Принципы иммерсионной микроскопии кратко

Обновлено: 30.06.2024

Иммерсия (иммерсионный метод микроскопического наблюдения) в оптической микроскопии — это введение между объективом микроскопа и рассматриваемым предметом жидкости для усиления яркости и расширения пределов увеличения изображения.

Иммерсионная система — оптическая система, в которой пространство между первой линзой и предметом заполнено жидкостью. Применяемая таким образом жидкость называется иммерсионной.

Содержание

Принцип действия

Из основной формулы разрешающей способности микроскопа: d = 0,61λ/А, следует, что предел разрешения определяется длиной волны λ и числовой апертурой объектива А. Так как не всегда возможно изменить длину волны (особенно если исследование производится в белом свете), то для достижения лучшего разрешения стремятся применять объектив, имеющий бо́льшую числовую апертуру.

В этом случае числовая апертура увеличивается, а предел разрешения уменьшается в n₂ раз.

Дополнительные преимущества

Иммерсионные жидкости

В расчёте объективов микроскопа оптические параметры иммерсионной жидкости (показатель преломления и дисперсия) учитываются при коррекции аберраций оптической системы (исправление кривизны поля, сферических и хроматических аберраций).

Водный раствор глицерина (1,434) (1,3346)
Вода (1,3329)
Монобромнафталин (1,656) (1,503)
Йодистый метилен (1,741)

Иммерсионное масло

В качестве первой иммерсионной жидкости применялось природное кедровое масло. Однако его главным недостатком было изменение свойств с течением времени. На воздухе жидкость постепенно уплотнялась, вплоть до осмоления и отвердения, показатель преломления менялся.

В XX веке начало производиться и ныне применяется исключительно синтетическое иммерсионное масло, не обладающее этим недостатком.

Считается, что первый серийный микроскоп с рассчитанным объективом масляной иммерсии появился в 1878 году.

Основные параметры иммерсионного масла стандартизованы.

Некоторое отличие в стандартах означает, в частности, возможное ухудшение работы конкретного объектива с несоответствующим ему маслом. Результатом этого могут быть:

снижение контраста из-за появления сферической аберрации
окраску поля на объекте
неравномерность освещенности в плоскости предмета (объекта) и, соответственно, в плоскости, где формируется изображение объекта
нерезкость по полю в плоскости изображения объекта.

Водный раствор глицерина

Глицерин — применение в качестве иммерсионной жидкости нашёл благодаря пропусканию ультрафиолетового диапазона электромагнитных волн. Используется в виде водного раствора определённой концентрации. Первый объектив глицериновой иммерсии был рассчитан в 1867 году.

Используется дистиллированная вода. Считается, что впервые в серийный микроскоп рассчитанный объектив водной иммерсии был введён в 1850 году.

Коррекционные оправы

Необходимо проверить точность фактов и достоверность сведений, изложенных в этой статье.
На странице обсуждения должны быть пояснения.

В конструкцию ряда иммерсионных объективов входят коррекционные оправы. Их установка определяет точное взаиморасположение линзовой системы объектива и покровного стекла. Наибольшее влияние точность задания этого взаиморасположения оказывает на компенсацию сферической аберрации оптической системы микроскопа.

На корпусе объектива обычно нанесена маркировка, показывающая:

Соответственно, на корректирующей оправе наносится конкретное значение, под которое скомпенсировано данное сочетание объектива и оправы. Смена корректировочных оправ требуется в следующих случаях:

Работа с разными жидкостями

Толщина покровного стекла

Работа со стандартным покровным стеклом (n = 1,52) требует корректировки и на толщину покровного стекла, если объектив рассчитан на водную (n = 1,33) или глицериновую (n=1,47) иммерсию. Такие аппараты имеют на корпусе буквенные метки, указывающие правильное положение коррекционного кольца для конкретного типа жидкости, а в пределах этой метки указываются толщины покровных стекол, для которых компенсация сферической аберрации минимальна.

История

Дэвид Брюстер в 1812 году предложил иммерсию как средство исправления хроматических аберраций объектива, и приблизительно в 1840 году Джованни Баттиста Амичи (1786—1868) изготовил первые иммерсионные объективы. В качестве иммерсионной жидкости применялись анисовые масла, так как их показатель преломления был наиболее близок к таковому для стекла.

Однако при этом не ставилась задача увеличения апертуры. Амичи понял эту проблему. Но из-за высокой стоимости предметных стекол микроскописты XIX века ещё не уделяли должное внимание масляной иммерсии. В результате он занялся водной иммерсией. В 1853 году он сконструировал водно-иммерсионный объектив и выставил его в 1855 году в Париже.

Роберт Толл (1820—1883) в 1858 году создал объектив с заменяемыми фронтальными линзами: одна — для работы в сухом состоянии, а другая — для водной иммерсии.

Эдмунд Хартнал (1826—1891) в 1859 году продемонстрировал свои первые водно-иммерсионные объективы с коррекционным кольцом. В последующие 5 лет он продал около 400 штук. Это породило целый бум производства объективов для водной иммерсии среди многих немецких производителей микроскопов, например Бруно Хазерта в Айзенахе, Келлнера в Вецларе, G&S Мерц в Мюнхене и Хугo Шродера в Гамбурге. Однако иммерсионные объективы Хартнала считались лучшими.

Оптические мастерские Цейсс в Йене изготовили в 1871 г. первые водно-иммерсионные объективы. И уже в 1872 г. Карл Цейсс внедрил водно-иммерсионные объективы Аббе. В тогдашнем каталоге Цейсса предлагались 3 объектива, которые все имели угол поля зрения 180°. Они имели различные рабочие расстояния, но постоянную числовую апертуру 1,0; объектив № 3 имел коррекционное кольцо, компенсирующее сферическую аберрацию.

В 1871 г. Толл представил новое открытие: для однородной (масляной) иммерсии он использовал иммерсионную среду Канадский бальзам, который имеет такой же показатель преломления, что и обычно используемое тогда стекло крон. В августе 1873 г. он изготовил трёхлинзовый объектив для однородной масляной иммерсии с числовой апертурой А = 1,25. Это достижение было признано рекордом для микроскопов. Но в том же месяце рассчитанный им объектив для глицериновой иммерсии достиг числовой апертуры А = 1,27.

Роберт Кох стал одним из первых исследователей, применивших масляно-иммерсионные объективы Аббе и систему конденсоров Аббе.

В 1904 г. предприятия Карл Цейсс изготовили 10-тысячный объектив для масляной иммерсии.

Техника работы

Масляная иммерсия

На готовый высушенный препарат наносят 20-25 мкл монтирующей жидкости
Покрывают препарат обезжиренным покровным стеклом
На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла, и наблюдают с иммерсионным объективом (маркировка — чёрная полоса ближе к фронтальному компоненту).

Водная иммерсия

На готовый препарат наносят каплю 20 м/моль фосфатного буфера, рН 7,4
Микроскопируют объективом для водной иммерсии (маркировка — белая полоса ближе к фронтальному компоненту)

Значение

Введение в микроскопию иммерсионных объективов (водная иммерсия, 1850, масляная, 1878) имело большое значение для цитологии, позволило решительно увеличить контраст изображения отдельных частей клетки. [1]

Примечания

Источники

Wikimedia Foundation . 2010 .

Полезное

Смотреть что такое "Иммерсия (микроскопия)" в других словарях:

Иммерсия (оптика) — У этого термина существуют и другие значения, см. Иммерсия. Иммерсионный метод (от лат. immersio погружение) метод определения показателя преломления изолированных твёрдых тел путём погружения их в жидкости с заранее известным показателем… … Википедия

Оптическая микроскопия — Современный оптический микроскоп Микроскоп (от греч. μικρός малый и σκοπεῖν смотрю) оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом. Содержание … Википедия

Оптический микроскоп — Современный оптический микроскоп Микроскоп (от греч. μικρός малый и … Википедия

Иммерсионный метод рефрактометрии — (от лат. immersio погружение) или метод Бекке метод определения показателя преломления изолированных твёрдых тел путём погружения их в жидкости с заранее известным показателем преломления. Содержание 1 Измерение сравнением … Википедия

МИКРОСКОП — (от греч. mikros малый и skopeo смотрю), оптический инструмент для изучения малых предметов, недоступных непосредственному рассмотрению невооруженным глазом. Различают простой М., или лупу, и сложный М., или микроскоп в собственном смысле. Лупа… … Большая медицинская энциклопедия

Цитология — (от Цито. и . Логия наука о клетке (См. Клетка). Ц. изучает клетки многоклеточных животных, растений, ядерно цитоплазматические комплексы, не расчленённые на клетки (симпласты, синцитии и плазмодии), одноклеточные животные и… … Большая советская энциклопедия

Дифракционный предел — Дифракционный предел это минимальное значение размера пятна (Пятно рассеяния), которое можно получить, фокусируя электромагнитное излучение. Меньший размер пятна не позволяет получить явление дифракции электромагнитных волн. Дифракционный… … Википедия

Иммерсионная микроскопия – это методика микроскопического исследования различных объектов, основанная на введении между объективом и предметным стеклом иммерсионных жидкостей.

Данный иммерсионный метод микроскопии применяется для того, чтобы свет проходил через рассматриваемый предмет, иммерсионную жидкость, при этом луч не преломлялся. Благодаря этому происходит получение изображения более высокого качества и разрешения.

Немаловажным моментом в иммерсионном микроскопе является та самая жидкость, благодаря которой и получается изображение такого качества. При прохождении светового луча через предметное стекло с препаратом, он сталкивается в последующим с иммерсионной средой, которой является иммерсионная жидкость. Именно за счет нее происходит уменьшение преломления данного светового луча, и именно поэтому в объектив попадает гораздо больше света, что дает такую яркую, четкую картинку у исследователя.

На иммерсионном объективе всегда есть соответствующая маркировка, которая говорит о том, какой тип иммерсии имеется в нем:

Oil – объектив с масляной иммерсией;
W – объектив с водной иммерсией;
S – силиконовая иммерсия.

Начало применения иммерсионных микроскопов ознаменовалось такими масляными иммерсионными средами, как кедровое масло, глицерин, масло вазелиновое. Однако, с течением времени ученые выяснили тот факт, что их свойство значительно меняется, масло начинает менять консистенцию, загустевания, вплоть до того, что становиться твердой массой, меняется его цвет, а, следовательно, и коэффициент преломления при микроскопировании. Что уже дает негативный эффект при проведении микроскопического исследования объекта. Именно поэтому было принято решение использовать только лишь синтетические масла в качестве иммерсионных сред, которые не обладают такими негативными моментами как натуральные продукты.

К тому же в современных вариантах иммерсионных микроскопов используются объективы, на которые нанесено специальное покрытие, которое улучшает цветопередачу при иммерсионной микроскопии, а также имеет защитные свойства, которые защищают объектив от мелких царапин в процессе эксплуатации соответствующего оборудования.

Иммерсионная микроскопия.Применяется для увеличения разрешающей способности метода световой микроскопии. Разрешающая способность системы светооптической микроскопии определяется длиной волны видимого света и числовой апертурой системы. Числовая апертура показывает величину угла максимального конуса света, попадающего в объектив, и зависит от оптических свойств (преломляющей способности) среды между объектом и линзой объектива. Погружение объектива в среду (минеральное масло), имеющую высокий коэффициент преломления, близкий к таковому у стекла, препятствует рассеиванию света от объекта. Таким образом, достигается увеличение числовой апертуры и соответственно разрешающей способности. Для иммерсионной микроскопии применяют специальные иммерсионные объективы, маркированные черной полосой и снабженные меткой (МИ — масляная иммерсия).

Фазово-контрастная микроскопия.Предназначена для изучения нативных (живых и неокрашенных) препаратов за счет повышения их контрастности. При прохождении света через окрашенные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные объекты — фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают ме-

таллом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы. В оптической системе микроскопа применяют специальный конденсор с револьвером диафрагм и центрирующим устройством. Неокрашенные объекты выглядят темными на светлом поле (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия Метод основан на явлении фотолюминесценции. Люминесценция (флюоресценция) — это способность некоторых объектов или веществ светиться при воздействии ультрафиолетового или другого коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра. Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся сторону, свечение может быть красным или желтым. Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первичная люминесценция (биолюминесценция) наблюдается без предварительного окрашивания за счет собственных люминесцирующих веществ, вторичная — возникает после окрашивания флюорохромами (ауромин, корифосфин).

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследовать живые микробы и обнаруживать их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченых флюоресцирующими красителями антител с антигенами изучаемого объекта.

Наиболее широко используются два способа электронной микроскопии: просвечивающая (трансмиссивная) и сканирующая. Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме и др. Сканирующая электронная микроскопия применяется для получения трехмерного изображения поверхности исследуемого объекта.

5. Устройство биологического микроскопа

Увеличение изображения достигают системой линз конденсора, объектива и окуляра. Конденсор, расположенный между источником света и изучаемым объектом, собирает лучи света в поле микроскопа. Объектив создает изображение поля микроскопа внутри тубуса. Окуляр увеличивает это изображение и делает возможным его восприятие глазом. Предел разрешения микроскопа (минимальное расстояние, на котором различимы два близко расположенных объекта) определяется длиной световой волны и апертурой линз. Теоретически возможный предел разрешения светового микроскопа равен 0,2 мкм; реальное разрешение можно повысить за счет увеличения апертуры оптической системы, например, путем увеличение коэффициента преломления. Коэффициент преломления (иммерсии) жидких сред больше коэффициента преломления воздуха (n=1.0), что используется для увеличения предела разрешения. В качестве иммерсионных сред используют глицерин, иммерсионное масло (кедровое или синтетическое), препятствующие рассеиванию света от объекта.

В микроскопе различают две части: механическую и оптическую. К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя), тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик, механизмы для грубого (макровинт) и тонкого (микровинт) регулирования изображения. Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая, в свою очередь, состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также автономного или встроенного осветителя.

5. Устройство биологического микроскопа

· окуляр - даёт мнимое перевернутое разрешение, делает разрешение более крупным, но не увеличивает детали, это делает только инверсионный объектив.

Преимущества: позволяет выделять отдельные структуры м/о

Недостатки: при окрашивании и фиксировании искажаются структуры м/о

Сфера применения: цитология, микробиология. Лабораторная диагностика

Фазово-контрастный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты за счет повышения их контрастности.

При микроскопии неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности света (амплитуды) не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн.

Человеческий глаз этих изменений заметить не может, и наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными. Для изучения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на преобразовании невидимых фазовых изменений световых волн в амплитудные, различимые глазом.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе. Оно состоит из:

•набора объективов со специальными фазовыми пластинками;

•коденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, действия вирусов на клетки. В этих случаях часто применяют инвертированные микроскопы (с обратным расположением оптики). У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху.

Преимущества: клетки живые, не причиняем им вред

Недостатки: отдельные структуры изучить не можем (используется для живых м/о, в микологии, образовании споровых капсул)

Сфера применения: микробиология, лабораторная диагностика, гистология

Темнопольный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для темнопольной микроскопи пользуются обычными объективами и специальными темнопольными парабалоид-конденсорами, центральная часть которых затемнена, так что прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. В объектив попадают только те лучи, которые отклоняются частицами препарата. Поэтому в темнопольном микроскопе микроорганизмы видны бесцветными на темном фоне.

Метод темнопольной микроскопии используется для изучения живых бактерий и их подвижности. При помощи этого метода могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. С помощью темнопольной микроскопии изучают нативные препараты типа "раздавленной" или "висячей капли".

Сфера применения: микробиология, лабораторная диагностика, гистология.

8.Люминесцентный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения и красителей светиться под действием падающего на них света.

Свечение объектов возникает в результате поглощения ими лучистой энергии. Свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами, либо сине-фиолетвыми. Возникает люминесценция в цветовой гамме всего или большей части видимого спектра, что дает цветное изображение. Объект, не дающий явления люминесценции, окрашивают специальными красителями - флюорохромами.

В медицинской микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флюорохромирование (окрашивание флюорохромами) и флюоресцирующих антител (реакция иммунофлюоресценции - РИФ).

Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изображения, дает возможность различить отдельные клеточные структуры. Люминесцентная микроскопия применяется для бактериоскопии инфекционных возбудителей, для цитохимического исследования живых и фиксированных микроорганизмов. В РИФ с помощью антител, меченных флюорохромами, выявляются антигены микроорганизмов или антитела в сыворотке больных. РИФ используется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.

Сфера применения: микробиология, лабораторная диагностика, гистология.

Читайте также: