История открытия пцр кратко
Обновлено: 04.07.2024
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)— экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительно увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).
ДНК была открыта И.Мишером в 1869 году. Биологическая функция нового вещества была не ясна. Вплоть до 50-х годов ХХ века точное строение ДНК и способ передачи наследственной информации оставались неизвестными, хотя и было доказано, что ДНК состоит из нескольких цепочек, состоящих из нуклеотидов.
В 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный) изобрёл полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию.
В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК(РНК) при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК(РНК), достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Проведение ПЦР
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут.
ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.
Перспективы практического использования ПЦР-диагностики.
На данный момент метод ПЦР широко используется в следующих отраслях:
- Медицина, система санитарно-эпидемиологического контроля.
Этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. ИПП. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.
Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.
Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С , в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.
2. Ветеринария и растениеводство.
- инфекционные заболевания
- определение видовой принадлежности
- генная инженерия, микробиология, генетика и др.
- определение биологического загрязнения (санитарный контроль)
5. Судебная медицина
Итак, с момента возникновения идеи многократного увеличения числа копий искомой молекулы ДНК прошло сравнительно немного времени, тем не менее, технология ПЦР совершила гигантский рывок и стала неотъемлемой частью рутинной лабораторной практики, продолжая при этом совершенствоваться и развиваться.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию
Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лабораториях в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.
Целью любого лабораторного анализа является идентификация и определение концентрации искомого вещества. В современной медицине для этого широко используются методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК. К иммунологическим методам в первую очередь относят иммуноферментный анализ (ИФА). В плане обнаружения ДНК наибольшее распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Эти распространенные методы широко используются для определения антител, антигенов, ДНК.
Открытие ИФА и ПЦР стало возможно благодаря ряду открытий в области иммунологии и молекулярной биологии в 60-80-годы прошлого века.
ИФА — метод выявления антигенов или антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет:
- предварительной фиксации антигена или антитела на подложке;
- добавления исследуемого образца и связывание фиксированных антигена или антитела с антигеном-мишенью или антителом-мишенью;
- последующего добавления антигена или антитела, меченного ферментативной меткой с ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску под действием фермента. Изменение цвета реакционной смеси свидетельствует о присутствии в образце молекулы-мишени.Определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов проводят в сравнении с контрольными пробами.
В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях. На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа. Впервые такой анализ провели в 1971 году Е. Энгвал и П. Перлман для детекции IgG фракции иммуноглобулинов, К. Ван Веемен и А. Шурс для обнаружения эстрогенов.
Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Основными требованиями, предъявляемыми к твердой фазе при проведении ИФА, являются устойчивость к растворам, используемым в реакции, и высокая специфическая емкость (т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов). Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей, присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики.
Для ферментативной метки коньюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза, бета-галактозидаза, глюкозооксидаза и др. В качестве субстратного реагента также применяются разнообразные хромогенные вещества, продукты окисления которых как раз и регистрируются фотометрически при определенных длинах волн (волновой диапазон 340-750 нм).
Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного анализа.
Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Это исключительно важное обстоятельство позволило разработать диагностические иммуноферментные тест-системы экспресс-определения биологически активных соединений, нашедшие широкое применение в химической токсикологии, фармакологии, эндокринологии.
Основной принцип ИФА – специфическое связывание антитела с мишенью. Для получения антител первоначально использовали иммунизацию животных (обычно кролика) очищенным белком. Однако в этом случае получали смесь антител к разным антигенным детерминантам молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлонильным препаратом. Использование поликлональных антител имело два существенных недостатка: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различать сходные мишени, т.е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой.
Еще один серьезный недостаток: для получения антител каждый раз необходимо заново иммунизировать животных и очищать выделенную сыворотку. Это стоит немалых денег.
Благодаря разработке метода получения моноклональных антител (МАТ) с помощью техники гибридом стало возможно получение препаратов антител к одной антигенной детерминанте.
С.Мильштейн и Г.Келер за разработку техники получения гибридом, вырабатывающих МАТ с запрограммированной специфичностью, получили в 1984 году Нобелевскую премию в области медицины и физиологии. Они рассчитывали использовать гибридомы лишь для изучения генетики антител, а результат привел к подлинному буму. В основу метода положен давно известный принцип гибридизации (слияния) соматических, неполовых, клеток с последующим выделением и культивированием необходимого гибридного клона. Для слияния используют клетки двух видов. Первые — плазмоцитомы (опухолевые плазмоциты) из линий, культивируемых в искусственных условиях, invitro. Как и все злокачественные клетки они интенсивно размножаются без всякого внешнего стимула. Другие клетки —иммунные лимфоциты. Они несут в себе способность синтезировать и выделять необходимые антитела. Однако в пробирке эти клетки существуют лишь несколько дней.
К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, несколько тысяч гибридом, в т.ч. на 600 вирусных антигенов.
Преимущества МАТ:
- Главная особенность МАТ — чрезвычайная моноспецифичность (против одной антигенной детерминанты) и абсолютная однородность.
- Возможность многократного получения в течение длительного времени (воспроизводимость).
- Неограниченное количество получаемых антител.
По специфичности и чувствительности МАТ достигают значений, предельных для живой природы. Отсюда возможность использования для анализа антигенов не высокой степени чистоты.
Метод ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА.
Еще одним из важнейших современных методов диагностики заболеваний внутренних органов является ДНК-диагностика методом полимеразной цепной реакции.
ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации, заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его. ПЦР – это "in vitro" аналог биохимической реакции синтеза ДНК в клетке.
ПЦР — это циклический процесс, в каждом цикле которого происходит тепловая денатурация двойной цепи ДНК-мишени, последующее присоединение коротких олигонуклеотидов-праймеров и наращивание их с помощью ДНК-полимеразы путем присоединения нуклеотидов. В результате накапливается большое количество копии исходной ДНК-мишени, которые легко подаются детекции.
Открытию полимеразной цепной реакции сопутствовало развитие молекулярно-биологических технологий.
Первые данные о химических своиствах ДНК появились в 1868 г. К началу 50-годов ХХ в. было установлено, что ДНК – это линейный полимер, состоящий из нуклеотидов, состоящие из азотистого основания, пентозы и фосфатной группы. Основания бывают двух типов: пуриновые – аденин и гуанин и пиримидиновые – цитозин и тимин.
В 1953 г. Д. Уотсон и Ф. Крик пришли к выводу, что нативная ДНК состоит из двух комплиментарных полимерных цепей, образующих двойную спираль. Согласно модели Уотсона навитые одна на другую цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин – с цитозином. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой (растущей цепи) задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. В 1955 г. А. Корнберг открыл в клетках фермент, который назвал ДНК-полимеразой. ДНК-полимеразы обеспечивают репарацию и репликацию ДНК.
Эти ферменты способны удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3'-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был гибридизован, т. е. связан с комплементарной цепью ДНК, которая называется матрицей. Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (они используются в качестве строительных блоков).
Нуклеотид, который присоединяет ДНК-полимераза, комплементарен основанию в соответствующем положении матричной цепи. Многократно повторяя эту реакцию, полимераза способна удлинять 3'-конец праймера до тех пор, пока не достигнет 5 ' -конца матрицы. В ходе репарации и репликации двойной спирали ДНК каждая цепь служит матрицей для синтеза другой цепи.
В 1962 г. американские ученные Дж.Уотсон, Ф.Крик и М.Уилкинс получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за установление молекулярной структуры нуклеиновых кислот и ее роли в передаче информации в живой материи.
В 1971 г. Клеппе и соавт. представили данные, касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако возможность использования ПЦР в плане наработки огромного количества копий нуклеиновых кислот еще не рассматривалась. Возможно, это было связано с техническими трудностями связанными с необходимостью трудоемкого синтеза праймеров.
В 70-х годах были открыты специальные ферменты – рестрикционные эндонуклеазы, которые расщепляют ДНК в специфических точках. Исследователи получили возможность "разрезать" ДНК на более короткие и более стабильные фрагменты, которые просто идентифицировать. При этом стало проще выделять и изучать фрагменты ДНК с находящимися в них генами.
В начале 80-х годов проблема с синтезом праймеров была разрешена благодаря разработке автоматических синтезаторов ДНК.
В 1966 г. был открыт новый вид термофильной бактерии Thermusaquaticus (Taq), содержащий термостабильную Taq-ДНК-полимеразу. К. Мюллис в 1983-1984 гг. провел ряд экспериментов по разработке ПЦР и первый начал использовать Taq-ДНК-полимеразу вместо ранее использовавшейся неустойчивой к высоким температуры ДНК-полимеразы. Это позволило ускорить работы по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллис совместно с Ф. Фалуном разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет. За разработку ПЦР-анализа К.Мюллис в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.
Результатом открытия ПЦР стало немедленное практическое использование метода. В 1985 г. была опубликована статья, в которой была описана тест-система для диагностики серповидно-клеточной анемии на основе ПЦР. Начиная с 1986 г. К настоящему времени ПЦР посвящено более 10000 научных публикаций. Перспективы использования ПЦР представляются более чем впечатляющими.
В заключение хотелось бы сказать, что создатели любого диагностического метода должны стремиться к тому, чтобы он был: высокоспецифичным; высокочувствительным; достаточно простым и позволяющим получать однозначные результаты; иметь приемлемую стоимость исследования. ИФА и ПЦР сочетают эти качества в высокой степени.
С чего она начиналась. Конечно, с предшествующих открытий ДНК, принципа комплементарности, составляющих её аминокослот и использования фермента полимеразы для увеличения количества фрагментов лизированной ДНК.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR)изобрёл в 1983 году американский учёный Кэри Мюллис, работавший в области молекулярной биологии над созданием прибора под названием амплификатор.
Интересны обстоятельства, при которых у него появилась эта идея. Вот как это было… Открытию предшествовали размышления исследователя о проблеме разрушения обычной полимеразы в процессе воздействия высоких температур (до 95 град. С). В тёплую лунную майскую ночь биолог возвращался со своей дамой с дружеской вечеринки, девушка спала на заднем сидении кабриолета… Кэрри Мюллис вёл машину по пустынной дороге, освещенной лунным светом. И вот при таких романтических обстоятельствах у него появилась идея использовать полимеразу термоустойчивых бактерий, обитающих в термальных источниках!
В 1993 г. за воплощение в лабораторную практику молекулярной биологии этого изобретения он получил Нобелевскую премию.
В настоящее время ПЦР-диагностика является одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний, наследственных патологий, определения генетически модифицированных продуктов, идентичности биологического материала, в том числе в судебной практике.
ПЦР – диагностика стала необходимым элементом при постановке диагноза вирусных гепатитов В и С, назначении лечения интерферонами и его корректировке по дозам и срокам специфического лечения.
И как бы противники ПЦР-диагностики не критиковали на первых этапах внедрения ПЦР - исследований, молекулярно-генетические исследования прочно вошли в практику современных лабораторий.
Эпидемии гриппа А Н1N1 (Калифорния 09) 2009 г. и прошедшего эпидсезона 2015-2016 годов показали, что Роспотребнадзор по Республике Дагестан успешно справился с задачей диагностики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций у больных с тяжёлыми формами респираторной патологии.
ПЦР – диагностика с помощью мультиплексных тест-систем (на несколько инфекций) с успехом используется не только в диагностике ОРВИ, пневмоний, менингитов, а также для расшифровки вспышек пищевых токсикоинфекций, как на бактерии, так и на вирусы.
Практика показывает насущную необходимость широкого внедрения в практику всех лечебных учреждений республики ПЦР – диагностики вирусных гепатитов В и С, ВИЧ-инфекции, перинатальных инфекций, инфекций, передающихся половым путём(хламидиоз, уреаплазмоз, гонорея, герпес, гарднереллёз, микоплазменные инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека),а также для определения возбудителей острых кишечных инфекций для правильного подбора лекарственных средств с целью рационального лечения.
Амплификацией называется процесс копирования участков ДНК, обычно содержащих необходимые гены либо их сегменты. Именно амплификация отвечает за рост опухолей.
Назначение перчаточных боксов заключается в изоляции продукта и защите персонала от пагубного воздействия исследуемого объекта. Внешне перчаточный бокс представляет из себя герметичную камеру, изготовленную из стекловолокна, пластика или нержавеющей стали.
Что это такое?
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в пробе, позволяющий производить ряд манипуляций с нуклеиновой кислотой: например, сращивать фрагменты, вводить мутации и т. д. Метод ПЦР используется в биологии, криминалистике, экологии, но особо распространён в медицинской практике — с его помощью диагностируют болезни, устанавливают родительство, выделяют и клонируют гены.
История открытия ПЦР
Полимеразная цепная реакция была открыта в 1985 году — именно в этот год появилась первая научная публикация в журнале Science, касающаяся использования метода на практике. Изобретение приписывается американскому биохимику Кэри Муллису и датируется 1983 годом, а в 1993 году Кэри Муллис получил за ПЦР Нобелевскую премию по химии.
Целью Муллиса была выработка методики, которая позволила бы амплифицировать ДНК при помощи ДНК-полимеразы многократными последовательными удвоениями.
Изначально ПЦР была достаточно неудобным, долгим и дорогим методом, однако в 1986 году в реакции начали использовать ДНК-полимеразу термостабильных термофильных бактерий (среди которых была, к примеру, Thermus aquaticus, из которой выделили Taq-полимеразу), способных выдерживать много циклов амплификации. После Taq-полимеразы появились Pfu-разновидности, лишённые недостатков первого типа, а сейчас в большинстве случаев используют их смесь — эти смеси быстры и точны.
Принцип полимеразной цепной реакции
ПЦР по сути — многократное копирование некоторых фрагментов ДНК, которое осуществляется в рамках температурных циклов, in vitro.
Рабочая площадка состоит из амплификатора (термоциклера), ПЦР-бокса, микроцентрифуги, вортекса, автоматических дозаторов, системы гель-документации для исследования результатов и гель-электрофореза для их визуализации, а также расходных материалов — наконечников, штативов, пробирок.
Читайте также: