Оптическая микроскопия кратко и понятно

Обновлено: 07.07.2024

Цель работы: изучить устройство светового биологического микроскопа и освоить правила работы с ним. Ознакомиться с различными видами микроскопии.

Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп; бактериологические петли; предметные стекла.

1.1. Устройство микроскопа

Микроскоп (от греч. micros - малый и scopio - смотрю) - это оптический прибор, состоящий из двух частей: механической (подсобной) и оптической (главной).

1. Оптическая часть: окуляр, объектив, конденсор Аббе, осветительный прибор (зеркальце).

2. Механическая часть: штатив, основание, предметный столик, тубусодержатель, макровинт, микровинт (рис. 1).

Рис. 1. Устройство микроскопа: 1 - основание; 2 - осветитель; 3 - светофильтр; 4 - конденсор Аббе; 5 - предметный столик; 6 - объективы; 7 - револьверная головка;

8 - монокулярная насадка; 9 - окуляр; 10 - штатив; 11 - измерительный нониус; 12 - ограничительный винт; 13 - держатель препарата; 14 - ручка грубой настройки;

15 - ручка точной настройки; 16 - рукоятка перемещения конденсора

Механическая часть микроскопа.

Штатив имеет основание в виде подковы и колонку (тубусодержатель) в форме дуги. К нему примыкают коробка механизмов, система зубчатых колес для регуляции положения тубуса. Система приводится в движение вращением макрометрического и микрометрического винтов.

Макрометрический винт (кремальера, зубчатка, макровинт) служит для предварительной ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта.

Микрометрический винт (микровинт) используют для последующей четкой установки на фокус. При полном повороте микровинта труба передвигается на 0,1 мм (100 мкм).

При вращении винтов по часовой стрелке труба опускается по направлению к препарату, при вращении против часовой стрелки - поднимается от препарата.

Предметный столик служит для размещения на нем препарата с объектом исследования. Предметный столик вращается и перемещается во взаимно перпендикулярных плоскостях с помощью винтов. В центре столика находится круглое отверстие для освещения препарата снизу лучами света, направляемыми зеркалом микроскопа. В столик вмонтированы два зажима (клеммы) - пружинящие металлические пластинки, предназначенные для закрепления препарата.

Если необходимо исследовать поверхность препарата, не допуская пропусков (что важно при подсчете), или же если во время работы требуется повторное исследование какого-либо определенного участка на препарате, на предметный столик помещают препаратоводитель. На нем имеется система линеек - нониусов, с помощью которых можно присвоить координаты любой точке исследуемого объекта. Для этого при установке препаратоводителя следует совместить центр вращения столика и оптическую ось системы микроскопа с центрировочной пластинкой препаратоводителя (отсюда предметный столик с препаратоводителем называют иногда крестообразным).

Тубус (труба) - оправа, в которую заключены элементы оптической системы микроскопа. К нижней части тубуса прикрепляется револьвер (объективодержатель) с гнездами для объективов. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус с дугообразным тубусодержателем, что обеспечивает горизонтальное положение предметного столика.

Оптическая часть микроскопа состоит из основного оптического узла (объектив и окуляр) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и конденсор). Все части оптической системы строго центрированы относительно друг друга.

Во многих современных микроскопах зеркало и конденсор заменены вмонтированным в прибор регулируемым источником света.

Осветительная система находится под предметным столиком. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, другая - вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользоваться только плоским зеркалом. Вогнутое зеркало применяют при работе без конденсора с объективами малых увеличений. Конденсор (от лат. con-denso - уплотняю, сгущаю), состоящий из 2-3 короткофокусных линз, собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. Конденсор необходим прежде всего при работе с иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонтированы в металлическую оправу, соединенную с зубчатым механизмом, позволяющим перемещать конденсор вверх и вниз специальным винтом. Для регулировки интенсивности освещения в конденсоре есть ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок.

Окрашенные препараты лучше рассматривать при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные - при уменьшенном отверстии диафрагмы.

Под конденсором располагается кольцевидный держатель для светофильтров (обычно к микроскопу прилагаются синее и белое матовые стекла). При работе с искусственным источником света светофильтры создают впечатление диезного освещения, что делает микроскопирование менее утомительным для глаз.

Объектив (от лат. objectum - предмет) - наиболее важная часть микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная система, от качества которой зависит в основном изображение объекта. Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, называется фронтальной. Именно она обеспечивает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков, возникающих при исследовании объектов.

Один из таких недостатков - явление сферической аберрации. Оно связано со свойством линз неравномерно преломлять периферические и центральные лучи. Первые обычно преломляются в большей степени, чем вторые, и поэтому пересекаются на более близком расстоянии к линзе. В результате изображение точки приобретает вид расплывчатого пятна.

Хроматическая аберрация возникает при прохождении через линзу пучка лучей с различной длиной волны. Преломляясь по- разному, лучи пересекаются не в одной точке. Сине-фиолетовые лучи с короткой длиной волны преломляются сильнее, чем красные с большей длиной волны. Вследствие этого у бесцветного объекта появляется окраска.

К объективам, устраняющим сферическую и частично хроматическую аберрацию, относятся ахроматы. Они содержат до 6 линз и коррегируют первичный спектр (желто-зеленую часть спектра), не устраняя вторичного спектра. Изображение, получаемое с помощью ахроматов, не окрашено, но края его имеют красный или синеватый ореол. В современных ахроматах этот недостаток практически неуловим. Лучший материал для линз ахроматов - флинтгласы - старые сорта стекла с высоким содержанием окиси свинца.

Объективы, устраняющие хроматическую аберрацию и для вторичного спектра, называют апохроматами. В их составе может быть от 1 до 12 линз. Линзы апохроматов для лучей коррекции вторичного спектра делают из плавикового пата, каменной соли, квасцов и других материалов. Апохроматы дают возможность устранить окрашивание объекта и получить одинаково резкое изображение от лучей разного цвета. Максимального эффекта при работе с апохроматами можно достичь только при их сочетании с компенсационными окулярами, возмещающими оптические недостатки объективов. В компенсационных окулярах хроматическая ошибка противоположна хроматической ошибке объектива, и в результате хроматическая аберрация микроскопа оказывается почти полностью компенсированной.

Планахроматы - разновидность апохроматов, имеющих плоское поле зрения. Объективы-планахроматы полностью устраняют искривление поля зрения, обуславливающее неравномерность фокусировки объекта (при кривизне поля зрения фокусируется только часть поля). Планахроматы и планапохроматы используют при микрофотографии.

Объективы бывают сухие и погружные (иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом исследования находится воздух. Оптический расчет иммерсионных объективов предусматривает их работу при погружении фронтальной линзы объектива в жидкую однородную среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы между показателями преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя (рис. 2).

Рис. 2. Ход лучей в сухой и иммерсионной системах: I-V- лучи света

При работе с иммерсионным объективом необходимо поместить между покровным стеклом и линзами объектива кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла (табл. 1).

МИКРОСКОПИ́Я ОПТИ́ЧЕСКАЯ, общее название методов наблюдения объектов, не различимых человеческим глазом, с использованием оптич. микроскопа. Структуру объекта можно различить, если разные его частицы по-разному поглощают и отражают свет либо отличаются одна от другой (или от среды) показателями преломления. Эти свойства обусловливают различие амплитуд и фаз световых волн, прошедших через разные участки объекта, и от этого зависит контрастность изображения. Разные методы наблюдения, применяемые в М. о., выбираются в зависимости от свойств изучаемого объекта (препарата).

Термин, сформулированный в названии, является достаточно неопределенным. Развитие оптических методов в микроскопии привело к настоящему времени к появлению огромного числа методик, многие из которых следовало бы отнести к классическим. Однако целью данной главы является не обзор широких возможностей оптической микроскопии, а определение ряда терминов, которые далее будут использоваться при объяснении принципа функционирования конфокального микроскопа. Введение этих основных понятий мы выполним на примере микроскопа с широким полем зрения (рис. 1).

Рис. 1. Схема "классического" оптического микроскопа с широким полем зрения.

В таком микроскопе определенное поле зрения равномерно освещается световым пучком, затем оптическая система проецирует изображение объекта, находящегося в поле зрения на сетчатку глаза или на плоскость фотоприемника, например, ПЗС матрицы в видеокамере. При этом, вообще говоря, в фотоприемник попадает свет, испущенный из различных областей образца: как находящихся в фокусе объективной линзы, так и вне фокуса (рис. 2).

Рис. 2. В микроскопе с широким полем зрения одновременно видны различные точки образца, при этом точки из плоскостей отличных от предметной будут создавать фоновую засветку, снижающую контрастность.

Числовая апертура и безразмерные единицы.

В оптике принят ряд специализированных терминов для описания свойств оптических инструментов. В частности под числовой апертурой понимают

где – коэффициент преломления среды, а – угол полураствора конуса в котором сходится или расходится свет. Для линзы этот угол определяется диаметром ее оправы и фокальным расстоянием :

Для удобства расчетов нам будет удобно измерять расстояния от оси в плоскости объекта в единицах длины волны света в среде , где – длина волны света в вакууме. Безразмерная единица радиуса будет иметь вид

а безразмерное расстояние вдоль оптической оси будет равно

Чем определяется разрешение микроскопа?

Изображения, получаемые при помощи линз или зеркал, располагаются в геометрически сопряженных плоскостях. В этом случае для пучка лучей, распространяющегося от каждой точки объекта, выполняется условие дифракции Фраунгофера. Пусть, например, параллельный пучок света от далекого точечного объекта, сходится в фокальной плоскости линзы (рис. 3).

Рис. 3. Дифракция Фраунгофера в фокальной плоскости линзы.

Каждая точка фокальной плоскости соответствует бесконечно удаленной точке; следовательно, в фокальной плоскости выполняется условие дифракции Фраунгофера. Роль препятствия, на котором свет испытывает дифракцию, играет диафрагма , ограничивающаяся световой пучок. Такой диафрагмой, в частности, может являться оправа самой линзы. Принято говорить, что дифракция происходит на входной апертуре оптической системы.

Аналогичным образом можно проиллюстрировать случай, когда точечный источник находится на конечном расстоянии от линзы, а изображение возникает на расстоянии за линзой. При этом расстояния и подчиняются формуле линзы

Для того, чтобы пояснить, почему и в этом случае выполняется условие наблюдения дифракции Фраунгофера, заменим одиночную линзу с фокусным расстоянием двумя вплотную расположенными линзами с фокусными расстояниями и (рис. 4). Тогда источник оказываются расположенными в переднем фокусе первой линзы, а плоскость изображения совпадает с задней фокальной плоскостью второй линзы. При этом автоматически выполняется соотношение (5), так как оно равносильно правилу сложения оптических сил (то есть обратных фокусных расстояний) двух близко расположенных линз. В промежутке между линзами лучи идут параллельным пучком. Сравнивая рис. 3 и 4, можно заключить, что во втором случае дифракция Фраунгофера происходит на общей оправе линз и наблюдается в задней фокальной плоскости второй линзы. Рис. 3 соответствует картине дифракции света в объективе телескопа (или глаза), рис. 4 – дифракции в объективе микроскопа. Поле зрения обычных оптических микроскопов не превышает 1000 разрешаемых элементов.

Рис. 4. Дифракция Фраунгофера в плоскости, геометрически сопряженной источнику.

Функция размытия точки (point spreading function).

Функция размытия точки (PSF) (или функция импульсного отклика дифракционно-ограниченной системы) определяет распределение интенсивности в фокальной плоскости линзы обусловленное дифракцией Фраунгофера на входной диафрагме. Как показано выше, точно такое же распределение интенсивности получится от точечного источника в сопряженной плоскости тонкой линзы.

PSF для линзы с фокальным расстоянием от пучка ограниченного круглой диафрагмой диаметром может быть выражено в общем виде [2]:

где – функции Бесселя k-го порядка, .

Здесь мы ввели более общую функцию, чем было определено ранее. Функция дает распределение интенсивности вдоль радиуса для различных плоскостей . Эта функция обладает замечательным свойством: для любой плоскости

что отвечает постоянству потока энергии через каждую плоскость.

В параксиальном приближении (малые значения распределение интенсивности света в фокальной плоскости определяется выражением

где нормировочный коэффициент выбран так, чтобы в фокусе значение было равно 1.

Картина дифракции на круглом отверстии имеет вид концентрических колец. Центральное светлое пятно носит название пятна Эйри. Интенсивность в максимуме первого светлого кольца составляет приблизительно 2 % от интенсивности в центре пятна Эйри. Распределение показано на рис. 5.

Рис. 5. Распределение интенсивности в дифракционной картине круглой диафрагмы.

При этом радиус пятна Эйри составляет

Следует заметить, что на оптической оси системы : и , поэтому разрешение вдоль оптической оси определяется только вкладом . В параксиальном приближении (малые значения ) относительное изменение интенсивности вдоль оси

Разрешающая способность микроскопа, критерий Релея.

Под разрешающей способностью микроскопа обычно понимают возможность различения двух близких по интенсивности точечных объектов. Из вида функции распределения интенсивности в фокальной плоскости следует, что разрешение будет определяться степенью перекрытия пятен Эйри распределений двух точечных объектов. Релеем был предложен критерий, согласно которому две точки считаются разрешенными, если величина "провала" в интенсивности по центру между изображениями точек составили 26% от максимума. При этом расстояние между разрешаемыми точками должно быть больше радиуса пятна Эйри (см. предыдущий параграф).

Оптический микроскоп или фотонный микроскоп представляет собой оптический прибор , снабженный цель и в окуляр , который дает возможность увеличить изображение маленького объекта (который характеризует его оптическую силу) и отделить детали этого образа (и его разрешающую способность ) так что его можно наблюдать невооруженным глазом. Он используется в биологии для наблюдения за клетками и тканями, в петрографии для распознавания горных пород, в металлургии и в металлографии для изучения структуры металла или сплава.

Его не следует путать с бинокулярной лупой, которая не требует тонких плоских образцов или отражающей поверхности и позволяет наблюдать естественные части без предварительной подготовки, увеличивая изображение с низким коэффициентом, но сохраняя стереоскопическое зрение, способствующее макроскопическому исследованию, обнаруживающему зерна, трещины и т. Д. трещины и др.

В настоящее время самые мощные оптические микроскопы имеют увеличение × 2500.

Из-за ограничений спектра видимого света оптические микроскопы с достаточным увеличением позволяют наблюдать клетки (но не все клеточные единицы и субъединицы), грибки, простейшие, бактерии, но не позволяют наблюдать вирусы.

Резюме

История

Кто изобрел составной микроскоп, сказать сложно. Часто говорят , что голландский Оптик Ханс Янссен и его сын Захария Янссен изготовил первый микроскоп в 1595, но это происходит из заявления самого Захария Янссен в середине XVII - го века . Захариас Янссен родился около 1570 года.

Еще один фаворит как изобретатель микроскопа - Галилей . В 1609 году он разработал окчиолино , микроскоп, состоящий из выпуклой линзы и другой вогнутой линзы. Афанасиус Кирхер описал свой микроскоп в 1646 году, который он использовал для наблюдения за кровью.

Оптический микроскоп (1751 г.).

Микроскоп Манжеты (1760 г.).

Микроскоп Франсуа-Лорана Виллета (1765 г.).

Микроскоп Цейсса, Йена (1879 г.).

Модель Фойгта и Хохгесанга (1890 г.).

Рисунок трех пчел, сделанный Франческо Стеллути, появляется на печати Папы Урбана VIII (1623–1644) и считается первым опубликованным микроскопическим изображением. Христиан Гюйгенс , другой голландец, разработанный в конце XVII - го века простой двойной окуляр исправлены хроматические аберрации, что было большим шагом вперед в развитии микроскопа. Окуляр Гюйгенса все еще производится, но страдает от довольно маленького поля зрения и других незначительных проблем. Как правило , приписывается Левенгук (1632-1723) не притянув к себе внимание биологов на использовании микроскопа, даже если обычные увеличительные стекла уже были изготовлены и использованы в XVI - го века . Изготовленные вручную микроскопы Ван Левенгука были простыми небольшими приборами с одной, но сильной линзой. Для сравнения, многолинзовые системы по-прежнему сложно разрабатывать, и потребовалось не менее 150 лет оптических разработок, прежде чем составной микроскоп смог обеспечить качество изображения, эквивалентное качеству одиночных микроскопов Ван Левенгука. Тем не менее, несмотря на многие заявления, нельзя считать Антони Ван Левенгука изобретателем составного микроскопа. Роберт Гук также был одним из первых, кто забеременел.

Первый подход

Принцип базового оптического микроскопа

"> Читать СМИ

Оптический микроскоп - это оптическая система с линзами , предназначенная для получения увеличенного изображения наблюдаемого объекта.

Это диоптрийно-центрированная система, частично состоящая из дублетов для коррекции некоторых оптических аберраций .

В отличие от других оптических систем, которые определяются их оптическим увеличением ( телескоп ) или увеличением ( камера ), подходящим термином для микроскопа является его мощность , отношение угла, под которым объект виден через инструмент, к длине этого объекта.

Наиболее широко используемый метод освещения в классической широкопольной микроскопии - это освещение Келера , которое гарантирует оптимальное качество изображения.

Состав микроскопа

Окуляр может быть заменен фотоаппаратом или, в случае видеомикроскопии , видеокамерой или камерой CCD для цифровой съемки . Это позволяет вести наблюдение на видеомониторе (экране телевизионного типа) и облегчает использование и обработку изображений (печать, компьютерная обработка, телемедицина и т. Д.).

Ограничения оптического микроскопа

Разрешение микроскопа означает его способность различать очень похожие детали. Независимо от используемого датчика и аберраций или дефектов линз, разрешение оптического микроскопа в основном ограничено дифракцией света. Действительно, из-за дифракции изображение точки является не точкой, а пятном ( пятно Эйри или, в более общем смысле, функция рассеяния точки - PSF). Таким образом, две различные, но соседние точки будут иметь для изображений два пятна, перекрытие которых может помешать различению двух точек изображения: тогда детали больше не будут разрешены.

Согласно теории Аббе , предел (поперечного) разрешения микроскопа, то есть наименьшее расстояние, ниже которого две соседние точки больше не будут различаться, можно выразить просто с помощью длины волны освещения , показателя преломления на выходе объектива и половины угол максимально доступного светового конуса . d λ нет α

где NA - произведение или числовая апертура объектива. Таким образом, мы можем увеличить разрешение двумя способами: нет грех ⁡ α

за счет увеличения показателя преломления. Этого можно достичь с помощью иммерсионного объектива: передняя часть объектива погружается в жидкость, показатель преломления которой близок к максимуму 1,5 - у стекла;
уменьшая длину волны. Однако, если мы остаемся в видимом свете, невозможно опуститься ниже 400 нм .

Предел разрешения обычного светового микроскопа составляет примерно 0,2 мкм . Просвечивающий электронный микроскоп будет достигнут предел в 100 раз меньше.

Улучшенное разрешение в оптической микроскопии

Использование и улучшение

Отражательная микроскопия

Отражательная микроскопия исследует непрозрачные или слишком толстые для передачи объекты. В свою очередь, конечно, он может дать информацию только о поверхности образца в случае наблюдения в белом свете; в поляризованном свете это позволяет выявить ориентацию зерен составляющих минералов или металлов.

Классическим случаем является металлография, при которой производятся наблюдения за кусками металла, так называемая металлография . Как было сказано выше, микроскоп часто переворачивают, и исследуемая часть помещается на опорную пластину (обычно с круглым отверстием).

Случайное освещение

Идея такого освещения устарела , так как в 1740 году Декарт вдохновил Либеркюна, который создал для своих наблюдений под микроскопом серебряное зеркало, окружающее объектив, фокус этого зеркала был направлен на препарат.

Светлопольная микроскопия

Освещение осуществляется за счет пропускания белого света, т.е. образец освещается снизу и наблюдается сверху. Ограничениями этого метода являются в основном низкий контраст большинства биологических образцов и низкое разрешение из-за размытия, создаваемого материалом за пределами фокальной плоскости. С другой стороны, техника проста, и образец требует минимальной подготовки.

Микроскопия темного поля

В освещении темного поля используется тщательно выровненный источник света, чтобы минимизировать количество прямого проходящего света и собирать только свет, рассеянный образцом. Он может значительно увеличить контраст, особенно для прозрачных образцов, при этом требует небольшого оборудования и простой подготовки образцов. Однако этот метод страдает низкой интенсивностью собираемого света и по-прежнему зависит от предела разрешения.

Освещения Рейнберг является вариант освещения , в котором прозрачные темном поле цветные фильтры вставляются непосредственно перед конденсатором, так , что более или менее косые лучи света окрашены по- разному (в нижней части изображения может быть синим в то время как образец появляется ярко - желтого цвета). Предел разрешения такой же, как и в темном поле. Возможны и другие сочетания цветов, но их эффективность весьма различна.

Микроскопия в темном поле особенно подходит для свежих образцов и позволяет проводить микрокинематографию (например, бактерий в движении). Его не интересуют цветные объекты (мазки или цветные участки). Это особенно полезно для:

наблюдать за существами или плоскими объектами с правильной и прозрачной структурой, такими как диатомовые водоросли , радиолярии и т. д.
наблюдайте нитевидные образования (например, жгутики , волокна , бактерии , определенные кристаллы и т. д.).
наблюдать очень мелкие точечные или линейные объекты, размер которых будет ограничен для разделения светлопольного микроскопа. Эти объекты будут давать изображение очень ярких точек или линий (например, Treponema pallidum , возбудителя сифилиса ) и с четкими контурами, если объект достаточно толстый, или для наиболее крупных бактерий (например, Borrelia , возбудителя болезни Лайма ).

Косое освещение

Использование косого освещения (сбоку) придает изображению трехмерный вид и позволяет выделить аспекты, невидимые в противном случае. Это главное преимущество. Ограничения такие же, как и для светлопольной микроскопии.

Микроскопия в поляризованном свете

В микроскопии поляризованного света образец помещают между поляризатором и анализатором, чтобы обнаружить изменения поляризации света после прохождения через образец. Этот метод очень полезен для наблюдения двулучепреломляющих сред , в частности, в минералогии.

Флуоресцентная микроскопия

Когда определенные соединения освещаются источником света с высокой энергией, они затем излучают свет с более низкой энергией. Это явление флуоресценции . Флуоресцентная (или эпифлуоресцентная ) микроскопия - это метод, в котором используется оптический микроскоп, оснащенный лазерным излучателем фотонного излучения с точной длиной волны. Это излучение будет возбуждать целевую молекулу с флуоресцентными свойствами. Это позволяет использовать феномен флуоресценции и фосфоресценции вместо или в дополнение к классическому наблюдению путем отражения (физического) или поглощения естественного или искусственного видимого света.

Сегодня этот метод имеет первостепенное значение в науках о жизни, в частности, благодаря маркировке клеточных или тканевых структур флуоресцентными молекулами, такими как родамин или флуоресцеин . Он может быть очень чувствительным, даже позволяя обнаруживать изолированные молекулы. Различные структуры или химические соединения также могут быть обнаружены одновременно с использованием различных соединений, которые будут различаться по цвету флуоресценции.

Полное внутреннее отражение флуоресцентный микроскоп ( TIRF , полное внутреннее отражение флуоресцентной микроскопии ), или микроскопические затухающих волны , является конкретный тип оптического флуоресцентного микроскопа , чтобы изучить очень тонкий срез образца (менее 200 нм толщиной), благодаря конкретной режим освещения: полное внутреннее отражение .

Фазово-контрастный микроскоп

Фазовый контраст - это широко используемый метод, который подчеркивает различия в показателях преломления как разницу в контрасте. Он был разработан голландским физиком Фредериком Зернике в 1930-х годах (за это ему в 1953 году была присуждена Нобелевская премия). Например, ядро клетки будет темным в окружающей цитоплазме. Контраст отличный, однако эту технику нельзя использовать с толстыми объектами. Часто вокруг небольших предметов образуется ореол, который может заглушать детали.

Система состоит из круглого кольца в конденсаторе, которое производит световой конус. Этот конус накладывается на кольцо такого же размера в линзе. У каждого объектива есть кольцо разного размера, поэтому необходимо адаптировать конденсатор к каждой смене объектива. Кольцо в линзе обладает особыми оптическими свойствами: оно снижает интенсивность прямого света и, что более важно, создает искусственную разность фаз в четверть длины волны, которая создает помехи для рассеянного света и создает контраст изображения.

Микроскоп интерференционного контраста

Интерференционный контраст (IC, IC для англоговорящих) - это метод, позволяющий просматривать прозрачные объекты за счет увеличения их контраста. В настоящее время наибольшее распространение получил КИ по Номарски, изобретенный в 1950-х годах. Этот метод обеспечивает более важный по сравнению с фазовым контрастом, устраняя явление ореола, характерное для последнего. Сегодня он зарекомендовал себя в микроскопии во многих областях.

Конфокальный микроскоп

Конфокальный микроскоп генерирует изображение совершенно иначе, чем обычная светлопольная микроскопия. Разрешение немного лучше, но самое главное, оно позволяет формировать изображение поперечных сечений, не нарушая свет за пределами фокальной плоскости. Таким образом, он дает очень четкое изображение трехмерных объектов. Конфокальный микроскоп часто используется вместе с флуоресцентной микроскопией.

Микроскоп с перевернутой стойкой

Микроскоп без линзы

Безлинзовой микроскоп записывает картину дифракции в виде лазера с помощью образца (принцип голографии ), затем обрабатывает этот шаблон с помощью компьютера для формирования изображения.

Подготовка образцов

Наблюдаемый образец должен соответствовать определенным условиям:

плоскостность, так что объектив дает четкое все изображение, в противном случае мы можем наблюдать только небольшую часть
при пропускании он должен быть тонким, чтобы свет проходил через него и делал видимыми только несколько элементов (клеток) в случае биологии;
при отражении поверхность обычно следует отполировать, чтобы царапины не маскировали то, что вы хотите увидеть;
наблюдаемые части должны отличаться друг от друга:
- дифференциация цветов путем химической окраски стандартизированных растворов для биологии;
- химическое воздействие кислот для выявления дефектов в металлургии;
- другие различия путем освещения в поляризованном свете, в ультрафиолетовом (флуоресценция) или по принципу интерференции, обнаруживая другие аспекты, невидимые невооруженным глазом.
В биологии сначала необходимо поместить срез ткани (или жидкости, содержащей живые организмы) между предметным стеклом и покровным стеклом . Объектив должен приближаться к лезвию для фокусировки, не разрушая из-за неуклюжести подготовку, которая стала очень хрупкой.

Из-за подготовки оптическая микроскопия требует большого количества дополнительных устройств только для микроскопических наблюдений.

Читайте также: