Аптамеры и биосенсоры на их основе реферат
Обновлено: 07.07.2024
Принципы конструирования биосенсоров. Метод безреагентных электродов и ферментной микрокалориметрии. Примеры промышленного применения биосенсоров. Перспективы применения биосенсоров в медицине. Контроль уровня глюкозы в крови с помощью биосенсоров.
| Рубрика | Коммуникации, связь, цифровые приборы и радиоэлектроника |
| Вид | реферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 12.01.2012 |
| Размер файла | 393,4 K |
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
СодержаниеВступление
1. Принцип работы биосенсоров
2 Принципы конструирования биосенсоров
2.1 Метод безреагентных электродов
2.2 Метод ферментной микрокалориметрии
2.3 Метод хемилюминесценции
2.4 Клеточные биосенсоры
3. Примеры промышленного применения биосенсоров
3.1 Применение биосенсоров в пищевой промышленности
3.2 Использование биосенсоров в медицине
3.2.1 Контроль уровня глюкозы в крови с помощью биосенсоров3.2.2 Перспективы применения биосенсоров в медицине
Список использованной литературы
В последнее десятилетие возникли новые контакты на первый взгляд между очень далекими областями: электроникой и биохимией. Их взаимное проникновение друг в друга создало новую сферу интересов науки - биоэлектронику. Первым шагом в этой области было возникновение новых устройств для анализа и переработки информации, получивших название биосенсоров. Биосенсоры рассматриваются как первое поколение биоэлектронных устройств.
Принцип работы биосенсоров
Большинство биосенсоров ориентированы на анализ биологических жидкостей. Действительно, например, в крови находятся тысячи различных веществ. Задача заключается в том, чтобы быстро и эффективно определить концентрацию нужного соединения (например, глюкозы). Для людей, страдающих диабетом, это жизненно важный клинический анализ. Биосенсоры обеспечивают такую возможность.
Рис.1 Общая схема работы биосенсоров
Функционально биосенсоры сопоставимы с датчиками живого организма -- рецепторами, способными преобразовывать разные типы сигналов, поступающих из окружающей среды, в электрические. Наибольшее распространение сейчас получили биосенсоры на основе ферментов. Среди таких устройств различают субстратные и ингибиторные биосенсоры. С их помощью решают различные медико-биологические задачи и контролируют состояние среды обитания. Чувствительность ингибиторных биосенсоров чрезвычайно высока, например, возможно определение остаточных количеств некоторых пестицидов на уровне 0.01 мкг/л и выше, что несравненно точнее обычных физико-химических методов.
Основными характеристиками, позволяющими биосенсорному анализу успешно конкурировать с традиционными методами, являются оперативность анализа, высокая специфичность и чувствительность при низкой стоимости, отсутствие необходимости использовать дорогостоящую аппаратуру и квалифицированный персонал.
2. Принципы конструирования биосенсоров
Конструктивно любой биосенсор представляет комбинированное устройство, состоящее из двух принципиальных функциональных элементов: биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с другом. Биохимический элемент представляет собой биоселектирующую структуру и выполняет функцию биологического элемента распознавания. В качестве бкохимического преобразователя используют все типы биологических структур: ферменты, антитела, рецепторы, нуклеиновые кислоты и даже живые клетки. Физический преобразователь сигнала, (называемый рансдьюсер) реобразует определяемый компонент, а точнее, концентрационный сигнал, в электрический. Для считывания и записи информации используют электронные системы усиления и регистрации сигнала.
Разработка биосенсоров относится к наукоемким технологиям и представляет одну из ветвей современной биотехнологии. В настоящее время существует несколько типов биосенсоров. Наибольшее развитие получили ферментные и клеточные биосенсоры. Например, ферментные электроды, ферментные микрокалориметрические датчики, биодатчики на основе хеми-- и биолюминесценции.
2.1 Метод безреагентных электродов
Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной по составу смеси, не прибегая ни к каким долнительным операциям, связанным с использованием других реагентов, концентрированием и т.д. (отсюда и название безреагентные методы анализа).
Безреагентные электроды используют электрохимический способ определения веществ, образующихся в ходе ферментативного превращения. Он представляет собой электрод с нанесенным поверхностным слоем (каким-либо природным полимером), содержащим один или несколько иммобилизованных ферментов (иногда фермент может находиться в растворимом состоянии в приэлектродном слое, окруженном мембраной). В зависимости от типа взятого за основу электрода подразделяются на потенциометрические и амперометрические.
Рис. 2 Схема работы безагрегатного электрода на примере детектора глюкозы
Прохождение ферментной реакции на поверхности электрода приводит к изменению потенциала на самом электроде, что регистрируется устройством как информационный сигнал.
2.2 Метод ферментной микрокалориметрии
Ферментные микрокалориметрические датчики используют тепловой эффект ферментативной реакции. Состоит из двух колонок (измерительной и контрольной), заполненных носителем с иммобилизованным ферментом и снаряженных термисторами. При пропускании через измерительную колонку анализируемого образца происходит химическая реакция, которая сопровождается регистрируемым тепловым эффектом. Данный тип датчиков интересен своей универсальностью.
Рис.3 Схема работы ферментного датчика
2.3 Метод хемилюминесценции
Хемолюминесцентные датчики -- регистрируют световое излучение с различной длиной волны, испускаемое продуктами ферментативной реакции, находящимися в возбужденном состоянии. Конструкция включает колонку с иммобилизованными на носителе ферментами и светопринимающее устройство. Заложенный в систему этого типа датчиков аналитический метод характеризуется, прежде всего, крайне высокой чувствительностью -- позволяет определять фемтомольные (10-12 моль/литр) количества вещества. Благодаря своей простоте и высокой точности такой метод получил широкое распространение.
Рис. 4 Схема работы хемилюминесцентного датчика
2.4 Клеточные биосенсоры
Одно из достижений биотехнологии связано с развитием методов включения живых клеток в полимеры и твердые носители различной природы, и применение такого рода материалов для решения задач медицины, управляемого биосинтеза, анализа. Иммобилизованные клетки обладают рядом полезных свойств:
1) Клетки являются доступным и дешевым биологическим материалом. Используют клетки растений, животных, человека, но наибольшее применение нашли клетки микроорганизмов.
2) Культивируемые клетки легко воспроизводятся и поддерживаются в чистой культуре. В отличие от ферментов при использовании клеток не требуется дорогостоящих стадий очистки. Клетки сохраняют, как правило, все системы жизнеобеспечения. Это позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы.
3) Клетки обладают высокой специфичностью к определенным веществам, наличие или отсутствие которых приводит к изменению свойств клеток, что в дальнейшем регистрируется разными способами
Рис. 5 Схема работы клеточного биосенсора
биосенсор микрокалориметр электрод
Имеющиеся методы иммобилизации: позволяют получить клетки, сохраняющие немногим менее 100% активности ферментов и способные функционировать достаточно длительные промежутки времени. Клетки сохраняют все наиболее важные структуры и проявляют большую стабильность. В некоторых случаях клетки сохраняют жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет.
Например: для создания биосенсоров используют микроорганизмы Neyrospora europea для определения аммиака - Trichosporon brassicae - для определения уксусной кислоты, Sarcina flava -- для определения глутамина, Azoiobacier vineiaudii -- для определения нитратов и другие.
Для иммобилизации клеток с сохранением их активности первоначально использовали материалы природного происхождения: желатину, агар, альгинат кальция, каррагенан. В последние годы разработаны и развиты методы включения живых клеток в синтетические полимерные гели. Особенно интересные и перспективные результаты получены с использованием так называемого метода криоиммобилизации клеток. Процедура крио-иммобилизации состоит из стадии получения суспензии клеток: в растворе полимера, замораживания суспензии с получением криоструктурированных гелей, размораживания с образованием пористого, механически прочного материала, устойчивого до температур 70-80°С. Клетки, включенные в такого рода пористый материал, сохраняют активность и способны функционировать в течение нескольких месяцев.
3. Примеры промышленного применения биосенсоров
3.1 Применение биосенсоров в пищевой промышленности
Чаще всего в пищевой промышленности используются сенсоры для определения крахмала, сахаров и этилового спирта, поэтому именно они будут рассмотрены в данной главе. Ферментные сенсоры для оценки содержания этанола могут быть основаны на алкогольдегидрогеназе либо на алкогольоксидазе, иммобилизованных на соответствующем преобразователе. Амперометрический биосенсор для определения этанола в парах на основе алкогольдегидрогеназы и никотинамидадениндинуклеотида (NAD + ) в качестве ко-фактора. Этанольный биосенсор на основе алкогольоксидазы и кислородного электрода Кларка. Диапазон измерений охватывал область концентраций от 0.05 до 10 (мили моль / литр). Определение крахмала может осуществляться как с помощью ферментных сенсоров, так и сенсорами на основе клеток микроорганизмов. Как правило, схема анализа в этом случае включает гидролиз крахмала амилолитическими ферментами ( a-амилаза, глюкоамилаза) до глюкозы и последующую детекцию глюкозы амперометрическим сенсором на основе глюкозооксидазы или микробных клеток. Более того, для решения такой задачи, как оценка общего содержания утилизируемых сахаров в сбраживаемом сусле, использование биосенсора на основе микробных клеток может оказаться более предпочтительным, поскольку широкая субстратная специфичность микроорганизмов может позволить выполнить интегральную оценку суммарного присутствия сахаров.
3.2 Использование биосенсоров в медицине
В настоящее время биосенсоры находят самое широкое применение в медицине. Ферменты все больше используются для рутинного автоматизированного анализа содержания метаболитов, лекарств и гормонов в биологических жидкостях человека. Это особенно необходимо для клинической диагностики. Благодаря использованию биосенсоров снижается риск ошибок при постановке диагноза, а также уменьшаются затраты, поскольку биосенсоры широко распространены и доступны. Диагностика с помощью биосенсоров позволяет врачам-терапевтам проводить анализы непосредственно в их кабинетах, не прибегая к услугам лабораторий. При этом экономятся деньги, и пациентам не нужно повторно приходить к врачу за диагнозом. Кроме того, можно быстрее начать лечение. Еще одно преимущество состоит в том, что труднее перепутать, потерять или загрязнить пробу. Это особенно важно при анализах на содержание допинга у спортсменов. Полицейские и врачи уже используют специальные наборы для выявления небольших количеств наркотиков в крови людей. Т.к. многие ферментативные реакции сопровождаются выделением тепла то для их определения также можно воспользоваться биосенсорами. Термобиосенсоры регистрируют изменения температуры в 0,0001 °С. Их можно использовать для обнаружения молочной кислоты.
3.2.1 Контроль уровня глюкозы в крови с помощью биосенсоров
Примером биосенсора, который широко используется, является прибор для определения содержания глюкозы в крови больных диабетом. Пример такого детектора приведен на рис.6.
Рис.6 Общий вид детектора глюкозы в крови
Принцип действия таких приборов достаточно прост: образец исследуемой жидкости помещается на тестовую полоску и вводится в анализатор. Биосенсор содержит фермент глюкозооксидазу в иммобилизованной форме. Фермент окисляет глюкозу в крови; при этом высвобождаются электроны, образующие электрический ток, который пропорционален количеству глюкозы, присутствующей в крови. Биосенсор очень чувствителен; он позволяет измерять концентрацию глюкозы в одной капле крови и выдает результат через 20 с.
3.2.2 Перспективы применения биосенсоров в медицине
3.3 Применение биосенсоров в других областях
Предполагается, что в будущем биосенсоры будут широко применяться в сельском хозяйстве, ветеринарии, в качестве средств защиты человека (для обнаружения нервно-паралитических газов, токсинов и взрывчатых веществ) и окружающей среды (главным образом, для выявления загрязнений). Во всех этих сферах использования биосенсоров увеличивается ежегодно примерно на 30%.
Кратко затрагивая экономическую сторону биосенсорной технологии отметим, что в настоящее время три конкурирующие фирмы - Эббот (Англия), Байер (Германия) и Бёрингер (Германия) являются доминирующими в производстве биосенсоров и в общей сложности выпускают около 2/3 всей биосенсорной продукции в мире. В целом современная биосенсорная техника развивается исключительно быстрыми темпами; созданы биосенсоры для определения более 100 различных веществ.
Список использованной литературы:
1.Алейников А.Ф., Цапенко М.П. О классификации датчиков // Датчики и системы, 2000, № 5, С. 2-3.
2. Каттралл Роберт В. Химические сенсоры. - М.: Научный мир, 2000. - 57с.
3. Како Н., Яманэ Я. Датчики и микро-ЭВМ. - Л.: Энергоатомиздат. Ленингр. отделение, 1986.
4. Карубе И., Тёрнер Э., Уилсон Дж. Биосенсоры. М.: Мир, 1992.
5. Seitz W.R. Fiber Optics Sensors // Anal. Chem. 1984. Vol. 86, № 1. P. 16 A.
Подобные документы
Особенности применения дросселей переменного тока для конструирования радиоэлектронной аппаратуры. Назначение дросселей. Параметры и примеры типовых конструкций. Эквивалентная схема дросселя высокой частоты. Магнитопроводы дросселей. Нагрев и охлаждение.
реферат [331,8 K], добавлен 14.01.2017
Проектирование современных электронных средств и характеристика существующих методов их конструирования. Государственные стандарты оформления конструкторской документации, их учет и хранение в бюро технической документации. Виды носителей информации.
контрольная работа [60,0 K], добавлен 15.09.2010
Порядок и этапы конструирования антенн СВЧ. Особенности применения ФАР для построения сканирующих остронаправленных антенн, методика подбора соответствующих параметров. Выбор и расчет схемы питания, фазовращателей. Определение кодов управления фазой.
курсовая работа [66,2 K], добавлен 24.04.2009
Наименование, назначение и область применения изделия, предъявляемые к нему требования по технологичности и экологической безопасности. Принцип работы блока. Выбор метода конструирования и конструкционных материалов. Расчет массогабаритных характеристик.
курсовая работа [185,5 K], добавлен 09.08.2015
Физика нанопроводов, их классификация и способы получения. Примеры получения нонопроводов из конкретных материалов. Нанопровода из оксида марганца в качестве электродов аккумуляторной батареи. Особенности применения нанопроводов из оксида титана.
реферат [2,9 M], добавлен 19.01.2015
Анализ схемы электрической особенности высококачественного усилителя мощности звуковой частоты, его конструктивные элементы и функциональное назначение. Выбор элементарной базы, конструкции, покрытия, а также основные принципы компоновки печатной платы.
курсовая работа [1,4 M], добавлен 15.09.2014
Создание эстетических свойств для обеспечения удовлетворения эстетических требований людей. Формообразование промышленных изделий по специфическим законам проектирования промышленного изделия. Создание и подбор оптимального цветового решения изделия.
Биосенсоры – компактные устройства для распознавания тех или иных молекул. Они состоят из биологической составляющей, например, аптамеров или антител, и компонента, генерирующего сигнал. Аптамеры – небольшие молекулы РНК или ДНК, специфически связывающиеся с мишенями различной природы. В отличие от антител, аптамеры к мишени можно подобрать, даже если она является токсичной или просто неиммуногенной, поскольку они получаются и накапливаются синтетическим путём (в ПЦР). Работающий на основе аптамеров биосенсор называют аптасенсором. Благодаря своей химической структуре аптамеры устойчивы к различным воздействиям, что облегчает их хранение и использование, их способность связываться с мишенью не снижается при химической модификации, которая может потребоваться, например, для закрепления аптамера на носителе. В чувствительности аптамеры не уступают антителам. Некоторые аптасенсоры можно использовать многократно – аптамеры связываются с мишенями обратимо.
Аптасенсоры работают на самых различных принципах детекции, в зависимости от особенностей мишени, требований к их чувствительности и условиям их использования. Здесь мы рассмотрим некоторые из способов работы с аптасенсорами, то есть способы оценить связывание аптамера с мишенью. В простейшем случае аптамер непосредственно связывается с мишенью и претерпевает конформационные изменения. В результате меняется: размер или вес молекулярного комплекса, куда входит аптамер, способность аптамера связываться с различными молекулами или наночастицами. В других случаях используются разнообразные метки и способы усиления сигнала. В зависимости от технологии, сигнал возникает в ответ на наличие или отсутствие аналита в среде. Аптасенсор, отвечающий на отсутствие мишени будет менее чувствителен, но он лучше подходит для случаев, когда взаимодействие аптамера и мишени характеризуется низкой афинностью.
В электрохимических биосенсорах аптамеры наносятся на электрод. Связанные на носителе аптамеры имеют подвижную гибкую структуру, но принимают более устойчивую конформацию при связывании с мишенью. Изменение положения заряженной молекулы, которая присоединена к аптамеру, относительно электрода, происходящее в этот момент, выявляется по изменению потенциала на электроде. Чтобы сделать такой метод точнее можно полностью блокировать взаимодействие метки и электрода, например, добавить в молекулярный комплекс ДНК, комплементарную аптамеру, благодаря чему аптамер перестанет быть гибким, и, пока он не свяжет мишень, заряженная метка будет держаться на постоянном расстоянии от электрода. Другой вариант конструирования биосенсора на каком либо носителе, например на поверхности электрода не требует меток и мало зависит от конформации аптамера. На носителе закрепляются цепи ДНК, комплементарные аптамера, и на них связывается аптамер. В присутствии мишени аптамер покидает молекулярный комплекс и физические характеристики поверхности изменяются, что ведёт к изменению сигнала. Похожую методику можно применить не только в электрохимическом аптасенсоре: в аптамер могут быть включены флуоресцентные метки для визуализации его отсоединения от носителя.
Одноцепочечная ДНК, в отличие от двуцепочечной препятствует агрегации золотых наночастиц в солевом растворе. Можно разместить на наночастицах аптамер, связанный с комплементарной цепью, тогда в солевом растворе будет наблюдаться их аггрегация. В таком случае связывание аптамера с мишенью делает наночастицы устойчивыми к агрегации. Изменение цвета раствора при этом можно увидеть невооружённым глазом, хотя точно оценить изменения можно с помощью более точных приборов – колориметров. Аптамеры могут обладать энзиматической активностью, в частности, пероксидазной, и, в несвязанном состоянии катализировать реакции, в частности, с образованием цветного продукта. Таким образом можно оценить присутствие мишени аптомера в материале по интенсивности накопления окрашенного продукта, то есть также колориметрически.
Флуоресцентные метки в аптасенсорах могут действовать по-разному. Флюорофор, например, может быть связан с аптамерами, закреплёнными на золотых наночастицах. В таком состоянии он не флуоресцирует. Если в среде есть мишень аптамера, она вытеснит флюорохром их комплекса и можно будет обнаружить флуоресцентный сигнал. Существует и такой вариант флуоресцнтной детекции, когда аптамер связывается с ДНК-зондом и флуоресцентным соединением, которое может флуоресцировать только в присутствии двуцепоченой ДНК, ДНК-зонд, позволяющий структуре существовать в виде двуцепочечной ДНК, вытесняется нефлуоресцирующим аналитом из исследуемого образца, по затуханию флуоресценции можно оценить содержание аналита. Аптамеры, соединённые с флюорохромом и гасителем, наподобие зонда beacon включают шпильки, сближающие гаситель и светящуюся молекулу, которые размыкаются при связывании с мишенью. Размыкание шпильки приводит к устранению ингибирования флуорисцентного сигнала. Аптамер также можно связать с флюорохромом и гасителем, но только чтобы они взаимодействовали при связывании аптамера с мишенью, тогда флуоресценция будет свидетельствовать об отсутствии мишеней в изучаемом материале.
Другой физический метод реализован в волноводных аптасенсорах. Константа распространения света через волновод изменяется при абсорбции молекул на его поверхности волновода. Цветовая метка аналита повышает чувствительность волноводного аптасенсора. Чувствительность волноводных сенсоров в 4 раза превышает чувствительность аптасенсоров с детекцией поверхностного плазмонного резонанса. Использование перворированного носителя увеличивает чувствительность ещё в 5-10 раз. Повышается чувствительность метода и при использовании флуоресцентных красителей.
Возможно использование в аптасенсоре и усиления сигнала, как это делается при иммунофлуоресцентном анализе: к захваченной аптамером мишени присоединяются меченные вторичные аптамеры или антитела. Есть и другой способ усиления сигнала. Аптамер конструируется так, чтобы в его состав входил одноцепочечный участок и участок, формирующий шпильку. При связывании с лигандом такая шпилька раскроется, после чего на неё может сесть праймер, с помощью которого можно накопить фрагмент путём ПЦР. После накопления двуцепочечного продукта его можно выявить с помощью красителя, светящегося при взаимодействии с двуцепочечной ДНК.
Разнообразие методов детекции позволяет конструировать различные аптасенсоры, приспосабливая их под разнообразные задачи медицины, промышленности, судебной экспертизы. Они дают возможность быстро проводить исследование, в ряде случаев, оборудование для него можно выполнить в компактном варианте и использовать вне лаборатории. Однако, в настоящее время это направление только развивается и широкого внедрения в практику аптасенсоры пока не получили.
Началось все с того, что Татьяна Замай, профессор Сибирского федерального университета (СФУ), поехала на стажировку в Канаду, где познакомилась с профессором Максимом Березовским, кстати, выпускником Новосибирского госуниверситета, ныне работающим в Университете Оттавы. Одна из тем возглавляемой им исследовательской группы – развитие биосенсоров на основе аптамеров – очень ее заинтересовала. В России в то время никто ничем подобным не занимался. Почему бы не начать развивать это направление в Красноярске?
– Все знают про белковые антитела, их используют при диагностике в лабораториях, – объясняет Анна Замай. – ДНК-аптамеры – аналоги белковых антител. По функциональным характеристикам они абсолютно одинаковы. Даже по особенностям работы очень похожи. Однако аптамеры имеют несколько преимуществ: белок требовательный к условиям хранения, дорогой в производстве. А аптамеры с известной последовательностью нуклеотидов можно легко и довольно дешево синтезировать в любых количествах. Можно модифицировать их флуоресцентными или другими метками – тогда, связавшись с клеткой опухоли, аптамер выдаст ее присутствие свечением. Можно присоединять к нему лекарства и обеспечивать адресность их доставки. Например, препараты для лечения заболеваний мозга имеют очень нежелательные побочные эффекты, а использование аптамеров позволяет доставить лекарство точно к пораженным тканям и снизить негативное воздействие на здоровые клетки за счет уменьшения концентрации препарата.
– Каким образом вы отбираете нужную последовательность?
Делаем несколько таких раундов, идем раз 10-15 по этому кругу. И дальше проверяем, в каком раунде у нас получились аптамеры, которые лучше всего связываются с желаемыми мишенями – раковыми клетками – и не связываются с остальными клетками. Можно аналогично проверить полученные аптамеры к клеткам других видов опухоли. Чем строже негативная селекция, тем лучше получаются аптамеры.
Дальше проводим секвенирование, узнаем последовательности нуклеотидов во всех аптамерах, присутствующих в этом пуле. Раньше использовали более простой метод клонирования, картина была не совсем полной. Сейчас мы делаем полногеномное секвенирование и получаем абсолютно все последовательности. Выбираем методами биоинформатики целые семейства аптамеров, а из них те, которые встречаются чаще: значит, они лучше связываются с клетками мишени.
О возникновении онкозаболевания можно судить по появлению в крови онкомаркеров – белков, характерных для того или иного ракового заболевания. Однако наличие опухоли невозможно определить только по одному-единственному белку. Да и концентрация очень многих известных биомаркеров в крови разных пациентов даже с одним и тем же диагнозом сильно варьирует. У одного страдающего раковым заболеванием эта концентрация очень высокая, у другого – низкая, но это не значит, что у него нет рака! И болезнь можно упустить. Поэтому сейчас ученые пришли к тому, что для более точной диагностики необходим комплекс различных биомаркеров – сигнатура. Однако не все онкомаркеры, что применяются сейчас, обладают достаточной специфичностью, то есть у них отсутствует строгая избирательность по отношению к мишеням, с которыми они связываются. Мультиплексная система с использованием шести аптамеров, полученных к опухолевой ткани, позволит диагностировать рак более точно.
– Рак – индивидуальное заболевание; одинаковая по названию опухоль на самом деле у каждого своя, – поясняет Анна Замай. – У кого-то из больных одних белков-биомаркеров больше, у кого-то – других. Поэтому для того, чтобы поставить точный диагноз, необходимо комплексное исследование. И, соответственно, мультиплексный биосенсор.
Принцип работы электрохимического биосенсора для диагностики онкозаболеваний на основе ДНК-аптамеров
Поскольку работа проводится в тесном сотрудничестве с врачами-онкологами Красноярского краевого онкологического диспансера им. А.И.Крыжановского, ученые точно знают, какой результат нужен для использования в клинической практике.
К третьему этапу проекта, на котором предстоят секвенирование и синтез аптамеров, мультиплексный сенсор, как ожидается, уже будет готов, и можно будет проводить его испытания.
– В чем особенность наших исследований? Мы выбираем аптамеры именно к тканям, – говорит А.Замай. – Из онкодиспансера в лабораторию поступают образцы опухолевых тканей после операций, и мы ищем аптамеры непосредственно к ним. Этический комитет прошли, тут все нормально. В России получением новых аптамеров по-прежнему занимаются мало, изучение их, в основном, идет с позиций фундаментальной науки и пока без видимого практического выхода. За границей в подобных исследованиях используют белки или клеточные культуры: получив от какого-то пациента колонию клеток, многократно ее культивируют. Конечно, полученная после длительного культивирования клеточная линия уже сильно отличается от клеток первоначальной опухоли. Мы же, повторюсь, работаем на свежем послеоперационном материале. Аптамеры, которые мы получаем, очень часто – мы проверяли! – не связываются с культурами, зато очень хорошо связываются с больными клетками – и циркулирующими в крови, и выделенными из опухоли. И наоборот, аптамеры, полученные для культур, плохо работают на клинических образцах.
В материале упоминается COVID-19. Доверяйте проверенной информации из экспертных источников — изучите ответы на вопросы о коронавирусе и вакцинации от врачей, учёных и научных корреспондентов.
Нуклеиновые кислоты также могут образовывать высокоспецифичные комплексы с белками. Такие искусственные короткие одноцепочечные ДНК и РНК, прочно и избирательно связывающиеся с конкретными молекулярными мишенями, назвали аптамерами (от лат. aptus – подходить, соответствовать). Они имеют огромные перспективы в медицине в качестве ингибиторов различных клеточных белков: ферментов, рецепторов и регуляторов активности генов, а также для диагностических целей.
Создание искусственных РНК и ДНК с заданными свойствами стало возможным благодаря появлению метода ПЦР, позволяющего размножать нуклеиновые кислоты в неограниченных количествах (именно этот метод используется при тестировании на коронавирусную инфекцию), а также технологий молекулярной селекции.
Суть технологии в том, что сначала химико-ферментативными методами создаются так называемые молекулярные библиотеки небольших случайных последовательностей нуклеиновых кислот (олигонуклеотидов), содержащие огромное множество разнообразных молекул РНК или ДНК. Затем из этого множества по способности специфично взаимодействовать с целевой молекулой отбирают нужные последовательности и нарабатывают их в необходимом количестве, при этом искомая последовательность может быть представлена в составе библиотеки в единственном числе
Уже сейчас на основе аптамеров разрабатывается целый ряд терапевтических средств, которые могут составить конкуренцию классическим лекарственным препаратам. Примером может служить первый терапевтический аптамер – макуген для лечения заболеваний сетчатки глаза, который уже используется в клинической практике. А множество других препаратов (антикоагулянты, лекарства против аутоиммунных и онкологических заболеваний) проходят клинические испытания.
Аптамеры обладают высоким потенциалом в диагностике, терапии и системах доставки лекарств, но их также можно использовать в качестве противовирусных препаратов во время вспышек инфекций. Сегодня с помощью методов молекулярной селекции можно создать аптамеры, которые смогут блокировать функцию любого белка – например, шиповидного S-белка SARS-CoV-2, который коронавирус использует для проникновения в клетку хозяина. Этот вирусный белок считается основной мишенью при разработке противовирусных препаратов и вакцин, и в случае аптамеров механизм их взаимодействия с мишенью будет аналогичен механизму действия нейтрализующих антител, направленных против этого белка.
Традиционно аптамеры выбирают в лабораторных условиях из так называемых молекулярных библиотек, и такая селекция – очень сложный и трудоемкий процесс. Новый подход виртуального дизайна аптамеров SIBDD ( Structure and Interaction Based Drug Design , или дизайн лекарств на основе структуры и взаимодействия) позволяет ускорить и повысить результативность этого процесса.
Сначала с помощью методов компьютерного моделирования с использованием суперкомпьютеров ведется поиск последовательностей нуклеотидов, ответственных за селективное присоединение к мишени. Результаты молекулярного дизайна, основанного на виртуальном скрининге готовых библиотек аптамеров ДНК и направленном мутагенезе для увеличения соответствия структуре белка-мишени, постоянно оцениваются с помощью трехмерного молекулярного моделирования процесса взаимодействия мишени и аптамера, а также определения квантово-механической устойчивости полученных комплексов.
Сейчас с помощью новой технологии исследователи создали модифицированный аптамер Apt31, высокоспецифичный к белку-шипа коронавируса. Эффективность соединения Apt31 с мишенью была доказана с использованием трех различных экспериментальных методов, а сейчас проводится экспериментальная проверка его противовирусных свойств.
Новое соединение является многообещающим кандидатом в качестве противовирусного средства, предотвращающего проникновение вируса в клетки человека, а также диагностического – для выявления вирусных частиц в биологических жидкостях.
Вирус SARS-CoV-2 хорошо изучен, однако сама методология SIBDD в принципе ориентирована на случаи с ограниченной информацией о цели, например, для быстрого реагирования на новые опасные инфекции, когда доступ к образцам ограничен. В такой ситуации первоначальный набор аптамеров к молекулярной мишени может быть получен уже на основе данных лишь о первичной структуре (последовательности) белка. Впоследствии этот набор можно улучшать по мере поступления новых экспериментальных данных, а также адаптировать к новым мутациям патогенов.
Читайте также: