нуклеозид-5'-дифосфаты и нуклеозид-5'-трифосфаты. В принципе нуклеозид может быть фосфорилирован до тетрафосфата.

Ниже приводятся названия и сокращенные обозначения нуклеотидов.

Аденозинмоно-, ди-, трифосфат

Гуанозинмоно-, ди-, трифосфат

Цитидинмоно-, ди-, трифосфат

Уридинмоно-, ди-, трифосфат

Дезоксоаденозинмоно-, ди-, трифосфат

Дезоксигуанозинмоно-, ди-, трифосфат

Дезоксицитидинмоно-, ди-, трифосфат

Дезокситимидинмоно-, ди-, трифосфат

Данная номенклатура нуклеотидов рассматривает их как фосфорные эфиры. В то же время благодаря наличию кислотной фосфатной группы удобно рассматривать нуклеозидмонофосфаты как кислотные производные исходных нуклеозидов, например, адениловая, уридиловая, гуанидиловая, цитидиловая кислоты.

Нуклеотиды - сильные кислоты, так как остаток фосфорной кислоты, входящей в их состав, сильно диссоциирован.

Уникальны биохимические функции нуклеотидов. В качестве основных можно отметить следующие:

1) являются строительными блоками нуклеиновых кислот (ДНК и РНК); участвуют в молекулярных механизмах, с помощью которых генетическая информация хранится, реплицируется и транскрибируется;

2) выполняют важную роль в энергетическом (фосфорном) обмене, в аккумулировании и переносе энергии;

3) служат агонами (коферментами и активными простетическими группами) в окислительно-восстановительных ферментах;

4) играют важную роль в синтезе олиго- и полисахаридов, жиров.

Таким образом, нуклеотиды - универсальные биомолекулы, играющие фундаментальную роль в обмене веществ и энергии живой клетки.

Физико-химические свойства ДНК

ДНК - довольно сильная многоосновная кислота, полностью ионизированная при рН 4,0. Фосфатные группы расположены по периферии. Они прочно связывают ионы Са и Мg, амины, гистоны - положительно заряженные белки. Устойчивость комплементарных пар оснований зависит от величины рН. Пары оснований наиболее устойчивы в интервале рН 4,0-11,0. За его пределами двухцепочечная спираль ДНК теряет устойчивость и раскручивается.

Молекулярная масса ДНК неодинакова и зависит от источника ее получения. К тому же даже при самых тщательных и щадящих процедурах выделения ДНК подвергается некоторой деградации. Препараты, полученные современными методами из тканей животных и растений, имеют молекулярную массу 6·10-10·10. Однако истинная молекулярная масса ДНК животных и растений, определенная по вязкости и по длине молекул, значительно выше и достигает десятков миллиардов.

У большинства вирусов ДНК представляет собой двойную спираль, линейную или замкнутую в кольцо. У некоторых вирусов она представляет собой одну полинуклеотидную цепь, замкнутую в кольцо и имеющую сравнительно небольшую молекулярную массу - 2·10. ДНК сравнительно легко деполимеризуется под действием некоторых химических соединений, ультразвука, ионизирующей и ультрафиолетовой радиации. Нагревание растворов ДНК до температур 70-80°С, а также их подщелачивание вызывают денатурацию ДНК, заключающуюся в плавлении двойной спирали (разрушение водородных связей и гидрофобных взаимодействий), и расхождение полинуклеотидных цепей. Денатурация сопровождается понижением вязкости раствора, повышением поглощения в ультрафиолетовой области, увеличением отрицательного удельного вращения плоскости поляризации света, увеличением плавучей плотности образцов ДНК. Возрастание светопоглощения света при 260 нм называется гипохромным эффектом; это важнейший критерий денатурации ДНК, по которому можно контролировать этот процесс.

В отличие от многих глобулярных белков, денатурация которых происходит постепенно в широком температурном интервале, нативные ДНК денатурируют в узком интервале температур (~10°С), поэтому тепловую денатурацию часто называют плавлением. Температура плавления тем выше, чем больше в молекуле ДНК GС-пар; этот показатель может использоваться для определения нуклеотидного состава ДНК. Установлено, что температура плавления линейно связана с составом ДНК: ее повышение на 1° соответствует 2,5 молярных % GС-пар. Гомогенные препараты ДНК характеризуются плавлением с резким переходом спираль - клубок, тогда как гетерогенные препараты дают сравнительно широкую зону плавления, что может служить мерой гетерогенности ДНК. При быстром охлаждении после тепловой денатурации ДНК не восстанавливает своих нативных свойств; однако, при медленном охлаждении полинуклеотидные цепи реассициируются по принципу комплементарности, т.е. происходит ренатурация молекул ДНК. Это продемонстрировано, в частности, на препаратах ДНК пневмококка с помощью методов электронной микроскопии и градиентного ультрацентрифугирования в СsСl.

Биологические функции ДНК

Важнейшая биологическая функция ДНК - генетическая, т.е. хранение и передача наследуемых признаков. В 1943 г. О. Т. Эвери,

К. Мак-Леод и М. Мак-Карти из Рокфеллеровского института обнаружили это впервые. Они экспериментально установили, что невирулентный штамм бактерии Pneumococcus может превратиться в вирулентный простым добавлением ДНК, выделенной из вирулентных пневмококков. Исследователи заключили, что ДНК может содержать генетическую информацию. Работа О.Т. Эвери и его сотрудников признана выдающейся, представляющей собой важную историческую веху в исследовании генетической функции ДНК. Сейчас многочисленными экспериментами установлено, что ДНК - основной компонент клеточных органелл-хромосом. Трансформирующаяся ДНК включается ковалентно в ДНК невирулентной клетки (клетки-реципиента) и, таким образом, реплицируется вместе с хромосомой реципиента; свойство вирулентности наследуется. В то же время возможность передачи генетической информации бактериальным клеткам в результате введения РНК или белка не получила экспериментального подтверждения.

На вопрос, почему наследуемые признаки копируются с удивительной точностью, дает ответ принцип комплементарности. Модель ДНК, разработанная Уотсоном и Криком, четко объясняет механизм передачи информации. В связи с тем, что последовательность азотистых оснований одной цепи однозначно определяет последовательность оснований в другой цепи, репликация ДНК в клетке происходит в результате расхождения двух полинуклеотидных цепей и последующего синтеза двух новых (дочерних) цепей на старых (родительских) цепях как на матрицах. В результате образуются две дочерние двухцепочечные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле ДНК, содержащие по одной цепи из родительской молекулы. Такой механизм репликации был назван полуконсервативным. Он получил блестящее подтверждение в экспериментах с клетками E.coli и меченым азотом N, проведенных М. Мезелсоном и Ф. Сталем в 1957 г. Полученные ими результаты точно согласуются с полуконсервативным механизмом редупликации макромолекул ДНК.

Структура и физико-химические свойства РНК

Рибонуклеиновые кислоты (РНК) - однонитевые молекулы, поэтому в отличие от ДНК их вторичная и третичная структуры нерегулярны. Нуклеотидная цепь РНК обладает гибкой структурой, ее длина в зависимости от вида РНК может варьировать в очень широких пределах - от нескольких десятков до десятков тысяч нуклеотидных остатков; молекулярная масса РНК находится в пределах 10-10.

Последовательность нуклеотидных звеньев, соединенных фосфодиэфирной связью в неразветвленную полинуклеотидную цепь, представляет собой первичную структуру РНК. Вторичная и третичная структуры РНК, определяемые как пространственная конформация полинуклеотидной цепи, формируются в основном за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий между азотистыми основаниями. Если для молекулы нативной ДНК характерна устойчивая спираль, то структура РНК более многообразна и лабильна. Рентгеноструктурный анализ показал, что отдельные участки полинуклеотидной цепи РНК, перегибаясь, навиваются сами на себя с образованием внутриспиральных структур. Стабилизация структур достигается за счет комплементарных спариваний азотистых оснований антипараллельных участков цепи; специфическими парами здесь являются А-U, G-С и, реже, G-U.

Образование спиральных структур сопровождается гипохромным эффектом - уменьшением оптической плотности образцов РНК при 260 нм. Разрушение этих структур происходит при понижении ионной силы раствора РНК или при его нагревании до 60-70°С; оно также называется плавлением и объясняется структурным переходом спираль - хаотический клубок, что сопровождается увеличением оптической плотности раствора нуклеиновой кислоты.

Хотя РНК относится к однониточным полинуклеотидам, вместе с тем в ее цепях имеются участки различной длины, состоящие из комплементарных друг другу нуклеотидных последовательностей, включающих от десятков до тысяч нуклеотидных остатков, расположенных на небольшом удалении друг от друга. Благодаря этому в молекуле РНК возникают как короткие, так и протяженные биспиральные участки, принадлежащие одной цепи; эти участки носят название шпилек. Модель вторичной структуры РНК со шпилькообразными элементами была создана в конце 50-х - начале 60-х гг. XX в. в лабораториях А.С. Спирина (Россия) и П. Доти (США).

Типы РНК и их биологические функции

Клетки содержат три основных типа РНК: рибосомную - рРНК, транспортную - тРНК и матричную (информационную) - мРНК. Каждая из этих РНК выполняет специфическую роль в сложном процессе биосинтеза белка, при котором последовательность аминокислот однозначно определяется нуклеотидной последовательностью ДНК.

В эукариотических клетках существуют также малые ядерные РНК (мяРНК), являющиеся участниками процессинга РНК, и гетерогенные ядерные РНК (гяРНК), представляющие собой предшественников мРНК. Кроме того, обнаружена так называемая антисмысловая РНК, участвующая в регуляции процесса репликации ДНК.

В процессе транскрипции нуклеотидная последовательность локуса (место в хромосоме, где находится ген) в ДНК копируется в молекулу РНК. Транскрибируются три вида генов. Транскрипты генов рРНК используются в синтезе рибосом, нуклеотидная последовательность мРНК переписывается в последовательность аминокислот при синтезе полипептида на рибосоме, а транскрипты генов тРНК связываются с аминокислотами, которые затем переносятся в рибосомный синтезирующий центр в последовательности, зашифрованной в мРНК; этот процесс называется трансляцией.

Рибосомная РНК. Она входит в состав клеточных органелл - рибосом. Биохимическая функция рРНК пока до конца не изучена. Предполагается, что она играет роль молекулярного каркаса, на котором крепятся участники процесса трансляции; рРНК имеет большую молекулярную массу (до 2-10), характеризуется метаболической стабильностью. На ее долю приходится до 85-90% всех клеточных РНК. Степень спирализованности молекул рРНК находится в пределах 70-80%.

Предполагается, что в белоксинтезирующей системе клетки функция рРНК не исчерпывается ролью структурного компонента. У прокариотов обнаружено, что в рРНК имеются небольшие участки, комплементарные участкам мРНК. Спаривание этих участков, видимо, способствует первоначальному связыванию мРНК с рибосомой. Не исключено, что некоторые участки рРНК играют определенную роль в формировании пептидтрансферазного центра рибосомы, ответственного за образование пептидных связей при синтезе белка.

Транспортные РНК. Это низкомолекулярные нуклеиновые кислоты; молекулярная масса колеблется в пределах 23000-30000, каждой из 20 белковых аминокислот соответствует, по крайней мере, одна тРНК. Однако некоторым аминокислотам специфичны от 2 до 6 тРНК; предполагается их общее количество около 60. Они составляют примерно 15% общего количества клеточных РНК. Многие тРНК получены в гомогенном состоянии, некоторые - в кристаллическом виде.

рибонуклеиновая кислота биологический генетический

Вследствие этого реферата можно сказать, что нуклеиновые кислоты играют огромную роль в нашем организме, т.к. играют важнейшую роль в передачи генетической информации.

Обзор

ДНК не то, чем кажется. И то, чем кажется, тоже. Но не всегда.

иллюстрация автора статьи

Автор

Редакторы

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

Место ДНК в клетке и обществе

Всё это радует и служит популяризации науки, однако не стоит забывать что в жизни — в биологической жизни — ДНК — это, чаще всего, правозакрученная двойная спираль, шаг которой охватывает примерно 10 нуклеотидов.

В тени молекулярной догмы

реплицироваться в новую копию ДНК;
транскрибироваться в РНК.

И уже РНК далее способна (хотя и не обязательно — может просто функционировать в клетке сама по себе):

или в особом, описанном позже, случае

Рисунок 2. Центральная догма молекулярной биологии

Что же осталось в тени процессов, объединенных информационными потоками центральной догмы? Что бы это ни было, ему есть где развернутся. На некодирующие области приходится большая часть эукариотических геномов (в случае человека — увесистые 98%). У прокариот их поменьше — в среднем, 20%. По началу такие области, не содержащие послание для передачи в РНК, называли мусорной ДНК (junk DNA) [1] и относились к ним с пренебрежением. Прошли годы, методики совершенствовались, знания неуклонно копились. И теперь мы знаем: в этом сумраке таится много полезного. Что же именно и в какой пропорции?

В некодирующей области ДНК есть, скажем, мобильные генетические элементы (прежде всего, способные перемещаться по геному транспозоны [2]), тандемные повторы разного сорта (от сателлитов до микросателлитов) [3] и прочее. Наконец, огромное значение имеют области ДНК, нужные для регуляции. Действительно, помимо блоков, ЦДМБ имеет еще и стрелки — они обозначают процессы передачи информации, вполне конкретные биохимические процессы.

Что регулирует эти сложные процессы, что управляет ими? Специфичное, хорошо оркестрованное взаимодействие ДНК и ДНК-связывающих белков. Дело в том, что в живой клетке (ткани, природе. ) все должно быть динамично и управляемо. Это жизненно необходимо и для разумного реагирования на удары судьбы (стрессы), и для разного рода взаимодействий клеток, и для индивидуального развития (онтогенеза).

Притча о слепых белках и ДНК

Безусловно, ДНК далеко до структурного разнообразия белков с их неисчислимыми фолдами, укладками и т.п. Однако и у нее можно выделить иерархию уровней организации: от первичной (последовательность нуклеотидов) через небольшое разнообразие вторичных и третичных структурных блоков до четвертичной. Последняя представляет собой надмолекулярные объединения — как между разными молекулами ДНК, так и между ДНК и ДНК-связывающими белками.

триплетность;
неперекрываемость;
вырожденность;
универсальность;
наличие кодонов — знаков препинания;

и некоторыми другими.

Все эти законы не действуют на некодирующей части генома. А действуют совсем другие и для каждого типа последовательности они, в общем, свои.

Таковы принципы кодирования и хранения генетической информации, изображенные в виде блоков ЦДМБ. А как насчет способов ее воплощения, то есть перевода информации одного биополимера в другой, а также всех последующих этапов экспрессии генов? Что стоит за стрелками на схеме догмы, соединяющей квадраты? Большая биохимическая работа и сложные структурные основы. Эти процессы протекают во вполне физической реальности — на них согласованно работают многие ферменты, факторы. Вовлечены в эту 3D-хореографию и специализированные области ДНК. Что же делает их такими специализированными?

В первом приближении — им следует связывать белковые молекулы. Для этого служат опять-таки разные уровни организации регуляторных ДНК: особая последовательность, структура и физико-химические свойства.

Рисунок 3. Сайт специфичного и точного связывания важной рестриктазы EcoRI и место разреза — расщепления ДНК

рисунок автора статьи

Рисунок 4. Сайт связывания фактора транскрипции CEBPB

видят ДНК совершенно по-разному.

Пo мере того, как ученые вникали в интимные стороны взаимодействий ДНК и ДНК-связывающих белков, они стали различать прямое (direct) и непрямое прочтения (indirect readout) нуклеотидной последовательности. В случае прямого прочтения распознавание и связывание двух биомолекул определяется теми парами оснований, которые, собственно, контактируют с белком. Здесь все понятно. Но уже довольно давно биологи стали отмечать: не вовлеченные в прямые взаимодействия нуклеотиды определяют стабильность и специфичность связывания. В этом и состоит непрямое прочтение.

В числе первых этот аспект распознавания описан на примере такого важного фактора транскррипции, как TATA-связывающий белок (TATA-binding protein, TBP). После этого последовало множество других примеров непрямого прочтения [6].

Но и этого мало: выделили также прочтение формы (shape readout) — оно определяется трехмерной формой дуплекса ДНК. В основе этого нового видения той же ДНК — вандерваальсовы и электростатические взаимодействия. Напомним, что прямое прочтение ДНК белком зависит от водородных связей, образованных конкретными нуклеотидами и аминокислотными остатками [7].

Следующий пункт. Важность великого множества одних только физико-химических и структурных свойств (не забывая и первичную структуру!) связано с тем, что, скажем, транскрипция — процесс многостадийный, и на разных этапах одни параметры ДНК могут быть важнее других. Даже инициация транскрипции насчитывает несколько этапов: посадка белков, образование закрытого комплекса, плавление дуплекса (то есть расхождение цепей) с образованием открытого комплекса и т.д. Кстати, именно инициация транскрипции — в особенности на примере прокариотических промоторов и простых РНК-полимераз, — служит элементарной системой для изучения всей сложной кухни молекулярного узнавания [8], [9].

Рисунок 5. Бактериофаг Т7 — срез через вирион (слева) и общий вид

Биография Т7 от начала до конца. До 3′-конца

Далее включается область генов II класса и соответствующих промоторов. Их задача — активная наработка ДНК бактериофага (ее репликация), а также синтез лизоцима — антибактериального фермента, с помощью которого потомкам бактериофага предстоит выбраться из гибнущей клетки. Стандартный сценарий для такого литического фага, как Т7.

Наконец, область генов и промоторов III класса. Их задача — обеспечить созревание фаговой ДНК, сборку новых вирусных частиц и затем упаковать одно в другое.

На этом жизненный цикл Т7 заканчивается литической и трагической концовкой. Весь экшн занимает обычно 17 мин, по минутам же расписано переключение между его фазами [13], [14]. Но остается довольно животрепещущий вопрос: что переключает активность областей этого элементарного генома?

Промоторы — промотируют, полимераза — полимеразит

Рисунок 7. Едва различимые последовательности очень непохожих по своим свойствам нативных промоторов бактериофага T7

Здесь на сцену выходят физико-химические свойства дуплекса промоторных областей. Они могут объяснить, как РНК-полимераза Т7 распознает их и специфично, и переключаемо. Для этого процесса молекулярного узнавания важнее именно уровень физико-химических свойств ДНК — что особенно явственно в случае предельно простой транскрипционной системы Т7 [14].

Какими же параметрами ДНК могут направляться взаимодействия биомолекул?

Задолго до прямого контакта молекулярному узнаванию промотора и полимеразы может способствовать электростатический потенциал. Действительно, если мы вспомним, что каждый ее мономер-нуклеотид имеет заряженную отрицательно фосфатную группу, станет понятно — на ДНК есть к чему притянутся положительному заряду. В полном соответствии со школьным законом Кулона. Действительно, ДНК-связывающие белки с этой целью снабжены положительно заряженными участками. В случае же промоторов Т7 присутствуют и особые мотивы распределения заряда [15]. Если мы рассчитаем значение заряда вдоль оси ДНК (на основе известной последовательности нуклеотидов), то получим характерные профили (рис. 8). Заметим, что свой профиль есть и у промоторов II и III класса — по ним, в частности, фаговая РНК-полимераза их и различает.

Рисунок 8. Профили электростатического потенциала для промоторов Т7: ранних, II класса и III класса

Следующее важное свойство ДНК — дестабилизация при скручивании. Сложно подобрать простое название этому параметру, так что приведем какое есть: вызванная суперспирализацией дестабилизации дуплекса ДНК (Stress-Induced Duplex Destabilization). Если коротко, модель SIDD — это способ описать, что будет с ДНК, если на нее как следует надавить, а точнее — скрутить. Дело в том, что одни последовательности в такой напряженной ситуации могут легко расплавиться (так называют расхождение цепей ДНК), другие — выстоят, третьи — плавятся совсем не там, где от них ждешь. Это свойство важно для взаимодействия ДНК с белками и, в частности, хорошо зарекомендовало себя для предсказания промоторов [9]. Как же обстоят дела с SIDD у промоторов Т7?

Рисунок 9. Профиль SIDD для генома Т7

рисунок автора статьи

Из набора промоторов Т7 SIDD показывает следующий тренд. Если промотор представляет класс III, то он гораздо более легкоплавкий — цепи дуплекса такого участка ДНК расходятся при меньшей температуре и более низкой суперспирализации. Это неплохо соотносится с экспериментальными данными о том, что промоторы разных классов активны при разных условиях окружающей среды — включая как раз таки показатель суперспиральности [4], [9].

Другая закономерность затрагивает репликацию, для которой Т7-ДНК также является хорошей моделью. Этот геном имеет специализированный ориджин (точку начала репликации), отдаленный от 5′-конца на 17% длины генома. Однако его копирование может начинаться также в ряде других точек — и это как раз таки некоторые промоторы. Удивительно, но именно они относятся к числу дестабилизированных. Удивительно и осмысленно, поскольку репликация также может требовать особых физико-химических свойств дуплекса. В частности, легкость плавление дуплекса ДНК здесь точно не помешает [5].

Исчерпывающие мутанты

Сложный характер зависимости промоторной активности от физико-химических свойств ДНК и от нуклеотидной последовательности требует полных или по меньшей мере больших данных. Вот если бы получить все или почти все возможные варианты промотора Т7 и узнать, насколько они активны. А ведь в постгеномную эпоху и век дешевых NGS это как раз таки реализуемо! И уже проделано в отношении промотора Т7. В работе [17] использована высокопроизводительная методология: в небольшие фрагменты ДНК встроили почти 8 тысяч случайным образом измененных последовательностей промотора фага Т7, а также последовательности-метки (баркоды) — чтобы потом разобрать, кто есть кто. Далее напрямую замерили их промоторную активность. Имея в распоряжении полные последовательности (промотор + небольшой контекст), нетрудно и рассчитать те физико-химические параметры дуплекса, которые не требуют значительных участков ДНК на входе (SIDD здесь, к сожалению, отпадает — ведь для расчета этого параметра дуплекса нужны очень крупные фрагменты ДНК).

Что показала данная работа и последующий анализ данных о последовательности, физико-химии и величине промоторной активности? Прежде всего, она подтвердила многие выводы о важности отдельных нуклеотидов в конкретных положениях и согласованности таких замен. Нетривиальный результат: ранее для этого ученые не одно десятилетие скрупулезно изучали геном T7 с помощью доступных тогда методов. И теперь мы знаем, что высокопроизводительный, основанный на NGS подход — хороший способ разобраться в устройстве других промоторов и вообще вовлеченных в регуляцию областей ДНК. В том числе в новых, не исследованных геномах, которые нам поставляют бесчисленные секвенаторы.

Читайте также: