Окрашивание по цилю нильсену кратко

Обновлено: 02.07.2024

1. Бактерии, содержащие большое количество жиро- и воскоподобных веществ, а также миколовую кислоту в клеточной стенке и цитоплазме (туберкулезные и лепрозные палочки), являются кислотоустойчивыми и не могут быть окрашены простыми методами. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена.

2. При окраске бактерий по методу Циля-Нильсена используют концентрированные растворы, содержащие протравы (5 % карболовый фуксин Циля) и ведут окраску при подогревании. Карболовая кислота разрыхляет клеточную стенку и повышает ее тинкториальные свойства. Высокая концентрация красителя и нагревание усиливают реакцию его взаимодействия с миколовой кислотой. Затем препарат обесцвечивают 5 % раствором серной кислоты и докрашивают метиленовым синим по Леффлеру. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет (цвет фуксина), т.к. миколовая кислота вступает во взаимодействие с карболовым фуксином. В результате краска фиксируется в микробной клетке, поэтому кислотоустойчивые палочки не обесцвечиваются серной кислотой. Остальные бактерии обесцвечиваются и докрашиваются в синий цвет метиленовым синим. Благодаря этому кислотоустойчивые бактерии могут быть дифференцированы от других.

3. Техника окраски по Цилю-Нильсену. Фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой, на которую наливают карболовый фуксин Циля. Затем мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров. Добавляют новую порцию красителя и повторяют манипуляцию в течение 3-5 минут. Снимают бумажку пинцетом и после охлаждения до комнатной температуры тщательно промывают мазок водой. Обесцвечивают мазок 5 % раствором серной кислоты, опуская в него предметное стекло на 20-30 минут. Затем препарат тщательно промывают водой. В течение 5 минут окрашивают раствором метиленового синего по Леффлеру, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

СТРОЕНИЕ, ОБРАЗОВАНИЕ, ЗНАЧЕНИЕ И МЕТОДЫ ОКРАСКИ СПОР У БАКТЕРИЙ.

1. Спорообразование свойственно не всем бактериям. Споры образуют почти исключительно палочковидные бактерии. Среди кокков споры образуют энтерококк и мочевая сарцина, и только один из вибрионов образует спору при температуре 45-55° С.

2.Спорообразующие аэробные палочки, у которых размеры споры не превышают диаметра клетки, называются бациллами (возбудитель сибирской язвы). Спорообразующие анаэробные бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, называются клостридиями (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).

3. Споры образуются внутри тела бактерии, т.е. эндогенно при неблагоприятных внешних условиях (недостаток питательных веществ, наличие вредных продуктов обмена, высушивание, изменение аэрации, неблагоприятная температура). Одна бактериальная клетка способна образовывать только одну спору. Т.о., споры являются приспособлением к перенесению неблагоприятных условий, а не служат для размножения (исключение – актиномицеты).

4. В отличие от вегетативных форм, которые являются активной стадией бактериальной клетки, когда энергично проявляются все физиологические и биохимические процессы, спора – это покоящаяся форма, в которой отсутствуют ферментативная и другие виды активности и которая обладает высокой устойчивостью к действию повреждающих факторов, что обусловлено определенными физико-химическими и биологическими особенностями спор. Они могут сохранять свою жизнеспособность в течение длительного времени (например, споры возбудителей сибирской язвы и столбняка способны сохраняться в почве десятки лет). Образование спор способствует сохранению вида.

5. Образование спор у патогенных микробов происходит вне организма человека и животных; у одних микробов – при хорошем доступе кислорода; у других – при отсутствии кислорода. К спорообразованию способны только зрелые клетки бактерий.

7. Химический состав споры характеризуется незначительным количеством свободной воды (цитоплазма сгущена по сравнению с вегетативной клеткой и содержит воду в связанном состоянии), большим содержанием липидов. Плотная многослойная оболочка обусловливает высокую устойчивость спор к воздействию неблагоприятных физических и химических факторов – высушиванию, воздействию УФ лучей, замораживанию и кипячению, действию спиртов и других химических веществ. Термоустойчивость спор связывают с наличием в оболочке дипиколината кальция. Споры погибают в автоклаве при 120° С в течение 15-20 минут и при действии сухого жара (150-170° С) в течение 1-2 часов.

8. Спорообразование, форма и расположение спор в клетке являются довольно постоянным видовым признаком бактерии, что позволяет отличать их друг от друга. Форма спор может быть круглой или овальной. Расположение спор в клетке бывает: центральное (сибиреязвенная бацилла); терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка); субтерминальное – ближе к концу палочки (возбудитель ботулизма, газовой гангрены). Диаметр споры обычно не превышает поперечника палочки, и форма клетки в процессе спорообразования не изменяется (сибиреязвенная бацилла). Однако спора может быть шире поперечника клетки, и если она располагается в центре клетки, палочки приобретают веретеновидную форму (возбудитель газовой гангрены), а если спора находится на конце клетки, то она приобретает форму барабанной палочки (возбудитель столбняка).

9. В благоприятных условиях спора прорастает и превращается в вегетативную форму, проходя три стадии: активацию, инициацию и вырастание. При этом из споры в течение 4-5 часов образуется одна бактериальная клетка. Активация – готовность к прорастанию. Она ускоряется после прогревания при температуре 60-80° С. Инициация длится несколько минут. Вырастание характеризуется быстрым ростом, оболочка споры набухает за счет поглощения воды, а затем внутри споры усиливается активность ферментов, гидролизующих оболочку споры, и в образовавшееся отверстие выходит наружу бактериальный проросток, одетый в тонкую оболочку. Из него формируется вегетативная клетка, приступающая к размножению.

10. Малая проницаемость оболочки спор является причиной того, что при обычных методах окраски они остаются бесцветными. В неокрашенном состоянии спора сильно преломляет свет и видна внутри или вне бактериальной клетки в виде блестящего тельца.

Для окраски спор используют энергичные воздействия, приводящие к разрыхлению оболочки – сильные красители (5 % карболовый фуксин Циля) и подогревание. Медленно воспринимая краску, спора после этого с трудом отдает ее обесцвечивающим растворам (5 % H₂SO₄). При окраске спор по методу Ожешки, оболочку споры протравливают действием HCl при подогревании. Приготовленный мазок высушивают, но не фиксируют. На мазок наливают 0,5 % раствор HCl, подогревают 1-2 минуты и сливают кислоту. Мазок промывают водой, просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки. Далее окраску ведут методом Циля-Нильсена. Споры после обработки серной кислотой не обесцвечиваются и имеют красный цвет, а вегетативные формы после обесцвечивания докрашиваются метиленовым синим и имеют синий цвет.

11. В природе споровые микробы имеют широкое распространение: они встречаются в воздухе, воде, особенно в почве. Среди споровых бактерий имеются и болезнетворные.

О спорообразовании того или иного возбудителя инфекции надо хорошо знать, т.к. в связи с высокой резистентностью спор методы борьбы с инфекциями намного усложняются и применяются специальные способы стерилизации.

О жизнедеятельности и широком распространении споровых бактерий необходимо постоянно помнить при изготовлении лекарственных препаратов, растворов для подкожного или внутривенного введения, а также при заготовке перевязочного материала.

12. Способность к спорообразованию является довольно стойким видовым признаком целого ряда палочковидных бактерий. Но при некоторых условиях могут быть получены новые формы, навсегда утратившие способность к образованию спор. Например, Л. Пастером была получена неспорогенная вакцина из культуры бацилл сибирской язвы, выращиваемой при 42°С в течение 12-24 дней.

СТРОЕНИЕ, ОБРАЗОВАНИЕ, ЗНАЧЕНИЕ И МЕТОДЫ ОКРАСКИ СПОР У БАКТЕРИЙ.

Метод Циля-Нильсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых.

1.Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 мин.

2.Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин.

4.Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель).

Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.

NB! Кислотоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в рубиново-красный цвет, некислотоустойчивые - в сине-голубой.

Micobacterium tuberculosis. Мазок мокроты больного туберкулезом. Окраска по Цилю-Нильсену. «Карпова М.Р., Жданова О.С., 2010

Метод окраски по Цилю — Нельсену — метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесёный на препарат феноловый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.

Метод назван именами немецких медиков Франца Циля (1859—1926) и Фредерика Нельсена (1854—1894).

Этапы окраски

1. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё феноловый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2—3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.

2. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%-го раствора серной кислоты и промывают несколько раз водой.

3. Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 3—5 минут, промывают водой и высушивают.

При окраске по методу Циля — Нельсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.

Окраска по Цилю-Нильсену – это один из методов, используемый для обнаружения при исследовании анализов больного различных заболеваний. В случае изучения мокроты пациента на предмет наличия возбудителей, к примеру, туберкулеза широко используется данный метод. В этой статье пойдет речь о нюансах его проведения, а также о некоторых аналогичных методах.

Область применения метода

Этот метод окрашивания используется в тех случаях, когда необходимо выявить в образце кислотоустойчивые микроорганизмы, к которым относятся возбудители туберкулеза, проказы и микробактериозов. Такие бактерии характеризуются, прежде всего, медленной скоростью роста, общими морфологическими особенностями, а также устойчивостью к кислотам и некоторым другим химическим веществам. Из-за последнего свойства такие бактерии плохо поддаются окраске обычными разведенными красителями. Для окрашивания таких бактерий на препарат наносится и в дальнейшем поджигается фуксин Циля, причем полученная окраска не исчезает под воздействием спирта и кислот.

Необходимые реактивы и оборудование

Для проведения окраски образца по методу Циля-Нильсена необходимы следующие реактивы:

Метиленовый синий с 10%-ным содержанием спирта;
Раствор солянокислого спирта;
Фуксин Циля, состоящий из фенола, фуксина и этилового спирта в количестве 50 г, 10 г и 10 г соответственно.

Также потребуется следующие инструменты:

Газовая горелка;
Часы для слежения за временем;
Вода;
96%-ный этиловый спирт;
Перчатки.

Ход процедуры

Окрашивание по методу Циля-Нильсена состоит из следующих этапов:

На мазок, находящийся на предметном стекле, накладывается фильтровальная бумага, на которую затем наносится небольшое количество фуксина Циля.
Затем предметное стекло нагревается до появления характерного пара. После появления пара стеклу нужно дать остыть. Затем нужно повторить эту процедуру еще 2 раза, а затем дать подогретому мазку остыть.
После этого нужно смыть фуксин с приборного стекла, предварительно убрав бумагу, с помощью дистиллированной воды.
Затем стекло помещается в раствор соляной или серной кислоты до полного обесцвечивания.
Наконец, на обесцвеченный препарат наносится раствор метиленового синего. Стекло промывается дистиллированной водой и высушивается для дальнейшего исследования образца под микроскопом.

Липиды, которые содержатся в клеточной стенке кислотоустойчивых бактерий, хорошо удерживают цвет основного красителя. В некислотоустойчивых бактериях стабильно удерживается цвет как основного красителя, так и дополнительного.

Показания к применению метода

При подозрениях на туберкулез исследуется мокрота больного. Длительный кашель с обильными выделениями является показанием для проведения подобного исследования. Визуально наличие возбудителей туберкулеза в организме может выдать мокрота характерной жидкой, пенистой консистенции и признаками гноя, а также мокрота, смешанная с кровью. Обнаружение возбудителей туберкулеза – рисовидных телец, известных также как линзы Коха, облегчается при использовании методов окраски образца. Таких как вышеописанный метод Циля-Нильсена или метод Грама, суть которого будет описана ниже.

Метод Грама

Окраска препарата по методу Грама проводится следующим образом:

Сперва препарат обрабатывается раствором Люголя на протяжении минуты;
Затем препарат обесцвечивается с использованием спирта;
Наконец, препарат промывается с использованием воды и дополнительно окрашивается фуксином.

Классификацию бактерий на грамположительные и на грамотрицательные можно наглядно увидеть при проведении подобной окраски. Первый тип бактерий окрашивается в темно-фиолетовый цвет, тогда как второй тип – в красный цвет. Исходя из такой классификации, можно судить о химическом составе клеточной стенки бактерии и о других ее характерных свойствах.

Заключение

Анализ мокроты пациента является жизненно необходимым для своевременного выявления заболеваний, затрагивающих дыхательные пути, в том числе и туберкулеза. Окрашивание по методу Циля-Нильсена помогает выявить микроорганизмы и возбудители подобных болезней. В том числе и в случаях, когда речь идет об атипичных бактериях. Тем самым позволяет производить более точную и качественную диагностику подобных болезней.

Если вы сталкивались с подобными заболеваниями, знакомы с техниками исследования анализов больного на предмет наличия в них возбудителей инфекции или же у вас есть вопрос по теме, вы можете оставить свой комментарий.

Читайте также: