Флуоресцентная микроскопия кратко и понятно

Обновлено: 06.07.2024

Флуоресцентная микроскопия — метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбуждённых атомов и молекул образца. В флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой, а изображение получают в оптическом спектре. Излучение образца, соответственно, пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флуоресцентного препарата может сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Для некоторых изображений это время может достигать 60 минут.

Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия — метод, позволяющий получать изображения с некоторой глубины в середине образца. Простейший метод, с помощью которого можно исследовать поверхность, называют эпифлуоресцентной микроскопией.

Ссылки

Найти и оформить в виде сносок ссылки на авторитетные источники, подтверждающие написанное.
Дополнить статью (статья слишком короткая либо содержит лишь словарное определение).

Wikimedia Foundation . 2010 .

Полезное

Смотреть что такое "Флуоресцентная микроскопия" в других словарях:

флуоресцентная микроскопия — Термин флуоресцентная микроскопия Термин на английском fluorescence microscopy Синонимы Аббревиатуры Связанные термины биосенсор, клетка, конфокальная микроскопия, флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения, электронный микроскоп,… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

Флуоресцентная микроскопия — то же, что Люминесцентная микроскопия. См. также Микроскоп [метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия)] и Люминесцентный анализ … Большая советская энциклопедия

флуоресцентная микроскопия — fluorescencinė mikroskopija statusas T sritis fizika atitikmenys: angl. fluorescence microscopy vok. Fluoreszenzmikroskopie, f rus. флуоресцентная микроскопия, f pranc. microscopie à fluorescence, f … Fizikos terminų žodynas

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ — микроскопия, основанная на способности многих веществ светиться при ультрафиолетовом облучении. Дает возможность изучать изменения клеток и их отдельных структур при различных функциональных состояниях, различать живые и мертвые клетки … Словарь ботанических терминов

флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения — Термин флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения Термин на английском total internal reflection fluorescence microscopy Синонимы Аббревиатуры TIRFM Связанные термины клетка, флуоресцентная микроскопия, флуоресцентная наноскопия… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия — метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами. Возбуждение люминесценции микроскопических объектов, окрашенных флуорохромами, производится… … Официальная терминология

флуоресцентная наноскопия — Термин флуоресцентная наноскопия Термин на английском fluorescence nanoscopy Синонимы Аббревиатуры TIRFM, 4Pi, I5M, I5S, STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, PALM, STORM, PAINT Связанные термины конфокальная микроскопия, флуоресцентная микроскопия… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

флуоресцентная (люминисцентная) микроскопия — Высокочувствительный микроскопический метод (анализ проводится как в отраженном, так и в проходящем свете), основанный на обработке тестируемого материала красителями флуорохромами, флуоресцирующие (окрашенные) зоны выглядят при Ф.м. как яркие… … Справочник технического переводчика

МИКРОСКОПИЯ — общее название методов наблюдения в микроскоп неразличимых человеческим глазом объектов. Подробнее см. в ст. (см. МИКРОСКОП). Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. Главный редактор А. М. Прохоров. 1983 … Физическая энциклопедия

Флуоресцентная микроскопия – это оптический метод исследования объектов, где используется явление люминесценции или свечения. В основе лежит физический процесс, при котором вещество поглощает свет с одной длиной волны, и сразу после этого излучает свет уже с другой длиной волны. Соединения или фрагменты структуры, обладающие такими свойствами, называют флуорофорами.

Немного истории

Явление флуоресценции впервые обнаружил Джон Фредерик Уильям Гершель в 1845 году. Он заметил, что сам по себе бесцветный и прозрачный раствор хинина в солнечном свете излучает насыщенный небесно-голубой цвет. Открытие Гершеля заинтересовало британского учёного Джорджа Габриэля Стокса. Он продолжил исследование и обнаружил, что флуоресцентное излучение (эмиссия) объекта имеет бóльшую длину волны, чем свет, который первоначально возбуждает объект. Разница длин волн максимумов в спектрах поглощения и флуоресценции, открытая Стоксом в 1852 году, называется Стоксов сдвиг.

Первые флуоресцентные микроскопы сконструировали Август Кёлер (1904 год), Карл Райхерт и Оскар Хеймштадт (1911 год), а также Карл Цейсс и Генрих Леман (1913 год). Вначале учёные проводили исследования лишь с веществами, обладающими собственной флуоресценцией или аутофлуоресценцией. К таким веществам относится, например, аминокислота триптофан, входящая в состав большинства белков.

В 1930-х гг. появились первые флуоресцентные метки или зонды для маркировки нефлуоресцирующих объектов. В 1950-х гг. Альберт Кунс и Натан Каплан разработали метод обнаружения антигенов в тканях с использованием антител, меченных флуоресцентными красителями.

Сегодня флуоресцентная микроскопия применяется для решения разных задач, а оборудование и методы сильно превосходят те, с которых всё начиналось. В распоряжении учёных есть микроскопы с высоким разрешением и множество высокоселективных флуоресцентных зондов для маркировки самых разных объектов. (Рекомендуем статью: "Современные методы в генетическом анализе")

Особенности метода

Большинство компонентов клетки бесцветны и не чётко различимы под обычным микроскопом. С этой проблемой успешно справляется флуоресцентная микроскопия. Нужные для изучения структуры выделяют флуоресцентными метками – соединениями, поглощающими свет заданной длиной волны и после короткой задержки излучающими свет с большей длиной волны, чем поглотили. Например, если поглощается ультрафиолетовый свет, то излучаться будет синий свет или свет с ещё бóльшими значениями длин волн (зелёный, жёлтый, красный). Увеличение длины волны связано с тем, что в процессе поглощения-излучения теряется энергия, поэтому испускаемый фотон имеет меньше энергии, чем поглощённый. Чем ближе свет к красной зоне электромагнитного спектра, тем больше значение длины волны и меньше энергия фотонов.

Для каждого флуорофора характерны свои специфические спектры поглощения и излучения в зависимости от структуры молекулы и её окружения.

Флуоресцентная микроскопия превосходит методы исследования, при которых объекты окрашиваются поглощающими свет веществами. При использовании оптических красителей количество поглощённого света незначительно отличается от фона, поэтому получается трудноразличимое изображение с низким контрастом. А при исследовании с помощью флуоресценции можно увидеть даже отдельные макромолекулы. Флуоресцентная микроскопия позволяет избирательно исследовать отдельные компоненты в сложных биомолекулярных комплексах.

Чтобы увидеть расположение только флуоресцирующих объектов, излучаемый свет отсекают от возбуждающего специальным барьерным фильтром. При этом структуры, меченные флуоресцентными зондами, проявляются на чёрном фоне.

Как устроен флуоресцентный микроскоп?

Флуоресцентный микроскоп – это оптический микроскоп, который использует флуоресценцию вместо или в дополнение к исследованиям в отраженном и поглощённом свете. С его помощью проводят исследования даже очень маленьких объектов размером порядка 5 нм.

Основные элементы флуоресцентного микроскопа:

Источник света (ртутная, ксеноновая лампы, светодиод, лазер);
Фильтр возбуждения – полосовой фильтр, который пропускает только длины волн, поглощаемые флуорофором, и минимизирует возбуждение других источников флуоресценции;
Эмиссионный фильтр – полосовой фильтр, который пропускает только длины волн, излучаемые флуорофором, и блокирует другой нежелательный свет;
Дихроичное зеркало или тонкоплёночный фильтр – точный цветной фильтр, выборочно пропускающий свет узкого диапазона цветов при отражении других цветов.

Задачи флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентная микроскопия применяется для изучения свойств органических и неорганических веществ в материаловедении, биологии, медицине, физике.

Основная область применения – клеточная биология, особенно нейробиология. Флуоресцентная микроскопия позволяет чётко увидеть определённые структуры в клетке, получить количественные и качественные характеристики о взаимодействиях внутри клетки, анализировать морфологию, внутриклеточные физиологические изменения.

Разработано множество флуоресцентных зондов для изучения процессов в ядре, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, синаптических везикулах. Есть зонды, способные связываться с белками или встраиваться в липидные структуры. (Рекомендуем статью: "Современный подход к культивированию микроорганизмов и культур клеток")

С помощью флуоресцентной микроскопии исследуют инфекционные болезни, клетки крови, костный мозг, изучают фоторецепторы сетчатки глаза.

Преимуществами метода считаются высокая чувствительность, возможность комбинировать флуоресцентные зонды и окрашивать разными цветами отдельные объекты в исследуемом образце, одновременно отслеживать несколько типов макромолекул, проводить мультиплексный анализ. Эти подходы используются для изучения строения, функций клеток, организации клеточных структур, подвижности объектов.

К ограничениям флуоресцентной микроскопии относятся потеря способности к флуоресценции или фотообесцвечивание при накоплении повреждений от электронов, возбуждающихся при флуоресценции, а также фототоксичность для некоторых объектов. Для снижения фототоксичности используют лазерные сканирующие микроскопы с нелинейной оптикой, которые возбуждают флуорофоры длинами волн, близкими к инфракрасному свету. Это значительно снижает токсический эффект и увеличивает время проведения исследования.

В современных флуоресцентных микроскопах изображение объекта получают в цифровом формате. Управление фокусировкой, высотой предметного столика, оптикой, фильтрами, детекторами осуществляют при помощи компьютера. Используются технологии оптоэлектроники, при помощи которых можно управлять субклеточными структурами специальными оптическими пинцетами.

Одним из современных вариантов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия с применением лазерных источников света. Её особенность в использовании точечной диафрагмы, которая размещается в плоскости изображения и ограничивает поток фонового рассеянного света. Лазерная конфокальная микроскопия даёт трёхмерное изображение объекта, позволяет изучать структуру, в динамике исследовать развитие клеток и тканей, в том числе живых.

Несмотря на то, что основы для развития современной флуоресцентной микроскопии были заложены более 100 лет назад, интерес к этому быстрому, точному и относительно простому методу сохраняется до сих пор. Он находит широкое применение в разных областях науки и лабораторной диагностики. На протяжении последнего десятилетия ежегодно по исследованию объектов и процессов методом флуоресцентной микроскопии публикуется от 5000 до 10000 научных статей.

Флуоресцентная микроскопия (или эпифлуоресцентный ) представляет собой метод с использованием оптического микроскопа , воспользовавшись явлений флуоресценции и фосфоресценций вместо или в дополнении к обычному наблюдению отражения или поглощением естественного или искусственного видимого света.
Таким образом, мы можем наблюдать различные объекты, вещества (органические или неорганические) или образцы мертвых или живых организмов.

Инвертированный флуоресцентный микроскоп (Nikon TE2000); Оранжевая пластина позволяет пользователю смотреть на образец, защищая глаза от ультрафиолетового света, который возбуждает флуоресценцию цели.

"> Читать СМИ

Сейчас это часть классических методов исследования и биологии и продолжает развиваться с помощью молекулярной визуализации .

Резюме

Принципы

Флуоресценциями являются собственностью обладала определенными органами , чтобы излучать свет после поглощения фотонов более высокой энергии. Флуоресцентная микроскопия основана на формировании изображения путем обнаружения излучаемого света. Сдвиг Стокса описывает разницу между длиной волны , поглощаемой длине объекта (испускаемого источником света микроскопа) и излучаемого объекта. Чем больше разница между двумя длинами волн, тем легче наблюдать флуоресценцию.

Первичная и вторичная флуоресценция

Во флуоресценции различают два типа объектов:

Таким образом, флуоресцентная микроскопия позволяет непосредственно визуализировать флуоресцентные вещества. Для нефлуоресцентных веществ, клеток, молекул необходимо пометить их веществами, называемыми флуорохромами, такими как DAPI, который маркирует ДНК и флуоресцирует синим цветом.

Некоторые генетические маркеры, такие как зеленый флуоресцентный белок (на английском языке Green Fluorescent Protein или GFP), также широко используются в биологии в генетически модифицированных организмах для их эндогенного производства . В этом случае флуорохром представляет собой белок, продуцируемый непосредственно самой клеткой и не требующий добавления субстрата. Затем флуоресценцию можно визуализировать непосредственно в живых клетках, это одна из областей, разработанных с помощью молекулярной визуализации .

Методы маркировки

Могут использоваться многие техники маркировки:

Простое мечение осуществляется за счет сродства флуорохрома к маркируемой молекуле.
Прямое или непрямое иммуноокрашивание включает меченые антитела.
Методика FISH используется для маркировки нуклеотидных последовательностей.
Использование гибридных белков (обычно GFP ) заключается во введении в наблюдаемую клетку флуоресцентного гена рекомбинантного белка (путем трансфекции или инфицирования), синтезированный белок затем становится флуоресцентным.
FLIP и FRAP состоит в облучении площадь которого флуоресценции исчезнет. Эти методы позволяют изучать диффузию меченых молекул, фактически, если молекулы движутся, флуоресценция будет распространяться.
FRET использует два флуорохромию, донор , который будет передавать свою энергию другого флюорохрома акцептора. Это дает возможность изучать взаимодействия между двумя молекулами.
BRET (Биолюминесценция резонансная передача энергии) в качестве FRET кроме донора биолюминесцентного ( люциферазы ).

Однофотонное возбуждение

источник света для волнения,
флуорофор,
фильтры для отделения испускаемых фотонов от возбуждающих фотонов,
точечное отверстие,
детектор для преобразования светового сигнала фотонов в электрический сигнал.

Многофотонное возбуждение

Это возбуждение состоит из почти одновременного поглощения нескольких фотонов возбуждения с длиной волны, кратной оптимальной возбуждению на одном фотоне. Для этого используется импульсный лазер на частотах, близких к инфракрасному. В этом случае возбудителем является только фокус лазерного луча (достаточная плотность фотонов для передачи энергии возбуждения). Часто приложения ограничиваются двухфотонной микроскопией (возбуждение флуорофора двумя фотонами).

Эта система считается важным технологическим достижением по трем основным причинам:

В двухфотонном микроскопе нет такой вещи, как конфокальная радужная оболочка (точечное отверстие). Таким образом, мы больше не можем говорить о конфокальной микроскопии, хотя термин многофотонная конфокальная микроскопия иногда используется неправильно.
Использование возбуждающего света с высокой длиной волны (> 900 нм ) обеспечивает большее проникновение в образец (до 500 мкм вместо 150 мкм ), что дает возможность работать с более толстыми образцами.
Поскольку возбуждение флуорофоров ограничено фокусом лазерного луча , риск фотообесцвечивания снижается.

На практике эффективность излучения флуоресценции ниже, чем у конфокального одиночного фотона, и отношение сигнал / шум ниже. Таким образом, он показывает небольшое преимущество для наблюдения за культивированными клетками или срезами тканей ( толщиной 50-70 мкм ).

Естественно, что этот метод используется для одновременного возбуждения нескольких флуорофоров с разными спектрами излучения.

Вариант этого метода - флуоресцентная микроскопия с многофокальным многофотонным возбуждением . Принцип идентичен, но лазерный луч разделен на несколько лучей, что позволяет сканировать несколько точек одновременно. Это позволяет сократить время получения изображений.

Различные типы микроскопов

Методы флуоресценции можно использовать с микроскопами разных типов:

обычный оптический микроскоп . Также принято пропускать возбуждающий свет через объектив, а не под образец. Это называется эпифлуоресцентной микроскопией .
конфокальный лазерный сканирующий микроскоп . Эта ассоциация самая распространенная. Конфокальный микроскоп достигает гораздо лучшее разрешение , чем обычный оптический микроскоп , а также позволяет трехмерный изображения объекта должны быть сделаны.
флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения . В частности, это позволяет получить лучшую глубину резкости (200 нм ), чем конфокальная микроскопия (600 нм ), но только у основания образца, а точнее на уровне границы раздела между образцом и подложкой. .

флуоресценции корреляционная спектроскопия (FCS) , используется для изучения диффузии молекул и молекулярных взаимодействий. Это часто связано с конфокальной лазерной сканирующей микроскопией. [1]

Фильтрация в эпифлуоресцентном микроскопе

Эти устройства имеют сменные детали кубической формы, расположенные на вращающейся башне или на язычке, в зависимости от производителя.

По направлению к источнику находится фильтр возбуждения.

Со стороны наблюдателя находится барьерный фильтр.

Кубики перечислены в соответствии с возбуждающим светом: ультрафиолетовый, фиолетовый, синий, зеленый .

Ограничения флуоресцентной микроскопии

Иллюстративная галерея

Эпифлуоресцентная визуализация трех компонентов делящейся раковой клетки человека. ДНК появляется синим цветом, А белок под названием INCENP появляется в зеленом цвете, а микротрубочки в красном цвете. Каждый флуорофор был визуализирован отдельно, с определенной длиной волны возбуждения и фильтрами, затем изображение было перекомпоновано из фотографий, сделанных камерой CCD .

Эндотелиальные клетки легочной артерии крупного рогатого скота (ядра, окрашенные в синий цвет с помощью DAPI, микротрубочки, помеченные зеленым цветом с антителом, связанным с FITC, и актиновые филаменты, помеченные красным с фаллоидином, связанным с белком TRITC).

Ядро лимфоцитов человека, окрашенное DAPI с хромосомами 13 (зеленый) и 21 (красный), зондами, гибридизированными с центромерами ( гибридизация in situ при флуоресценции ).

Мембрана дрожжевой клетки , демонстрация структуры (желтым цветом), полученная слиянием мембранных белков с двумя флуоресцентными маркерами (RFP и GFP).

Обнаружение молекулы YFP в раковой клетке человека в нанометровом масштабе.

Ядро клетки рака кости (метод, называемый двухцветной локализационной микроскопией или 2CLM для англоговорящих). Изображение получено путем флуоресценции маркеров, слитых с белками GFP и RFP, для 120 000 молекул, расположенных в ограниченной области (470 мкм 2 ).

Флуоресцентный микроскоп (лат. fluo — течь, греч. μικρός — маленький и греч. σκοπέω — смотрю) — специализированный оптический микроскоп, предназначенный для изучения свойств органических или неорганических веществ с использованием явления флуоресценции (люминесценции). При этом возможно проводить исследования образцов под действием [1] [2]

Содержание

В основе Флуоресцентный микроскопии лежит метод, впервые сформулированный российским физиком Андреем Климовым (защищённый патентом РФ 2305270, приоритет от 18 мая 2005г. и смежными ему зарубежными патентами), позволяющий увеличить разрешение оптических микроскопов на два и более порядка [3] . Аналогичный принцип был впервые реализован на практике Эриком Бетзигом (Eric Betzig, Нобелевская премия по химии 2014). Дата патентного приоритета Бетзига - 23 мая 2005г, на 5 дней позже даты патентного приоритета Климова.

Однако, патент на устройство (который оспаривается) принадлежит разработчику и создателю Флуоресцентного микроскопа Штефану Хеллу (Stefan Hell) из Института биофизической химии (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry (Karl Friedrich Bonhoeffer Institute)) — 2006 год.

Большинство Флуоресцентных микроскопов предназначены для исследований в отражённом свете.Эти микроскопы стали важным инструментом в области биологии, открывая возможности для более передовых направлений микроскопии, типа конфокальной микроскопии позволяющий получать изображения не только с поверхности, но и с некоторой глубины образца.

Описание

Устройство микроскопа Olympus BX 51 для исследования образцов методом эпи-флуоресценции в проходящем и отражённом свете

Процесс поглощения энергии фотонов органическими и неорганическими веществами, с последующим испусканием лучей, имеющих большую длину волны, известен как явление флуоресценции (свечения). Эмиссия света образцом, после облучения более коротковолновым излучением, появляется одновременно с началом поглощения возбуждающего излучения. При этом излучение имеет большую длину волны, чем возбуждающее излучение. В случае, когда время свечения после прекращения возбуждающего излучения составляет более микросекунды, процесс называется фосфоресценцией.

Впервые это явление было открыто и описано англичанином Джордж Стокс Г. в 1852 году. Он заметил, что минерал флюорит начинал светиться красноватым светом, при освещении его ультрафиолетовыми лучами. Дальнейшие исследования показали, что многие объекты: органические и неорганические вещества, кристаллы, смолы, масла, хлорофилл, витамины и др. флюоресцируют при освещении их ультрафиолетовыми лучами. Лишь с 1930 годов началось использование явления флюоресценции в биологических исследованиях. Исследуемые элементы (ткани, бактерии, болезнетворные микроорганизмы и пр.) для их выявления стали окрашивать флуоресцирующими красителями. Это послужило толчком к созданию метода флуоресцентной микроскопии.

Основной принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в облучении образца заданной определенной полосой длин волн вызывающих флуоресценцию образца. Затем необходимо выделить намного более слабое излучение флуоресценции. В идеально настроенном микроскопе, только свет от флуоресценции должен достичь глаза исследователя или детектора так, чтобы в результате флуоресцентные структуры выделялись с высокой контрастностью на очень темном (или черном) фоне. Проблема состоит в том, что свет возбуждения, как правило, в несколько сотен тысяч, а иногда и в миллион раз ярче, чем свет излучаемой флуоресценции.На рисунке показана схема (в разрезе) современного флуоресцентного микроскопа для проведения исследований в проходящем и отражённом свете.

Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа состоит из источника ультрафиолетового излучения, возбуждающего и запирающего светофильтров, теплового (теплозащитного) фильтра и специального люминесцентного объектива. Источник света излучает волны в ультрафиолетовой области спектра, которые проходят через фильтр, где отсекаются волны другого спектрального ряда. Ультрафиолетовые лучи попадают на изучаемый препарат и вызывают его люминесценцию. Свет люминесценции проходит через запирающий фильтр, который не пропускает свет возбуждения (ультрафиолетовые волны) и далее формирует изображение в объективе. Для проведения флуоресцентной микроскопии используют метод освещения препарата в проходящем свете и метод освещения в падающем свете.

Следует отметить, что флуоресценция является единственным способом в оптической микроскопии, при которой образец, после возбуждения, сам излучает свет. При этом свет излучается сферически во всех направлениях, независимо от направления источника возбуждающего света.

Читайте также: