Синтез гена искусственным путем кратко

Обновлено: 02.07.2024

То, что я не могу создать,
Я не в силах понять.
Ричард Фейнман,
лауреат Нобелевской премии по физике

Обычно химики, изучающие природные соединения, в своей деятельности руководствуются следующей логикой: сначала находят новое вещество в природе, затем определяют его функции и структуру и, в конце концов, пытаются синтезировать это соединение в лаборатории, чтобы сравнить свойства природного соединения и его синтетического аналога. Только так можно доказать, что вещество данной химической структуры обладает определёнными свойствами. Но в генетических манипуляциях такой подход долгое время не работал — структура ДНК была уже известна, но обратную задачу не удавалось решить никому.

Бизнес, творящий науку

Одним из пионерских начинаний института Крейга Вентера в 2000-е годы стали так называемые метагеномные проекты. Экспедиции, организованные институтом, проводили популяционный анализ генома различных организмов, живущих в Саргассовом и других морях. Используя геномные технологии, сотрудникам удалось описать генетическое разнообразие подводного царства, открыв при этом тысячи новых генов и новых видов живых существ.

Международной командой успешных исследователей двух отделений института — в Роквилле (штат Мериленд) и в Ла Йолла (штат Калифорния) — помимо Вентера руководят два других выдающихся учёных. Один из них — нобелевский лауреат 1978 года Гамильтон Смит. Нобелевскую премию он получил за открытие, которое положило начало эпохе химических манипуляций с геномом: он выделил рестриктазы — ферменты, разрезающие молекулу ДНК на отдельные фрагменты. Другой руководитель работ — выдающийся микробиолог, представитель известной научной династии Клайд Хатчисон III.

Синтетическая ДНК, состоящая из 1,08 миллиона нуклеотидов, стала самой длинной молекулой, синтезированной когда-либо в лабораторных условиях. Первая в истории синтетическая клетка содержит полностью искусственную хромосому, синтезированную из химических компонентов по компьютерной программе. Это уже не технологии генетической инженерии, когда учёным удавалось изменить или дополнить геном живых существ несколькими генами или набором генов, это — полная пересадка всего генома.

Трансплантация геномов

Эксперимент по созданию искусственной жизни заключался в следующем: учёные синтезировали геном одной бактерии и внедрили его в клетку бактерии другого вида. Полученный организм с оболочкой бактерии-реципиента Mycoplasma capricolum оказался идентичным бактерии-донору — Mycoplasma mycoides. Так впервые достоверно было показано, что ДНК действительно содержит полную информацию о работе всей живой клетки.

Полученные гибриды выглядели, росли и размножались так же, как Mycoplasma mycoides. Ещё один немаловажный признак того, что это была именно Mycoplasma mycoides, — сконструированная бактерия синтезировала белки, свойственные именно этому виду. Правда, от природной синтетическая бактерия всё-таки отличается. Жить и размножаться она может пока только в лаборатории, в специальной питательной среде, в природных условиях бактерия нежизнеспособна.

Микоплазмы — довольно обширная (около 180 видов) группа паразитических бактерий, вызывающих всевозможные болезни у растений, животных и человека. Они обладают рядом свойств, которые делают их удобным объектом для подобных исследований. В отличие от подавляющего большинства других бактерий с маленькими геномами, микоплазмы могут жить вне клеток хозяина, поэтому их можно выращивать в лаборатории. Правда, микоплазмы постоянно нуждаются в интенсивном питании, поскольку у них отсутствуют гены, необходимые для синтеза многих жизненно важных веществ. Наконец, клетки микоплазм не имеют ядра, их генетический материал распределён в цитоплазме. Они окружены лишь тонкой и эластичной плазматической мембраной, через которую довольно легко внедрить компоненты чужеродного генома.

Часто спрашивают, почему нельзя было поместить искусственный геном внутрь собственной клетки? Потому что внутри этой клетки оставались характерные для неё белки, а значит, результаты эксперимента можно было бы объяснить их наличием. То есть появилась бы неопределённость в интерпретации результата.

Зачем нужны синтетические бактерии?

Реакция на исследования в научном сообществе неоднозначна. Многие считают, что о практическом применении технологии говорить преждевременно: одно дело — программировать безъядерные бактерии-прокариоты, а совсем другое — создавать искусственные хромосомы ядерных клеток эукариотов, то есть клеток всех растений, животных и человека. При адаптации технологии к ядерным клеткам возникает слишком много вопросов: как перенести ДНК в ядро, как создать и трансплантировать неядерную генетическую информацию и т. д.

Тем не менее Вентер считает, что выполненные исследования важны для фундаментальной науки, поскольку открывают новые перспективы в изучении происхождения жизни и поиске ответа на вопрос, какие гены отвечают за жизнь и размножение живого существа.

Элемент жизни

Работы в этом направлении ведутся в основном с бактериями рода Mycoplasma. Геномы микоплазм, как уже говорилось, очень малы (от 580 до 1400 тысяч пар оснований) и хорошо изучены. Самый-самый короткий геном у Mycoplasma genitalium. Его длина — около 580 тысяч пар оснований, которые составляют 485 генов.

Предлагаемый гипотетический минимальный набор генов (по последним расчётам группы Вентера — от 310 до 388 генов) должен включать следующие жизненно важные генетические системы микроорганизмов, среди которых: гены трансляции, репликации, репарации, транскрипции; гены, контролирующие анаэробный метаболизм; гены биосинтеза липидов; гены системы транспорта белков; набор генов, обеспечивающих транспорт метаболитов; полный набор генов утилизации нуклеотидов и гены их биосинтеза. Гены биосинтеза аминокислот микроорганизмам-паразитам не нужны.

Фотографии с сайта Института Крейга Вентера (J. Craig Venter Institute)

Вадим Говорун,
доктор биологических наук

Об авторе

Вадим Говорун (слева) и Клайд Хатчисон III на Международной конференции по структурной геномике (Санкт-Петербург, июнь 2010 года). Фото Ольги Белоконевой

Синтез целых геномов — раздел синтетической биологии, которая ставит своей задачей создание организмов с заданными свойствами при помощи современных методов генной инженерии.

Вообще-то, принципы синтетической биологии давно используются и в области индустриальной микробиологии для создания микробов — сверхпродуцентов ценных молекул, и в экологии (например, для создания биосенсоров), и в других областях биологии. Отличие синтетической биологии скорее в том, что это междисциплинарное направление, объединяющее несколько крупных проектов, таких как создание вычислительных устройств на основе живых систем или создание организмов с дизайнерскими геномами, синтезированными de novo .

Как это делается

Наиболее популярный и дешевый амидофосфитный метод синтеза ДНК-цепочек на твердофазном носителе позволяет провести не более 100-200 циклов последовательного присоединения нуклеотидов, причем вероятность ошибочного присоединения с каждым циклом увеличивается. Таким образом, на выходе можно получить короткие одноцепочечные молекулы ДНК (олигонуклеотиды), состоящие максимум из 200 звеньев.

Альтернативой этому методу может стать ферментативный синтез с использованием терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (TdT). Этот фермент работает как ДНК-полимераза, удлиняя цепочку за счет присоединения новых нуклеотидов, но для синтеза ему не нужна матрица. Ферментативный подход может увеличить точность синтеза, но, судя по всему, не длину готового продукта. Пока что максимальная длина цепочки, полученной таким образом, составила 150 нуклеотидов. Кроме того, для коммерческого использования технология пока недоступна.

Несмотря на ограничение по длине, такая продуктивность синтеза до недавних пор устраивала большинство пользователей. Короткие цепочки ДНК используются во множестве биологических приложений — в качестве затравок для полимеразной цепной реакции, в качестве зондов для детекции последовательностей, подавления экспрессии генов и мутагенеза. Тем не менее, появление синтетической биологии привело к росту конкуренции на рынке синтеза, в результате чего цены заметно упали. Заказать синтез целого гена длиной в несколько сотен или тысяч нуклеотидов теперь может позволить себе большинство исследовательских лабораторий.

Чтобы синтезировать даже единственный ген, на старте придется иметь дело с большим количеством коротких олигонуклеотидов. На этапе дизайна эксперимента последовательность ДНК разбивают так, чтобы последовательности этих олигонуклеотидов перекрывались друг с другом. Дальше олигонуклеотиды смешивают по несколько штук и объединяют при помощи полимеразной цепной реакции. Этот метод тоже был изобретен еще в конце 80-х и так сильно подстегнул развитие молекулярной биологии, что за его разработку вручили Нобелевскую премию.

В реакции, состоящей из множества циклов последовательного разделения и отжига цепочек друг на друга, используется термостабильная ДНК-полимераза, которая достраивает вторую цепь ДНК на одноцепочечной матрице. В результате короткие перекрывающиеся кусочки можно не только сшить друг с другом, но и многократно копировать.

Большие фрагменты генома кишечной палочки были собраны таким же образом. Однако для создания промежуточных форм хромосомы пришлось полагаться на рекомбинацию в клетках самой бактерии. Обычно небольшие фрагменты ДНК несложно встроить в бактериальный геном, однако для встройки кусков ДНК размером по 100 тысяч пар оснований пришлось применять метод на основе CRISPR с внесением двуцепочечных разрывов.

Что синтезируется

Сборка генома микоплазмы в дрожжах из 25 отдельных перекрывающихся фрагментов Daniel Gibson et al / PNAS 2008

Тем не менее, точкой отсчета в синтетической геномике принято считать не эксперименты Вентера, а эксперименты с геномами вирусов (по традиции, вирусы живыми организмами не считаются, так как не способны к воспроизводству вне клетки-хозяина).

В 2002 году была опубликована статья о синтезе ДНК, соответствующей РНК-содержащему геному полиовируса типа 1 (возбудителя полиомиелита). Размер ДНК-прототипа вирусного генома составил всего 7500 пар оснований, но на тот момент это был самый большой ДНК-фрагмент, созданный исключительно средствами биохимии. Синтетический геном содержал 27 нуклеотидных замен в качестве генетических маркеров, или опознавательных знаков.

Промежуточный рекорд по размеру синтезированного генома (точнее, опять же, его ДНК-копии) был поставлен в 2008 году, когда ученые, пытаясь разобраться в причинах вспышки атипичной пневмонии, получили в лаборатории последовательность генов размером почти 30 тысяч пар оснований коронавируса SARS из летучей мыши.

Итак, первым живым организмом с дизайнерским геномом стала микоплазма. Еще до стадии синтеза в последовательность ее генома при планировании эксперимента были введены замены, позволяющие не просто оставить опознавательные знаки, но и закодировать новую информацию, например электронный адрес сотрудника института. Однако микоплазма — в перспективе объект не слишком полезный. Куда важнее было разработать методологию для синтеза генома кишечной палочки.

Чем важна E. coli

Теоретически можно сократить количество кодонов для некоторых аминокислот и освободить таким образом место под новые. Кроме того, рекодирование изменяет исходную последовательность генов с сохранением их аминокислотного состава. Это, к примеру, позволяет исключить возможность использования генетического аппарата клетки для репликации вирусов.

Результат такого масштабного рекодирования был опубликован в 2016 году с участием одного из пионеров синтетической биологии Джорджа Черча. Авторы статьи в Science провели большую биоинформатическую работу, спланировали сборку генома из маленьких кусочков и решили при этом убрать целых семь кодонов, заменив их в геноме на синонимичные (то есть кодирующие то же самое).

Схема последовательной сборки синтетического генома кишечной палочки из фрагментов Julius Fredens et al / Nature 2019

Этот эксперимент увенчался успехом, и на свет появилась кишечная палочка с синтетическим геномом размером чуть меньше четырех миллионов пар оснований.

И пекарские дрожжи

Тем временем исследователи работают над синтезом генома еще одного модельного организма, пекарских дрожжей Saccharomyces cereviseae . Дрожжи представляют собой простейший эукариотический организм, который, как и кишечная палочка, очень широко используется в фундаментальных исследованиях и биотехнологии. Геном пекарских дрожжей содержит уже 12 миллионов пар оснований, кроме того он состоит не из одной хромосомы, как у бактерий, а из 16.

Воссоздание в клетках дрожжей пути синтеза ароматического компонента, напоминающего запах малины, для улучшения вкуса вина. Для воссоздания пути синтеза 4-4-гидроксифенил-бутана-2 потребовалось ввести в геном дрожжей несколько гетерологичных генов из растений и других микроорганизмов Pretorius I / Critical Reviews in Biotechnology 2016

В 2003 году был успешно завершен проект Human Genome Project по определению последовательности генома человека. Теперь по следам этого международного проекта исследователи предложили запустить вторую часть — уже посвященную синтезу человеческого генома.

Зачем это надо

Джейсон Чин, под руководством которого был собран синтетический геном кишечной палочки, признался в комментарии для The New York Times , что его мотивировал в первую очередь исследовательский интерес. Он хотел знать, так ли необходим вырожденный генетический код? Можно ли создать жизнеспособный организм с урезанной таблицей кодонов? Тем не менее, синтетическая геномика имеет и чисто прикладной интерес, недаром проект по урезанию генома кишечной палочки был инициирован промышленниками.

Прямо сейчас индустрия нуждается в дешевых технологиях синтеза ДНК для метаболической инженерии, производства ферментов, лекарств и биотоплива. Проекты по воссозданию целых геномов, может быть, пока выглядят бессмысленной тратой ресурсов, но выхлоп в виде сопутствующих технологий от них может быть весьма ощутим.

Искусственный геном — направление в биологических исследованиях, связанное с генетической модификацией существующих организмов с целью создания организмов с новыми свойствами. В отличие от генной инженерии, искусственный геном состоит из генов, синтезированных химическим путём.

Предполагается, что в перспективе могут быть созданы искусственные геномы не на основе ДНК или с использованием другого набора нуклеотидов и других принципов кодирования, чем в естественных геномах. Таким образом, создание искусственных геномов — одно из направлений синтетической биологии.

При этом следует понимать, что пока речь идет о синтезе генов с естественными генетическими кодами или их небольшими модификациями. Можно синтезировать искусственный ген, кодирующий любой наперед заданный полипептид, но при этом пока невозможно спроектировать принципиально новый полипептид так, чтобы он хотя бы свернулся в белковую глобулу, не говоря уже о том, чтобы получившийся белок начал функционировать как фермент.

В настоящее время высшим достижением в области создания искусственного генома является синтез хромосомы бактерии Mycoplasma mycoides, осуществлённый Крейгом Вентером в 2010 году.

Содержание

Искусственная хромосома Крейга Вентера (2010 год)

В 2010 году сотрудникам Института Крейга Вентера (англ.) русск. удалось искусственно синтезировать циклическую хромосому бактерии Mycoplasma mycoides размером 1 077 947 нуклеотидных пар [1] . Хромосома была имплантирована в клетку бактерии Mycoplasma capricolum, после деления которой образовалась клетка, полностью управляемая искусственным геномом.

Этот искусственный геном ныне известен под кодовым обозначением JCVI-syn1.0. Он практически полностью повторяет геном одного из штаммов бактерии Mycoplasma mycoides, за исключением нескольких искусственно внедрённых генетических маркеров (англ. watermark, водяные знаки ), нескольких удалённых в процессе синтеза незначимых генов и 19 мутаций, возникших в процессе сборки фрагментов ДНК. Клетки с искусственным геномом нормально функционируют и способны к многократным делениям.

Предыстория

Начало работам по искусственному геному положили работы Фредерика Сэнгера и его сотрудников, которым в 1977 году удалось установить полную нуклеотидную последовательность генома бактериофага φX174 длиной 5375 нуклеотидных пар [2] . 18 лет спустя, в 1995 году, группа Крейга Вентера впервые секвенировала геном самовоспроизводящегося организма — бактерии Haemophilus influenzae длиной 1 830 137 пар [3] .

За последние 25 лет (1985—2010 годы) скорость секвенирования генома увеличилась как минимум на 8 порядков. Лавинообразное увеличение количества организмов, геном которых был прочитан, породило проблему понимания биологической роли каждого гена в организме. До последнего времени было неясно, содержит ли геном полную информацию о строении организма, и будет ли жизнеспособен организм с химически синтезированным геномом. Другой вопрос, стоявший перед молекулярной биологией, заключался в том, являются ли геномы бактерий минимально необходимыми и каков минимальный набор генов, способный создать живую клетку.

Минимальный геном

В 1996 году Аркадий Мушегян и Евгений Кунин (Национальный центр биотехнологической информации, США) предположили, что 256 ортологичных генов, общих для грамотрицательной бактерии Haemophilus influenzae и грамположительной Mycoplasma genitalium, являются хорошим приближением к минимальному набору генов бактериальной клетки [4] . В 2004 году группа исследователей из университета Валенсии (Испания) предложила набор из 206 кодирующих белки генов, полученный в результате анализа нескольких бактериальных геномов [5] .

Учёные из группы Крейга Вентера занимались созданием организма с минимальным искусственно синтезированным геномом, начиная с 1995 года [1] . В 1995 году они секвенировали геном возбудителя заболеваний мочеполовой системы человека Mycoplasma genitalium, считавшийся в то время минимальным среди организмов, способных к самовоспроизведению. Этот микроорганизм содержит 517 генов, из которых 482 кодируют белки. Полный объём генома составляет 580 тыс. нуклеотидных пар. К 1999 году, анализируя расположение транспозонов в секвенированных геномах, удалось установить, что жизненно необходимыми для организма являются от 265 до 350 генов и более 100 генов имеют неизвестное назначение [6] . Дальнейшие исследования к 2005 году расширили список жизненно необходимых генов до 382 [7] .

В дальнейшем были обнаружены бактериальные геномы ещё меньшего размера.

В 2003 году был секвенирован геном Nanoarchaeum equitans размером 490 885 пар [8] . Установлено также, что несеквенированный геном вида Buchnera имеет длину около 450 тыс. пар [9] .

Наименьший из расшифрованных к настоящему моменту бактериальных геномов — геном внутриклеточного эндосимбионта листоблошек бактерии Carsonella, состоящий из 159 662 нуклеотидных пар и содержащий всего 182 гена, кодирующих белки. Этот геном был секвенирован японскими исследователями в 2006 году [10] .

Синтез генома Mycoplasma genitalium (2008 год)

Группой Крейга Вентера была разработана технология синтеза больших молекул ДНК на основе химически синтезированных фрагментов размером 5—7 тыс. пар, называемых кассетами (англ. cassette ). Объединение фрагментов происходило частично in vitro при помощи соответствующих ферментов, частично путём рекомбинации in vivo в дрожжевой клетке Saccharomyces cerevisiae. Полный синтетический геном успешно клонировался как центромерная плазмида (YCp) в клетках дрожжей [11] .

Определённые трудности возникли при переносе синтетической хромосомы из клетки-донора (дрожжи) в клетку-реципиент. Отдельной проблемой было удаление из бактериальной клетки исходного генома для замены его синтетическим.

В дальнейших экспериментах от бактерий M. genitalium в качестве генетического прототипа пришлось отказаться из-за характерной для них чрезвычайно низкой скорости роста. В исследованиях, проведённых в 2010 году, в качестве прототипа использовался геном Mycoplasma mycoides подвида capri (GM12), а в качестве реципиента – Mycoplasma capricolum подвида capricolum (CK).

В целях отработки технологии переноса хромосом из клетки дрожжей в клетку-реципиент были разработаны методы клонирования целых хромосом в виде дрожжевых центромерных плазмид. В качестве объекта экспериментов использовалась естественная хромосома M. mycoides. Однако первые попытки переноса хромосомы M. mycoides в клетку M. сapricolum окончились неудачей. Как выяснилось, проблема состояла в системе рестрикции бактериальных клеток. Системы рестрикции M. mycoides и M. сapricolum одинаковы, в них ДНК метилирована, и при непосредственном переносе хромосомы из одной клетки в другую проблем не возникает [12] . ДНК, клонированная в дрожжах, не метилирована и при переносе в M. сapricolum подвергается уничтожению со стороны системы рестрикции. Во избежание этого донорская ДНК метилировалась очищенной метилазой или экстрактом из M. mycoides или M. сapricolum, либо система рестрикции клетки-реципиента просто разрушалась [13] .

Синтез генома Mycoplasma mycoides (2010 год)

Вторая попытка синтезировать бактериальный геном была предпринята в 2010 году. В качестве прототипа была выбрана хромосома бактерии Mycoplasma mycoides (подвид capri GM12) объёмом 1,08 млн. нуклеотидных пар. Этот искусственный геном получил кодовое обозначение JCVI-syn1.0. Для работы были использованы два генома: CP001621 [14] (база данных GenBank), секвенированный группой Дж. Гласса из Института Крейга Вентера в 2007 году [12] , и трансгенный геном CP001668 [15] , секвенированный группой Кэрол Лартик в 2009 году [13] . На базе образца CP001621 были синтезированы кассеты, использованные для дальнейшего синтеза. По окончании секвенирования образца CP001668 была произведена сверка, обнаружившая различия в 95 фрагментах. Различия, признанные биологически значимыми, были скорректированы в уже синтезированных кассетах. 19 различий, не влияющих на жизнедеятельность бактерии, оставлены без изменений. В четырёх областях генома, которые не являются жизненно важными, сформированы 4 метки WM1—WM4 длиной 1246, 1081, 1109 и 1222 пар соответственно. Полученная генная последовательность M. mycoides JCVI syn1.0 была занесена в базу GenBank под кодом CP002027 [16] .

Оборудование: рисованная таблица “Стадии метода рекомбинативных плазмид”, тесты.

Ход урока

I. Организационный момент.

Фронтальная беседа.
Что называется геном?
В виде чего записана информация о белках? Обо всех белках организма?
Почему именно о белках?
Одинаковые ли белки образуются у различных организмов?
Можно ли утверждать, что белки определяют видовую специфичность?

Проблемный вопрос. Как вы думаете, может ли какой-нибудь другой организм, например, бактерия, синтезировать белок человеческого организма?

III. Изучение нового материала.

Сегодня на уроке мы познакомимся с методами генной инженерии, которые позволяют бактериальным клеткам синтезировать “человеческий” белок, подробно остановимся на стадиях одного из методов - рекомбинативных плазмид,чтобы понять сущность этого процесса, поговорим о значении генной инженерии. План нашей лекции на доске. По ходу изучения вопросов, делайте в своих тетрадях соответствующие записи.

План лекции (на доске).

1. Генная инженерия. Цели генной инженерии.

2. История генной инженерии.

3. Метод реконструирования и переноса рекомбинантных плазмид. Стадии метода.

4. Синтез гена искусственным путём.

5. Значение и перспективы генной инженерии.

Слово учителя.

1. Генная инженерия. Цели генной инженерии.

Генная инженерия – это совокупность методов, позволяющих посредством операций in vitro (в пробирке, вне организма), переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Цель генной инженерии в получении клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые “человеческие” белки; в возможности преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (использование в селекции растений, животных).

2. История генной инженерии.

Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 год. В этот год группа исследователей во главе с американским биохимиком Полом Бергом, работавшим в Стэнфордском университете, что неподалеку от Сан-Франциско в Калифорнии, сообщила о создании вне организма первой рекомбинантной ДНК. Ее еще называют гибридной, т.к. она состоит из ДНК-фрагментов различных организмов. Первая рекомбинантная молекула ДНК состояла из фрагментов кишечной палочки (E. Coli – Escherihia coli), группы генов самой этой бактерии и полной ДНК вируса SV40, вызывающего развитие опухолей у обезьяны. Такая рекомбинантная структура теоретически могла обладать функциональной активностью в клетках, как кишечной палочки, так и обезьяны. Она могла как челнок “ходить” между бактерией и животным. За эту работу Полу Бергу в 1980 году присуждена Нобелевская премия. Основные методы генной инженерии были разработаны в начале 70-х годов прошлого (XX) века. Их суть заключается во введении в организм нового гена. Для этого создают специальные генетические конструкции ? векторы, т.е. устройство для доставки нового гена в клетку. В качестве вектора используют плазмиды.

Что такое плазмиды? ( Кольцевая двухцепочечная молекула ДНК, которая есть в бактериальной клетке. (Она состоит из нескольких тысяч пар нуклеотидов)).

В бактериальной клетке, кроме основной, не покидающей клетку ДНК, может содержаться несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями. Плазмиды являются автономными генетическими элементами, редуплицирующимися в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Плазмиды несут жизненно важные для бактерии гены – гены лекарственной устойчивости к антибактериальным препаратам. Бактерия, имеющая различные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. Поскольку плазмиды могут переходить из одной бактериальной клетки в другую, то они быстро распространяясь среди бактерий, сохраняют им жизнь. Поэтому плазмиды называют даром природы генным инженерам.

3. Методы генной инженерии.

Наиболее распространенными методом генной инженерии является метод конструирования и переноса рекомбинантных ДНК. Этот метод включает несколько этапов.

1. Создание вектора.

Этот этап состоит из двух последовательных стадий: рестрикции и лигирования.

Рестрикция – означает “разрезание”, “ограничение”. При помощи фермента ? рестрикционной эндонуклеазы или рестриктазы, открытой в 1974 году швейцарским ученым Вернером Арбером, происходит разрезание плазмидной ДНК, образуется расщепленная плазмида с “липкими” концами ? ТТАА и ААТТ. ( Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной ДНК, чтобы защищаться от вирусной инфекции.) Этой же рестриктазой разрезают ДНК человека (выделенную из клетки) на множество различных фрагментов, но с одинаковыми “липкими” концами. Поскольку используется один и тот же фермент ? рестриктаза ? “ липкие” концы плазмиды и “липкие” концы ДНК человека (чужеродный ген) будут являться комплементарными.

Лигирование - “сшивание”. Фрагменты ДНК человека включают в плазмиды и их комплементарные “липкие” концы “сшивают” ферментом лигазой. Образуется рекомбинантная плазмида.

2. Трансформация – введение.

Рекомбинантные плазмиды вводят в бактериальные клетки (E. Coli), обработанные специальным образом, чтобы они на короткое время стали проницаемы для макромолекул. Однако, плазмиды проникают лишь в часть обработанных клеток. . Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определённому антибиотику. Это позволяет отделить трансформированные бактерии от нетрансформированных, так как они погибают на среде, содержащей антибиотик. Чтобы их отделить друг от друга, бактерии высевают на питательную среду так, чтобы клетки находились на расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных клеток размножается и образует колонию из многочисленных потомков – клон.

3. Скрининг – отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека.

Все бактериальные колонии покрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нём остаётся отпечаток колоний. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченым зондом. Зонд – это полинуклеотид, комплементарный части искомого гена (Р 32 ). Он гибридизируется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые имеют нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую плёнку и через несколько часов её проявляют. Засвечиваются те участки на плёнке, где располагаются клоны трансформированных бактерий с нужным геном. Их отбирают, размножают (клонируют), так как они способны вырабатывать белок, кодируемый этим геном.

Закрепление объяснённого материала.

- Как называется рассмотренный нами метод генной инженерии?

- Из каких этапов он состоит?

- Что такое вектор?

- Сколько стадий включает этап создания вектора?

- Опишите эти стадии.

- Что такое трансформация?

- Что такое скрининг?

4. Синтез гена искусственным путём.

Не всегда удаётся вырезать точный ген с помощью рестриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей, некоторые не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктазами. Тогда поступают другим образом. Самостоятельная работа с текстом учебника. Прочитайте текст стр. 102 – 103 со слов “Поэтому в ряде случаев…” до слов “ С помощью клонирования….” и ответьте на вопрос: “Как получить клон с нужным в данном случае геном?”

Начинается клонирование с целенаправленного получения нового гена. Для этого из клеток человека выделяют и – РНК – копию этого гена. С помощью фермента обратной транскриптазы, открытой в 1970 году Д. Балтимором и Г. Теминым (американские ученые – лауреаты Нобелевской премии) синтезируют коплементарную цепь ДНК. Затем эта цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой комплементарной второй цепи ДНК, которая называется к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого считала информация и – РНК, запущенная в систему обратной транскриптазой. Комплементарная ДНК (к – ДНК) встраивается в бактериальную плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.

5. Значение и перспективы генной инженерии.

VI. Закрепление.

Тестовая работа. Выбери правильный ответ. Четыре варианта. (Приложение 2, 3). На развороте доски написаны ответы для проверки. Учащиеся обмениваются тестами, проверяют и оценивают их.

Доска. Ответы на тесты.

Варианты – 1, 3	Варианты – 2 ,4
1.в	1.б
2.г	2.в
3.б	3.г
4.б	4.в
5.а	5.в

V. Задание на дом. По учебнику А. О. Рувинского параграф 17, вопросы после параграфа, записи в тетради.

Содержание:

Генная инженерия — это современное направление биотехнологии, объединяющее знания, приемы и методики из целого блока смежных наук — генетики, биологии, химии, вирусологии и так далее — чтобы получить новые наследственные свойства организмов.

Перестройка генотипов происходит путем внесения изменений в ДНК (макромолекулу, обеспечивающую хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) и РНК (одну из трех основных макромолекул, содержащихся в клетках всех живых организмов).

Если внести в растение, микроорганизм, организм животного или даже человека новые гены, можно наделить его новой желательной характеристикой, которой до этого он никогда не обладал. С этой целью сегодня генная инженерия используется во многих сферах. Например, на ее основе сформировалась отдельная отрасль фармацевтической промышленности, представляющая собой одну из современных ветвей биотехнологии.

История развития

Истоки

Параллельно с этим шел процесс формирования знаний о ДНК. Так, в 1869 году швейцарский биолог Фридрих Мишер открыл факт существования макромолекулы, а в 1910 году американский биолог Томас Хант Морган обнаружил на основе характера наследования мутаций у дрозофил, что гены расположены линейно на хромосомах и образуют группы сцепления. В 1953 году было сделано важнейшее открытие — американец Джон Уотсон и британец Фрэнсис Крик установили молекулярную структуру ДНК.

На подъеме

К концу 1960-х годов генетика активно развивалась, а ее важными объектами стали вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов, а в 1970-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК.

Генная инженерия как отдельное направление исследовательской работы зародилась в США в 1972 году, когда в Стэнфордском университете ученые Пол Берг, Стэнли Норман Коэн, Герберт Бойер и их научная группа внедрили новый ген в бактерию кишечной палочки (E. coli), то есть создали первую рекомбинантную ДНК.

Техника ПЦР была впервые разработана в 1980-х годах американским биохимиком Кэри Маллисом. Будущий лауреат Нобелевской премии по химии (1993 года), обнаружил в специфический фермент — ДНК-полимеразу, который участвует в репликации ДНК. Этот фермент буквально считывает отрезки цепи нуклеотидов молекулы и использует их в качестве шаблона для последующего копирования генетической информации.

Новая эра

В 1996 году методом пересадки ядра соматической клетки в цитоплазму яйцеклетки на свет появилось первое клонированное млекопитающее — овца Долли. Это событие стало революционным в истории развития генной инженерии, потому что впервые стало возможным серьезно говорить о создании клонов и выращивании живых организмов на основе молекул.

Технологии генной инженерии

Генная инженерия за короткий срок оказала огромное влияние на развитие различных молекулярно-генетических методов и позволила существенно продвинуться на пути познания генетического аппарата.

Теоретически, технология CRISPR может позволить редактировать любую генетическую мутацию и излечивать заболевание, которое она вызывает. Но практические разработки CRISPR в качестве терапии еще только в начальной стадии, и многое еще непонятно.

Есть и другие методы генной инженерии, например, ZFN и TALEN.

ZFN разрезает ДНК и вставляет туда заготовленный заранее новый фрагмент с помощью белков с ионами цинка (отсюда название — Zinc Finger Nuclease).
TALEN делает то же самое, только используя TAL-белки. Для обеих технологий приходится создавать отдельные белки, а это очень долгая работа, поэтому пока два этих метода особого применения не нашли.

Где и как применяется генная инженерия

Медицина

Уже сейчас активно применяется инсулин человека (хумулин), полученный посредством рекомбинантных ДНК. Клонированные гены человеческого инсулина были введены в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. С 1982 года компании США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин.

Кроме того, несколько сотен новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику. Среди лекарств, находящихся в стадии клинического изучения, препараты, потенциально лечащие артрозы, сердечно-сосудистые заболевания, онкологию и СПИД. Среди нескольких сотен генно-инженерных компаний 60% заняты именно разработкой и производством лекарственных и диагностических средств.

Сельское хозяйство

В сельском хозяйстве одна из важнейших задач генной инженерии — получение растений и животных, устойчивых к вирусам. В настоящее время уже есть виды, способные противостоять воздействию более десятка различных вирусных инфекций.

Еще одна задача связана с защитой растений от насекомых-вредителей. Путем генетической модификации растений можно уменьшить интенсивность обработки полей пестицидами. Например, трансгенные растения картофеля и томатов стали устойчивы к колорадскому жуку, растения хлопчатника — к разным насекомым, в том числе и к хлопковой совке.

Использование генной инженерии позволило сократить применение инсектицидов (препаратов для уничтожения насекомых) на 40–60%.

С помощью генной инженерии пытаются решить и экологические проблемы. Так, уже созданы особые сорта растений с функцией очистки почвы. Они поглощают цинк, никель, кобальт и иные опасные вещества из загрязненных промышленными отходами почв.

Скотоводство

В Кемеровской области работа генетиков позволила получить устойчивое к вирусу лейкоза племенное поголовье высокопродуктивных животных. Для проведения эксперимента кузбасские ученые отобрали здоровых коров черно-пестрой породы массой до 500 кг. Животным трансплантировали модифицированные эмбрионы, устойчивые к вирусу лейкоза. В середине сентября 2020 года родилось 19 телят с измененными генами.

По словам Зубовой, лейкоз крупного рогатого скота — вирусная хронически неизлечимая болезнь, при которой возникают поражение кроветворной системы и новообразования. Данное заболевание наносит значительный ущерб генофонду пород и мясной промышленности в целом, потому что мясо зараженных животных запрещено употреблять в пищу. Единственным доступным методом борьбы с лейкозом ранее было только уничтожение зараженного скота.

Этот успех позволяет говорить о том, что в дальнейшем будет возможно редактировать гены крупного рогатого скота и от других болезней.

С прицелом на человека

В 2009 году группа ученых под руководством молодого исследователя Джея Нейтца из Вашингтонского университета сумели с помощью генной терапии вернуть обезьянам способность различать оттенки зеленого и красного, которой они были лишены от рождения.

В область сетчатки глаза двух подопытных обезьян был введен безвредный вирус, несущий недостающий ген фоточувствительного рецептора. Вскоре после процедуры обе обезьяны начали различать оттенки красного и зеленого на сером фоне. Два года наблюдения не выявили у них каких-либо нарушений, поэтому ученые не исключают, что данную методику уже вскоре можно будет применять у людей, страдающих дальтонизмом.

Ученые шагнули еще дальше и уже пробуют выращивать в теле животных органы для трансплантации людям. Для минимизации риска отторжения тканей животным вводят специальные гены. Этими опытами занимается научная лаборатория Рослинского института в Великобритании, которая представила миру овцу Долли.

В 2019 году британские ученые вывели кур, яйца которых содержат два вида человеческих белков, способных противодействовать артриту и некоторым видам онкологических заболеваний. В яйцах содержится человеческий белок под названием IFNalpha2a, обладающий мощными противовирусными и противораковыми свойствами, а также человеческий и свиной вариант белка под названием макрофаг-CSF, который планируют использовать для создания препарата, стимулирующего самостоятельное заживление поврежденных тканей.

Изменение ДНК человека

Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы.

14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей наследственным иммунодефицитом, обусловленным мутацией в гене аденозиндезаминазы (АDA), были пересажены ее собственные лимфоциты.

Работающая копия гена ADA была введена в клетки крови с помощью модифицированного вируса, в результате чего клетки получили возможность самостоятельно производить необходимый белок. Через шесть месяцев количество белых клеток в организме девочки поднялось до нормального уровня.

После этого область генной терапии получила толчок к дальнейшему развитию. С 1990-х годов сотни лабораторий ведут исследования по использованию генной терапии для лечения различных заболеваний. Уже сегодня с помощью генной терапии можно лечить диабет, анемию и некоторые виды онкологии.

Генная терапия

Генная терапия — введение, удаление или изменение генетического материала, в частности ДНК или РНК, в клетке пациента для лечения определенного заболевания.

Существует три основных стратегии использования генной терапии:

В 2015 году впервые была проведена процедура изменения ДНК человека с целью продления молодости клеток, когда американке Элизабет Пэрриш 44 лет ввели в организм препарат, влияющий на ДНК, а в 2018 году китайский ученый Хэ Цзянькуй заявил, что с его помощью у двух детей-близнецов якобы изменены гены для выработки у них иммунитета к вирусу ВИЧ, носителем которого являлся их отец.

Все это, с одной стороны, выглядит грандиозно и обнадеживает, но с другой, — вызывает опасения, ведь генетические манипуляции, теоретически, возможно использовать не только в благих и мирных целях.

После эксперимента с ДНК близнецов в Китае, ЮНЕСКО выступила с инициативой о запрете изменения генов у новорожденных до того момента, пока достоверно не будет доказана безопасность таких манипуляций.

Этическая сторона вопроса

В 1997 году ЮНЕСКО выпустила Всеобщую декларацию о геноме человека и его правах, рекомендовав мораторий на генетическое вмешательство в зародышевую линию человека, а в декабре 2015 года на международном саммите по геномному редактированию человека изменение гаметоцитов и эмбрионов для генерации наследственных изменений у людей было объявлено безответственным.

Российское сообщество генетиков в большинстве своем считает, что такие эксперименты на данный момент преждевременны и требуют более глубокого исследования и обсуждений.

Страх неизвестности

Вариантов развития событий в области генной инженерии существует множество, и далеко не все они изучены и, в принципе, известны. Поэтому они должны быть последовательно зафиксированы и регламентированы.

Естественно, больше всего опасений вызывают плохие сценарии развития событий. Как правило, все начинается с помощи людям и изобретения новых лекарств. Но потом человек может прийти к желанию сделать своего ребенка светловолосым и зеленоглазым или создать армию универсальных солдат, не боящихся боли и не ведающих страха.

Эксперты убеждены, что генная инженерия — это будущее медицины. Возможность избавить младенца от пожизненного гнета заболевания, излечить людей от рака, найти лекарство против ВИЧ — за всем этим будет стоять генная инженерия. При этом желание человека изменить, например, цвет глаз или предотвратить наследственное заболевание, несмотря на все риски, будет только расти. И похоже, что остановить этот процесс уже не представляется возможным.

Читайте также: