Белки теплового шока реферат

Обновлено: 05.07.2024

В обзоре обсуждаются механизмы самозащиты почки, противостоящие процессам иммунного воспаления и фиброза. Подробно рассмотрено одно из звеньев этой системы – белки теплового шока (БТШ). Aнализируются нарушения функционирования БТШ при различных заболеваниях почек, в т. ч. при хроническом гломерулонефрите (ХГН), обсуждаются перспективные направления коррекции этих нарушений.

Введение

Долгие годы внимание исследователей в области нефрологии было сосредоточено на изучении повреждающих (эффекторных) звеньев патогенеза различных заболеваний почек. Но в 1990-х гг. были опубликованы результаты исследований, главным образом экспериментальных, которые позволили по-иному взглянуть на механизмы, определяющие течение и исход заболеваний почек. Эти работы показали, что кратковременное воздействие различных повреждающих факторов на
почечную ткань приводит к уменьшению ее чувствительности к дальнейшему повреждению. Полученные в эксперименте данные легли в основу гипотезы о существовании в почке системы “самозащиты” – механизма, противостоящего повреждению [1].

В частности, была подтверждена способность почки к “самоограничению” воспаления. Так, добавление к культуре резидентных клеток неповрежденных клубочков почек провоспалительного цитокина – интерлейкина-1β (ИЛ-1β) – приводило к усиленной выработке этими клетками медиаторов воспаления, тогда как при уже развившемся нефрите ответ клеток на введение ИЛ-1β был значительно
слабее [2]. К парадоксальному торможению воспалительных реакций в почке при экспериментальном нефрите также приводило введение в клубочки активированных макрофагов [3]. На модели “ишемия–реперфузия” была продемонстрирована способность почек отвечать “резистентностью” к другому виду повреждения – нарушению гемодинамики. Установлено, что короткий период ишемии в почке
активирует локальный синтез ряда факторов и приводит к компенсаторным изменениям гемодинамики, которые в последующем защищают почку от тяжелой ишемии [4]. Кроме того, получены данные, свидетельствующие о наличии у разных тканей свойства “термотолерантности”. В частности, в культуре клеток различных тканей показано, что быстрое нагревание до сублетальных температур приводит к синтезу “стрессорных” молекул (т. н. белков теплового шока), способствующих сохранению структуры белков и предупреждающих их разрушение при дальнейшем температурном воздействии [5].

Последующие исследования продемонстрировали, что активация факторов локальной самозащиты тканей в ответ на повреждение представляет собой универсальную запрограммированную реакцию на различных уровнях – внутри- и внеклеточном, а также на поверхности клеток [1]. Эндогенные
протективные медиаторы могут изменять течение патологического процесса в почке, в связи с этим они представляют особый интерес для понимания основных закономерностей прогрессирования поражения почек и как объект – для разработки новых путей воздействия с целью предупреждения
развития фиброза в почке.

Настоящий обзор посвящен одному из компонентов системы самозащиты почки – белкам теплового шока (БТШ). Авторами анализируются нарушения функционирования БТШ при различных заболеваниях почек, в т. ч. при хроническом гломерулонефрите (ХГН), обсуждаются возможные направления коррекции этих изменений.

Стресс-белки и белки теплового шока

Поддержание полного набора функционально компетентных белков в каждой клетке в физиологических условиях и во время стресса/повреждения обеспечивается различными механизмами, включая систему белков, названных молекулярными шаперонами. Термин “шаперон” (от франц. “сhaperon” – компаньонка) впервые применил R.A. Laskey в 1978 г. при описании свойств белка, предотвращающего нежелательные ионные взаимодействия между гистонами и молекулой ДНК.
По своей сути шапероны – белки, облегчающие фолдинг, рефолдинг, сборку и разборку других белков и макромолекулярных комплексов. Шапероны, синтез которых активируется стрессорными факторами, обозначают как стресс-белки. Если стрессорным фактором является тепловой шок, такие белки
называют белками теплового шока (БТШ, англ. Hsp, от “heat shock proteins”). Исторчески термин “белок теплового шока” используется и в случаях, когда экспрессия родительского гена индуцируется не только собственно тепловым шоком, но и иными факторами [6].

БТШ являются высококонсервативными белками и обнаруживаются во всех организмах – от бактерий до человека. Они выполняют фундаментальную защитную роль – облегчают образование вторичной и третичной структур других белков, а также участвуют в процессах репарации или элиминации токсических для клетки неправильно свернутых или денатурированных белков [7, 8].

Своим названием БТШ обязаны истории их открытия. В 1962 г. F. Ritossa обнаружил вздутия (пуфы) в структурных единицах хромосомы слюнной железы мушки Drosophila, перенесшей воздействие высоких температур. В 1974 г. A. Tissieres et al. выявили деспирализацию хромосом в этих участках и связали их наличие с увеличением экспрессии генов, кодирующих синтез особых белков [6]. Индуцированные умеренным прогреванием тела, эти белки обеспечивали транзиторную толерантность к высоким,
обычно летальным, температурам. Позже было установлено, что синтез БТШ индуцируется не только при повышении температуры, но и при многих других неблагоприятных воздействиях, таких как добавление к клеткам органических растворителей, тяжелых металлов, оксидантов, а.

Актуальность проблемы. В России вопросы стратегии и тактики борьбы с ВИЧ-инфекцией определены работами В.И.Покровского (1988: 1989; 1993). В.И.Покровский (1987) предсказал грядущий размах распространения ВИЧ-инфекции в стране и внедрил в практическое здравоохранение структуру, предназначенную для борьбы со СПИДом.

В настоящее время ВИЧ-инфекция охватила все страны мира. К середине 1996 года общее количество инфицированных вирусом иммунодефицита во всем мире достигло 27,9 миллионов человек (Рахманова А.Г., 1996).

Несмотря на то, что выполнен беспрецедентно большой объем научных исследований по. проблеме ВИЧ-инфекции, предложены методы лекарственной терапии, позволяющие добиваться временного улучшения состояния больных СПИДом. до настоящего времени не известен ни один достоверный случай выздоровления, поэтому СПИД считают болезнью с летальностью 100%.

Проблема ВИЧ-инфекции усугубляется еще и тем фактом, что с начала девяностых годов ВИЧ все более и более завоевывает основную популяцию населения, в то время как в течение первых десяти лет распространение шло преимущественно среди определенных групп населения, так называемых "групп риска" - наркоманы, гомосексуалисты. проститутки, больные гемофилией (Лобзин Ю.В., Казанцев А.П.. 1996).

Актуальность проблемы определяет неуправляемое интенсивное возрастание случаев инфицированности, болезненности и смертности во всех странах мира (Шувалова Е.П., 1995). Выявление ВИЧ-инфицированных лиц не приводит к прекращению передачи ВИЧ от них, несмотря на уведомление их об уголовной ответственности за заражение (Покровский В.В. с соавт., 1996). Не решенными остаются основные проблемы СПИДа (Белозеров Е.С. с соавт., 1995):

- отсутствие методов ранней диагностики:

- полная неуправляемость патологических процессов у заболевшего:

- отсутствие надежных клинических и лабораторных показателей перехода инфекционного процесса из латентной стадии в манифестную.

При СПИДе и ВИЧ-инфекции достаточно хорошо изучены основные лабораторные диагностические показатели, свидетельствующие об инфицированности (Змушко Е.И. с соавт., 1996). Однако вопросы прогнозирования клинического течения ВИЧ-инфекции требуют дальнейшего изучения. Наибольшее клиническое значение имеет прогноз перехода от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ), а также от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний, который важен для своевременного назначения этиотропных и патогенетических средств (Рахманова А.Г.. Чайка Н.А., 1989).

При поиске новых тестов, которые давали бы представление о состоянии иммунокомпетентных клеток крови при ВИЧ-инфекции, обратила на себя внимание группа сравнительно недавно открытых внутриклеточных белков, получивших название "белки теплового шока" (БТШ) или "стрессовые белки". Эти белки недостаточно изучены, но уже имеющиеся данные говорят, что они высоко консервативны в процессе филогенеза (Lindqulst S., 1986), необычно полифункциональны - играют важную роль во многих внутриклеточных иммунобиохимических процессах как в экстремальных, так и в нормальных условиях (Polla B.S., 1988), что позволяет предположить об участии белков теплового шока в формировании патобиохимических внутриклеточных связей при ВИЧ-инфекции.

В ответ на воздействие неблагоприятных факторов, в том числе и вирусной инфекции, формируется неспецифическая клеточная реакция, которая сопровождается усилением процессов свободнорадикального окисления (Иванова В.В. с соавт., 1992: 1996), синтезом белков теплового шока (Kaufman S.H.E.. 1990) и является одним из механизмов дестабилизации генома клеток-мишеней. В этих условиях немаловажной представляется роль фермента ксантиноксидазы, которая служит генератором свободных радикалов при ряде патологических состояний клетки и является наиболее значимой среди прооксидантных систем, характерных для лимфоидной клетки (Кожемякин Л.А. с соавт.. 1992).

Отсутствие в литературе данных по комплексной оценке процессов дестабилизации генома, сопряженных с активностью свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в иммунокомпетентных клетках крови в динамике развития ВИЧ-инфекции не позволяет определить значимость названных показателей для прогноза клинического течения болезни.

Цель исследования: дать оценку возможности использования показателей белков теплового шока семейства БТШ-70 и комплекса биохимических изменений в мононуклеарах периферической крови в прогнозировании клинического течения ВИЧ-инфекции.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следуюие задачи:

1. Изучить динамику традиционных показателей иммунного стату-а у ВИЧ-инфицированных и определить их прогностическую значимость при переходе клинического течения болезни из одной стадии в другую.

2. Изучить изменения активности ксантиноксидазы, интенсивности процессов свободнорадикального окисления и показателей нестабильности генома мононуклеаров периферической крови при ВИЧ-инфекции и оценить их прогностическую значимость.

3. Разработать методические подходы к созданию иммунологического метода для количественного и качественного анализа белков семейства БТШ-70.

4. Изучить показатели белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови на разных фазах ВИЧ-инфекции.

5. Определить взаимосвязь изменений белков семейства БТШ-70 и комплекса биохимических показателей дестабилизации генома. свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови у больных в динамике заболевания и оценить их значимость для прогноза клинико-манифестных форм ВИЧ-инфекции.

1. Впервые установлено, что нарастание накопления конститутивной изоформы белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных пропорционально степени выраженности клинических проявлений болезни.

2. Показана связь изменения показателей белков семейства БТШ-70 с уровнем нестабильности генома, активностью процессов свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией в процессе развития клинической картины заболевания.

3. Установлено, что изменение состояния белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови адекватно отражает вероятность перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии и от персистирующей генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний.

4. Установлено, что ВИЧ-инфекция вызывает нарушение реакции белков теплового шока (БТШ-70) мононуклеаров периферической крови в ответ на повреждающие воздействия (гипертермия. ультрафиолетовое облучение).

Практическая значимость работы.

Комплекс показателей, отражающих состояние системы белков теплового шока, системы ксантиноксидазы, процессов свободнорадикального и нестабильности генома мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными иммунологическими показателями может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу ПГЛ и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

Изучение показателей белков теплового шока мононуклеаров периферической крови человека как защитного механизма неспецифического действия может может быть применено для оценки эффективности лекарственных средств с иммуномодулирующими свойствами, а также для разработки новых диагностических подходов к прогнозированию иммунодефицитных состояний различной этиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Переход клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний характеризуется увеличением содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови.

2. Изменения содержания белков семейства БТШ-70 в процессе ВИЧ-инфекции происходят на фоне увеличения показателей нестабильности генома, интенсификации процессов свободнорадикального окисления и повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови.

3. Показатели белков семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови в совокупности с традиционными иммунологическими показателями возможно использовать для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

Результаты исследований доложены на XI-й и XII-й научных конференциях молодых ученых академии (ВМедА, Ленинград, 1990; ВМедА, Санкт-Петербург, 1992), на

VI-м Всесоюзном биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1992), на Первой международной региональной конференции по ВИЧ-инфекции "Социальные и медицинские проблемы СПИДа" (Санкт-Петербург, 1994). на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества инфекционистов (Санкт-Петербург, 1996), на IV международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург. 1996), на III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург. 1996). Материалы диссертации использованы в отчетах по теме НИР N 50-93-В12 "Биохимические механизмы формирования иммунодефицитов под влиянием ВИЧ и иммунодиагностика иммунодефицитных состояний больных СПИДом" и по теме НИР N 60-95-П4 "Исследование роли системы белков теплового шока в патогенезе ВИЧ-инфекции".

Реализация результатов работы.

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Результаты работы используются в практике учебного процесса и научно-исследовательской работе кафедры инфекционных болезней, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, в работе НИЛ СПИДа и инфекционных заболеваний в ВС РФ Военно-медицинской академии, кафедры инфекционных болезней Семипалатинского государственного медицинского института, кафедры ЛОР-болезней с курсом аллергологии и иммунологии Чимкентского государственного медицинского института, кафедры инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований. обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 61 отечественный и 140 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 17 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Общая характеристика больных и методов исследования

В процессе работы были обследованы 34 инфицированных и больных ВИЧ-инфекцией, среди которых преобладали лица мужского пола в возрастной категории от 20 до 39 лет. Клиническое наблюдение и обследование больных проводили в больнице N 30 имени С.П. Боткина г.Санкт-Петербурга, Республиканской клинической инфекционной больнице г. Усть-Ижоры Ленинградской области, в Центре по борьбе и профилактике СПИДа г.Санкт-Петербурга.

Больные были распределены по группам в соответствии с клинической классификацией В.И.Покровского (1989). Вич-инфицированных в стадии инкубации и больных в терминальной стадии не обследовали. Контрольную группу составили 25 практически здоровых мужчин (доноров крови) в возрасте от 20 до 39 лет - военнослужащие.

Иммунологические и биохимические исследования проводили в Военно-медицинской академии, определение белков теплового шока - на базе института цитологии Академии наук.

Диагноз ВИЧ-инфекции верифицировали серологически - по наличию в крови специфических антител к ВИЧ с помощью тест-систем для гетерогенного иммуноферментного анализа методом двойных антител (производства фирм СП"ДиаПЛЮС". Россия-Швейцария, СП"Авиценна", Россия-Сирия). Результаты иммуноферментного анализа подтверждали с помощью иммуноблотинга ("Du Pont", США).

Для оценки иммунного статуса у обследованных пациентов изучали следующие показатели: количество лейкоцитов, лимфоцитов; субпопуляции Т-лимфоцитов с помощью проточного цитофлюориметра "EPICS-C" (Coulter elektronics. США-Франция) с применением моноклональных антител фирмы "Ortho Diagnostic Systems"(США): РТМЛ с КонА определяли по методу M.George. J.H.Vaughan (1962); количество В-лимфоцитов, несущих Ig M, G, А, определяли методом иммунофлюоресценции с использованием моноспецифических сывороток к иммуноглобулинам человека; концентрации Ig M. G, А, определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Mancini С. et al.. 1963); содержание циркулирующих иммунных комплексов по методу Ю.А.Гриневича. А.Н.Алферова (1981).

Для исследования системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных была получена панель поликлональных антител. При иммунизации животных и аффинной очистки антител применяли препарат белков БТШ-70. Для получения препарата БТШ-70 использовали белковый экстракт, полученный из мышечной ткани крупного рогатого скота и клеток культуры HeLa. Выделяли препарат методами ионообменной (с DEAE-сефарозой; и аффинной(с АТФ-агарозой) хроматографии. Чистоту полученных белков БТШ-70 проверяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Препарат БТШ-70 имел чистоту около 98% и содержал смесь конститутивной (hsc-70) и индуцибельной (hsp-70) изоформ семейства БТШ-70.

Из иммунной сыворотки кроликов выделяли антитела к БТШ-70 методами высаливания и аффинной хроматографии на колонках со смесью белков hsc-70 и hsp-70. Каждая серия антител подвергалась проверке на специфичность двумя методами - иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Для определения эпитопов БТШ-70, с которыми реагировали полученные антитела, использовали "сэндвич"-метод иммуноферментного анализа и реакция иммунопреципитации с предварительным мечением белков [ 35 S]-метионином. Иммунопреципитаты были подвергнуты одно- и двумерному электрофорезу (Laemli U.K., 1970; O'Farrel P.H.. 1978). Поликлональные антитела использовали в конструкции иммуноблотинга с последующей денситометрией проявленных зон белков, что позволяло полуколичественно оценивать содержание изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови больных.

Для проверки функционального состояния системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови служили нагрузочные тесты In vitro - тепловой шок (прогрев клеток при 43±0.3° С в водяном термостате) и ультрафиолетовое облучение с использованием прибора МД-73 "Изольда".

Определение активности ксантиноксидазы и ее формы в мононуклеарной фракции крови проводили по методу У.Прайор (1979). Уровень процессов свободнорадикального окисления тотально в мононуклеарах периферической крови и отдельно в их ядрах оценивали по содержанию продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, которые определяли по методу M.Uchlyama, M.Michara (1978). В качестве интегральных биохимических показателей нестабильности генома клеток были избраны относительная доля продуктов деградации хроматина - полидезоксинуклеопротеидов, которые являются фрагментами ДНК, (Parks D.A., Granger D.N., 1986) и интенсивность образования однонитевых разрывов ДНК (Birnboim H.C.. Jewcac J.J.. 1981).

Статистическая обработка цифровых данных осуществляли методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия (t) Стьюдента. В случае малых выборок использовали непараметрические статистические критерии. Расчеты производили с использованием программы STATGRAF (Statistical Graphics System), версия 2.1.

2. Результаты собственных исследований Гуморальный и клеточный иммунитет на разных стадиях болезни

Исследование изменений в иммунной системе при развитии ВИЧ-инфекции имело целью выявить показатели, достоверно изменяющиеся при переходе от одной клинической стадии (фазы) к другой.

Анализ изменений иммунологических параметров больных позволяет заключить, что в динамике ВИЧ-инфекции, в первую очередь, происходит прогрессирующее снижение функциональной состоятельности иммунной системы по мере развития клинической картины заболевания. Выявленная дефектность иммунного статуса касается, прежде всего. Т-системы иммунитета. Однако далеко не все исследованные традиционные иммунодиагностические параметры в своей динамике достоверно отражают начало перехода от бессимптомной фазы заболевания к манифестным стадиям. Достоверное различие между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдалось у следующих показателей:

- при переходе от бессимптомной фазы (IIБ) к ПГЛ (IIB) - увеличение относительного содержания лимфоцитов от 39,00±2,13 до 45,92±1.96% (р 9 /л (p 6 клеток (р 0 С. Индекс hsp-70 TШ/hsp-70 N характеризует реакцию клетки на экстремальное воздействие синтезом и накоплением индуцибельной изоформы. по которому косвенно можно судить об адаптивной состоятельности исследованных клеток. Достоверное уменьшение индекса hsp-70 TlB/hsp-70 N наблюдается в обоих переходах клинических стадий: ПБ - IIB от 4,23 до 3.42 (р 0,05).

4. Белки теплового шока семейства БТШ-70 индуцируют образование поликлональных антител высокой специфичности и аффинности, распознающих один или несколько смежных сайтов на нативных молекулах белков, что исключает возможность использования полученных иммуноглобулинов в конструкции иммуноферментных тест-систем для количественного определения БТШ-70. но допускает их применение в методе иммуноблотинга.

Все живые клетки отвечают на повышение температуры и некоторые другие стрессовые воздействия синтезом специфического набора белков, называемых белками теплового шока (БТШ). У ряда бактерий обнаружена универсальная адаптивная реакция в ответ на различные стрессовые воздействия (высокие и низкие температуры, резкий сдвиг рН и др.), проявляющаяся в интенсивном синтезе небольшой группы сходных белков. Такие белки получили название белков теплового шока, а само явление - синдром теплового шока.

Работа содержит 1 файл

Магнушевская и Умудова.doc

Выполнили: Магнушевская Е.К., Умудова Э.И.

1 – слайд. Название.

2 – слайд. План

3 – слайд. Введение.

Белки теплового шока (англ. HSP, Heat shock proteins) — это класс функционально сходных белков, экспрессия которых усиливается при повышении температуры или при других стрессирующих клетку условиях.

Повышение экспрессии генов, кодирующих белки теплового шока, регулируется на этапе транскрипции. Чрезвычайное усиление экспрессии генов, кодирующих белки теплового шока является частью клеточного ответа на тепловой шок и вызывается в основном фактором теплового шока (HSF англ. heat shock factor). Белки теплового шока обнаружены в клетках практически всех живых организмов, от бактерий до человека.

4 – слайд. Введение.

Этот феномен свойственен всем организмам, и его молекулярный механизм практически идентичен у бактерий, архей и эукариот. При повышении температуры клетка начинает синтезировать белки теплового шока, к которым прежде всего относятся молекулярные шапероны (DnaK, GroEL) и АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP). Эти белки выполняют две основные функции - обеспечивают фолдинг (сворачивание в нативную конформацию) и деградацию поврежденных белков. Несмотря на полную противоположность этих двух функций результат их осуществления один – ликвидация поврежденных (и потенциально опасных для клетки) белков. Цитоплазматические протеазы по своей структуре напоминают шапероны - древние машины для фолдинга. И те, и другие распознают экспонированные гидрофобные участки неправильно свернутых или денатурированных белков.

5 – слайд. История открытия БТШ.

Открытие БТШ началось с работ Ф. Ритоззы в 1962 году на политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы. Политенными называются гигантские хромосомы, образованные стопками параллельно упакованных гомологичных нитей хроматина, которых может быть больше 1000. Это позволяет изучать политенные хромосомы под световым микроскопом, различать в них отдельные "диски", соответствующие генам, и наблюдать, как при активации генов плотная структура диска переходит в "пуф" - вздутие, образующееся за счет разрыхления структуры хроматина в активном гене и накопления синтезирующихся молекул РНК. Ф. Ритозза обнаружил, что повышение температуры с 20 до 37С приводит к образованию пуфов там, где они не появлялись при нормальной температуре. Так были открыты гены теплового шока. Правда, позднее было обнаружено, что их можно активировать рядом воздействий и при нормальной температуре. Кодируемые этими генами белки были идентифицированы только в 1974 году. Они получили название БТШ. Вскоре выяснилось, что синтез БТШ в ответ на увеличение температуры характерен для клеток всех типов живых организмов: бактерий, грибов, животных всех уровней организации, человека, низших и высших растений.

БТШ у всех организмов представлены большим набором полипептидов, и их принято именовать в соответствии с молекулярной массой, выраженной в килодальтонах (кД). Например, БТШ с молекулярной массой 70 кД называют БТШ70. О существенной роли БТШ в жизни клеток говорит их высокая консервативность в эволюции. Например, БТШ70 имеет высокое сходство аминокислотной последовательности у насекомых, птиц, млекопитающих, грибов и растений. Отдельные участки в БТШ70 сохраняют свыше 90% гомологии у бактерий и человека.

6 – слайд. Классификация БТШ.

Согласно современной классификации, в основу которой положены различия в молекулярных массах, выделяют пять основных классов Hsp: Hsp100,90,70,60 и малые Hsp. Каждый из этих классов белков выполняют характерные функции. Так, белки семейства Hsp70(как и их бактериальный аналог DnaK), взаимодействуют с вновь синтезируемой на рибосомах полипептидной цепью, предотвращая преждевременное неправильное сворачивание незрелой полипептидной цепи и участвуют транспорте белка к определённым органеллам. Белки класса Hsp100 являются близкими родственниками белков теплового шока с молекулярной массой 70кДа и выполняют защитную функцию, предохраняя организм в условиях стресса. Hsp90 образует сложный комплекс с несколькими вспомогательными белками. Такой комплекс взаимодействует с рецепторами стероидных гормонов, обеспечивает эффективное связывание гормона с рецепторами и последующий перенос гормон – рецепторного комплекса в ядро. Помимо этого, белки класса Hsp70 участвуют в направленном переносе нескольких типов протеинкиназ к участкам их функционирования. Белки семейства Hsp60 могут учавствовать в фолдинге сложно устроенных многодоменных белков, а также в АТФ – зависимом исправлении ошибок в структуре частично денатурированных белков.

7 – слайд. Молекулярные шапероны

Эти белки обеспечивают правильный фолдинг синтезируемых белков за счет энергии гидролиза АТФ. Они особенно важны у прокариот, где фолдинг обычно не является котрансляционным. Шапероны могут также вернуть в нормальную конформацию многие денатурированные белки (накапливающиеся при многих стрессах, включая тепловой шок), а также предотвращают агрегацию олигомеров и обеспечивают их разделение. Наконец, шапероны участвуют в секреции, поддерживая секретируемые белки в развернутом состоянии. Шапероны из семейств Hsp70 и Hsp60 присутствуют в цитоплазме в наибольших количествах. Гомологом Hsp60 у E. coli является GroEL, формирующий гигантский комплекс с GroES, в центральной полости которого целиком может поместиться белок размером до 55 кДа. GroES-GroEL комплекс имеет существенное сходство с эукариотической 26S протеосомой, ответственной за деградацию меченых убихитином белков. У E. coli гомологом Hsp70 является DnaK, который образует комплекс с кошапероном DnaJ и белком GrpE. E. coli также имеет дополнительные шапероны , такие как SecB, ClpB и IbpAB, взаимодействующие с белками, являющимися плохими субстратами для шаперонов Hsp70 и Hsp60 семейств.

8 – слайд. АТФ – зависимые протеазы.

В отличие от эукариот, где множественные системы мечения белков убихитином направляют различные субстраты к единственной цитоплазматической протеазе (26S протеазе), за распознавание субстрата у прокариот отвечают сами протеазы, поэтому их в клетке, как правило, несколько (порядка шести). Энергозависимые протеазы представляют собой, как правило, крупные олигомерные комплексы. Для всех протеаз этого класса с известной структурой протеазные сайты располагаются во внутренней камере олигомера, вход в которую слишком мал для большинства нативных (свернутых) белков. Поступление субстрата внутрь такой полости обеспечивается регульторными АТФазными доменами (или субъединицами). Не удивительно, что именно АТФазные субъединицы отвечают за субстратную специфичность. Аминокислотные последовательности АТФазных субъединиц разных протеаз имеют сходство, которое может свидетельствовать о сходстве механизмов их действия. Поскольку распознавание субстратов осуществляется регуляторными АТФазами, свойства субстратов приводящие к их деградации, не зависят от свойств, необходимых для разрезания пептидных связей. Как только белок распознается и связывается регуляторным АТФазным доменом, начинается последовательная деградация полипептидной цепи с разрезами через каждые 5-10 аминокислот

9 – слайд. АТФ – зависимые протеазы.

ClpAP ClpXP

У этих протеаз АТФазная и протеазная активность принадлежат разным субъединицам, и неудивительно, что эти субъединицы способны действовать самостоятельно. ClpA и ClpX могут действовать как шапероны. Гены clpX и clpP составляют оперон, clpA расположен отдельно в моноцистронном опероне. Оба оперона имеют типичные промоторы теплового шока.

Zn и АТФ-зависимая протеаза, участвующая в деградации цитоплазматических и мембранных белков, включая RpoH, SecY (часть аппарата секреции). Единственная АТФ-зависимая протеаза, существенная для жизни E. coli. В опероне с RpoH-зависимым промотором.

Деградирует белок N фага λ, ингибитор клеточного деления SulA, позитивный регулятор биосинтеза капсулы RcsA и др. Кроме специфических мишеней, Lon деградирует большинство аномальных белков E. coli. Белок – гомотетрамер, имеет сайты связывания с АТФ и ДНК, причем связывание с ДНК стимулирует протеазную активность. Транскрибируется с промотора теплового шока. В белке можно выделить два домена – собственно протеазный с карбоксильного конца с сериновым остатком в активном сайте и следующий за ним АТФазный. Экспериментально показано, что эти два домена могут быть экспрессированы как отдельные полипептиды, смесь которых функционально соответствует интактной протеазе Lon.

10 – слайд. Регуляция теплового шока у B. subtilis

Гены первого класса (регулон CIRCE/HrcA) кодируют синтез основных шаперонов DnaKJ-GrpE и GroEL-GroES, и их экспрессия негативно контролируется репрессором HrcA, первым геном оперона DnaK. Действие этого репрессора осуществляется через связывание с оператором – инвертированным повтором CIRCE. Контроль этого регулона осуществляется при участии шаперонов GroEL-GroES. Этот шаперон необходим для фолдинга HrcA, а титрование шаперона образующимися в стрессовых условиях аномальными белками приводит к снижению активности HrcA - 24 и усилению экспрессии оперонов GroE и DnaK. Таким образом, у грамположительных бактерий GroE, а не DnaK играет основную роль в регуляции теплового шока. Репрессор HrcA и CIRCE-элементы быки обнаружены не только у грамположительных, но и у альфа-протеобактерий, цианобактерий, хламидий и спирохет, однако их роль в регуляции теплового шока варьирует.

Кo второму классу относится большая группа (50-100) генов, позитивно контролируемых сигма-фактором общего стресса σB, которые кроме тепла индуцируются еще и голоданием по глюкозе или кислороду. Этот сигма-фактор регулируется сложным каскадом белок-белковых взаимодействий (включая фосфорилирование).

К третьему классу относятся все остальные гены, не имеющие общей системы регуляции.

11 – слайд. Hsp70.

Одними из первых шаперонов стал БТШ Hsp70. Белки этого семейства объединяют одинаковая молекулярная масса и гомология N – концевого фрагмента. Последняя достигает 50% у бактериального DnaK и Hsp70 человека. В одной клетке высших можно одновременно встретить несколько компонентов семейства Hsp70: индуцибельный Hsp70, миохондриальный Mtp70 и резидент эндоплазмотического ретикулума Grp78.

Функции: защитная и иммуномодулирующая.

12 – слайд. Hsp70.

Анализ последовательности гена и позднее структуры самого белка Hsp70 с помощью метода малоуголового рентгеновского рассеяния показал, что молекула Hsp70 молекула Hsp70 состоит из двух доменов – АТФ- и пептидсвязывающего, занимающего соответственно N – C – концевые фрагменты молекулы.

В состав семейства Hsp70 входят белки – помощники такие как:

Белки содержащие J – домен: Hdj1/Hsp40, Hdj2 (узнаёт и связывает белок с измененной структурой и передаёт последней Hsp70)
Нуклеотид – обменщик Bag–1 и Hip
Фактор связывания шаперонов Hsp70 и Hsp90 Hop

(Шаперонный аппарат работает след. Образом. Кошаперон Hdj1 или Hdj2 узнаёт и связывает белок с изменой структурой и передаёт последний Hsp70. Шаперон в момент связывания находится с АТФ форме, т.е. в промежуточном состоянии, в котором он может отпустить субстрат или может вступить с ним в достаточно жёсткий комплекс. В первом случае шаперон не находит никаких изъянов в молекуле субстратного полипептида, а во втором такие изъяны, точнее экспонированные гидрофобные участки, имеются. Процесс захвата субстрата контролируется каким – либо из белков, содержащих J – домен, например Hdj1, который, связывается с АТФазным доменом и С – концевой последовательностью аминокислот EEVD, изменяет конформацию Hsp70; при этом происходят инициация АТФазы шаперона и гидролиз АТФ и комплекс субстрата с Hsp70 в FLA – связанной форме становятся устойчивым. Для высвобождения полипептид отходит, а Hsp70 переходит в промежуточное состояние. Дальнейшая судьба освобождённого полипептида зависит от того, насколько его структура выправилась, и в этом плане имеется несколько сценариев. Во – первых, белок, обретший правильную с точки зрения клетки форму, может транспортироваться в органеллы, где он должен функционировать. Во – вторых, в случае недостаточной эффективности исправления структуры белка он подвергается повторному шаперонированию в основных системах на Hsp70 – Hsp9)

CHIP. ( В середине 1990-х годов появились данные о том, что Hsp70 участвует в направленной деградации белков в 26S – протеасомах. Деградация белков в этих частицах достаточна специфична, и субстратами служат меченные убиквитином белки. Было установлено, что кошаперон Bag – 1 участвует в доставке белковых субстратов в протеасомы и что в этот процесс вовлечён ещё один белок CHIP. В молекуле CHIP имеется мотив TRP, который необходим для взаимодействия белка с С – терминальными областями молекул шаперонов hsp70 и Hsp90 Избыточная экспрессия CHIP приводит к подавлению шаперонной активности Hsp70 специфически на этапе её инициации белком Hdj1 )

13 – слайд. Hsp70.

Основной шаперон Hsp70 с помощью кошаперонов Hdj1 и Bag – 1 осуществляет цикл связывания – освобождения субстратных полипептидов. Обмен АТФ – FLA действует как переключатель конформации Hsp70 до того, как полипептид приобретает свёрнутую форму и шаперон перестаёт его узнавать в качестве субстрата, или до того, как CHIP связывается с комплексом Hsp70 – субстрат. Bag – 1 индуцирует освобождение субстратного пептида из молекулы Hsp70 зависимым от АТФ образом. В то же время CHIP поддерживает шаперон в АТФ – связанном состоянии и каталмзирует убиквитинилирование субстратного белка, отходящего от Hsp70 при содействии Bag – 1.

В работе в сравнительном плане изучено состояние глутатиновой редокс-системы и глутатионредуктазы при перегревании и при охлаждении крыс, как экспериментальной модели стресса, при которой возможна индукция синтеза стрессорных белков – шаперонов. Перегревание вызывали путем содержания животных при температуре +40°С на протяжении 3-х часов. Охлаждение животных осуществляли путем содержания животных при температуре +5°С на протяжения 3-х часов. Проведенными исследованиями обнаружено, что при перегревании и при охлаждении организма животных имеет место практически однотипное изменение функционального состояния одного из компонентов системы стресс-белков – глутатионредуктазы. При перегревании и охлаждении в крови, в печени и в мозге активность глутатион редуктазы снижается. В крови при перегревании баланс в глутатионовой редокс – системе смещается в сторону восстановленных форм, при охлаждении в сторону окисленных форм. В печени при перегревании баланс в глутатионовой редокс – системе смещается в сторону окисленных форм, при охлаждении в сторону восстановленных форм. В головном мозге и при перегревании, и при охлаждении организма, баланс в глутатионовой редокс – системе смещается в сторону восстановленных форм. Анализ полученных результатов подтверждает представление о том, что стрессорная реакция организма сопровождается изменениями функционального состояния компонентов белков теплового шока и связанных с их функцией глутатиновой редокс-системы, необходимой не только для антиоксидантной защиты, но и для фолдинга белковых молекул.

1. Власова С.Н., Шабунина Е.И., Переслегина И.А. Активность глутатионзависимых ферментов эритроцитов при хронических заболеваниях печени у детей // Лабораторное дело. – 1990. – № 8. – С.19-22.

2. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.В. Структура и свойства малых белков теплового шока // Успехи биологической химии. – 2003. – т.43. – С.59-98.

3. Тапбергенов С.О., Тапбергенов Т.С. Гипотеза посттрансляционной трансформации нормальных клеточных прионов РrРC в аномальные РrРSс прионы // Успехи современного естествознания. 2009. – №4.– С. 61.

5. Csermely P., Schnaider T., Soti C., Prohaszka Z., Nardai G. The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review // Pharmacol Ther. 1998. – Aug;79.– №2 – P.129-168.

6. Ellis R.J., Hemmingsen S.M. – Molecular chaperones: proteins essential for the biogenesis of some macromolecular structures // Trends Biochem Sci. 1989. – Aug; 14(8) – Р.339-342.

7. Mehlen P., Kretz–Remy C., Preville X., Arrigo A.P. – Human hsp27, Drosophila hsp27 and human alphaB-crystallin expression-mediated increase in glutathione is essential for the protective activity of these proteins against TNFalpha-induced cell death // EMBO J. 1996.– Jun 3;15– №11 – P.2695-2706.

9. Preville X., Salvemini F., Giraud S., Chaufour S., Paul C., Stepien G., Ursini M.V., Arrigo A.P.– Mammalian small stress proteins protect against oxidative stress through their ability to increase glucose-6-phosphate dehydrogenase activity and by maintaining optimal cellular detoxifying machinery // Exp Cell Res. 1999 – Feb 25; – 247– №1. – P.61-78.

10. Waters E.R., Vierling E. Chloroplast small heat shock proteins: evidence for atypical evolution of an organelle-localized protein // Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 – Dec 7;96– №25. – P.14394-14399.

В 1974 году Тиссиерес и соавт. [2] впервые обнаружили, что в ответ на повышение температуры среды происходит активация синтеза специфической группы белков. Эта группа белков получила название белки теплового шока – шапероны (heat shock proteins, Hsp). Позже было установлено, что синтез этих белков индуцируется не только при повышении температуры, но и при многих других неблагоприятных стрессорных на организм воздействиях, а также под влиянием некоторых гормонов и ростовых факторов. В связи с этим белки теплового шока стали называть стресс-белками [6]. Было установлено, что в ответ на тепловой шок в клетках эукариот включается активация транскрипции всех генов, индуцируемых стрессом, осуществляемая специальным транскрипционным фактором (фактор теплового шока HSF). В клетках, не подвергшихся стрессу, HSF присутствует и в цитоплазме и в ядре в виде мономерной формы, связанной с шапероном Hsp70, и не имеет ДНК-связывающей активности.

В ответ на тепловой шок или другой стресс, Hsp70 отсоединяется от HSF и начинает укладывать денатурированные белки. HSF собирается в тримеры, у него появляется ДНК связывающая активность, он аккумулируется в ядре и связывается с промотором. При этом транскрипция шаперонов в клетке возрастает во много раз. После того, как стресс прошел, освободившийся Hsp70 опять присоединяется к HSF, который при этом теряет ДНК-связывающую активность и все возвращается в нормальное состояние. Аналогичным образом все происходит и при других стрессах. Согласно современной классификации, в основу которой положены различия в молекулярных массах, выделяют пять основных классов шаперонов (Hsp): Hsp100, 90, 70, 60 и малые Hsp (small Hsp, sHsp). Каждый из этих классов белков теплового шока выполняет характерные функции. Белки семейства Hsp60 могут участвовать в фолдинге сложно устроенных много доменных белков (таких как актин или тубулин), а также в АТР-зависимом исправлении ошибок в структуре частично денатурированных белков [8]. Hsp90 образуют сложный комплекс с шаперонами. Такой комплекс взаимодействует с рецепторами стероидных гормонов, обеспечивает эффективное связывание гормона с рецепторами и последующий перенос гормон-рецепторного комплекса в ядро. Помимо этого, белки класса Hsp90 участвуют в направленном переносе нескольких типов протеинкиназ к участкам их функционирования [5].

К последней группе белков теплового шока относятся Hsp с малыми молекулярными массами (sHsp – small heat shock proteins) – малые белки теплового шока, выполняющие множество разных функций в клетке. По данным ряда авторов окислительный стресс сопровождается усиленным синтезом sHsp [9]. В настоящее время большая часть исследователей склоняется к заключению, что sHsp защищают клетку от окислительного шока, хотя в литературе высказывается и противоположная точка зрения. Установлено, что N-концевой домен sHsp состоит аминокислотных остатков богатый метионином. Для всех sHsp хлоропластов этот участок очень консервативен и, по всей видимости, участвует в распознавании субстратов [10]. Предполагают, что sHsp каким-то образом активируют или стабилизируют глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу – фермент, продуктом которого является NADPH [7]. NADPH используется глутатионредуктазой для поддержания нормального уровня восстановленной формы глутатиона, используемого глутатионпероксидазой для разрушения гидроперекисей. Все эти данные указывают на то, что функциональные эффекты шаперонов связаны с тиоловыми системами, через которые обеспечивается их антиоксидантное и другое действие.

Ранее нами была высказана гипотеза посттрансляционной трансформации нормальных клеточных прионов РrРC в аномальные РrРSс прионы [3]. Причиной появления РrРSс является не копирование конформации с ранее поврежденного приона, а связано с нарушением функции шаперонов контролирующих фолдинг полипетидных цепей нормальных прионов и сохранение их нативной структуры. В частности, аномальные РrРSс за счет гидрофобного взаимодействия с гидрофобными радикалами активного центра тиоредоксинредуктазы и глутатионредуктазы, ингибируют эффекты этих ферментов, необходимых для восстановления тиоредоксина и глутатиона. Эти тиоловые соединения необходимы для как для антиоксидантной защиты, так и для правильной укладки полипептидной цепи белковых молекул, а их недостаток блокирует функцию шаперонов, контролирующих формирование вторичной и третичной структуры нормальных клеточных прионов.

С учетом вышеуказанных позиций, о функциональной связи белков теплового шока с активностью тиоловых систем, нами была поставлена задача, в сравнительном плане изучить состояние глутатиновой редокс-системы и глутатионпероксидазы при перегревании и при охлаждении организма животных, как экспериментальной модели стресса, при которой возможна индукция синтеза стрессорных белков – шаперонов.

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на беспородных белых крысах в возрасте 3-3.5 месяца массой тела 160-200 г. Перегревание вызывали путем содержания животных в тепловой вентилируемой камере при температуре +40оС на протяжении 3-х часов. Охлаждение животных осуществляли путем содержания животных в холодовой камере при температуре +5оС на протяжения 3-х часов. О состоянии глутатионой редокс-системы судили по количеству общего, окисленного (GSSG) и восстановленного глутатиона (GSH) которые определяли по Вудворду и Фрею в модификации М.С. Чулковой, описанной С.В. Травиной [4]. Активность НАДФН2–зависимой глутатионредуктазы (ГР) определяли по методу С.Н.Власовой и соавтор [1]. Результаты исследования проанализированы при помощи t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при p Примечание . * – р Примечание . * – различия статистически значимы в сравнении с контролем р Примечание . * различия статистически значимы в сравнении с контролем р

Читайте также: