Метод тонкослойной хроматографии кратко

Обновлено: 02.07.2024

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) – важный аналитический, физико-химический и микропрепаративный метод, который отличается простотой, высокой экономичностью и универсальностью. Тонкослойная (планарная) хроматография – оперативный метод хроматографии для анализа всех классов химических соединений, приобрела значение в качестве экспресс-метода анализа и широко используется в науке, промышленности, медицине, фармации, ветеринарии, в контроле загрязнений окружающей среды, в центрах Госсанэпидемнадзора, стандартизации и метрологии и. т.д.[1–3].

В развитии современной тонкослойной хроматографии можно выделить следующие направления: инструментализация и автоматизация ТСХ на всех стадиях анализа; использование новых сорбционных материалов и элюентов; разработка новых способов и приемов хроматографирования. Перспективными считаются варианты: хроматографирование под давлением, в непрерывном потоке элюента, с управляемой газовой фазой (ТСХ-УГФ) [2, 4].

Исследования показали, что с помощью метода ТСХ можно получить важную информацию о характере метаболизма углеводов в биологических жидкостях при патологических состояниях организма [3]. Для ранней диагностики нарушений минерального обмена у животных предложен способ определения гексоз в сыворотке крови методом ТСХ [5].

Тонкослойная хроматография применяется в контроле лекарственных средств с целью использования их в терапевтической практике [6, 7] и ветеринарии [3]. Разделение и определение водорастворимых и жирорастворимых витаминов осуществляется методом ТСХ [3, 6, 8].

Хроматографические методы анализа являются надежным методом экспрессного контроля за содержанием в атмосфере и других объектах окружающей среды (а также продуктах питания) чрезвычайно токсичных хлорсодержащих пестицидов и полихлорбифенолов, которые добавляют к ядохимикатам для усиления их действия [9].

Несмотря на все возрастающие усилия, направленные на ограничение применения некоторых хлорорганических пестицидов, в первую очередь персистентных и легко распространяющихся в окружающей среде хлорфеноксикарбоновых кислот и циклодиенов, их метаболиты и продукты фотолиза все еще обнаруживают в различных экологических системах и в организме человека.

Для правильной токсикологической оценки пестицидов, установления остаточных их количеств в биологических объектах необходимы высокочувствительные, селективные методы анализа. В качестве таких методов могут служить хроматографические методы – ГЖХ, ТСХ [3], ВЭЖХ [11, 12].

Актуальными становятся также вопросы изучения токсических свойств новых лекарственных средств для ветеринарии и разработки эффективных методов их исследования [13].

литературе имеется значительное число работ, посвященных обнаружению методом ТСХ пестицидов в различных пищевых продуктах, почве, воде, лекарственных растениях [3].

Определение содержания пестицидов в различных объектах включает несколько стадий:

– извлечение обнаруживаемых веществ (пестицидов) из проб органическими растворителями: диметилсульфоксидом из сливочного масла; гексаном из молока, овощей; петролейным эфиром из почвы; хлороформом из воды, кормов;

– определение R_F веществ и стандартов (пестицидов), нижний предел обнаружения – от 0,1 до 0,005 мкг.

Предложено [14] в тонкослойной (планарной) хроматографии использовать в качестве первичной основной величины удерживания не подвижность R_F, а новую величину – планарную подвижность R_p, которая для i-соединения определяется по уравнению:

I_i, I_st – расстояние от линии старта до центра зоны i-го соединения и стандарта (st), соответственно. L_i, L_st – расстояние от центра зоны i-соединения и стандарта (st) до линии фронта подвижной фазы, соответственно. При этом величину относительного удерживания определяют по уравнению:

которая идентична величине относительного удерживания (r_ist), используемой в колоночной хроматографии.

Тонкослойная хроматография пестицидов успешно осуществляется на сорбентах: силикагель, окись алюминия. Для хлорированных веществ удобным сорбентом является окись алюминия, пропитанная нитратом серебра. Часто пользуются готовыми хроматографическими пластинками силуфол УФ₂₅₄, выпускаемыми зарубежными фирмами [3].

Для хроматографического разделения пестицидов в качестве элюентов применяют малополярные (или средней полярности) системы растворителей. Ввиду того, что к пестицидам относятся соединения самой разной природы, описано значительное количество различных реагентов для их обнаружения (проявления) на хроматографических пластинках. Для хлорорганических пестицидов часто пользуются нитратом серебра в смеси азотной кислотой или аммиаком, флуоресцентными реактивами (родамином В). Идентификацию фосфорорганических пестицидов проводят реагентами: иодом, нитратом серебра в смеси с бромфеноловым синим, о-динитробензолом. Удобно опрыскивание (или пропитка) сорбента флуоресцентными реактивами. Разделенные на хроматограмме вещества также детектируются при рассмотрении пластинки в УФ-свете

Приведены величины R_F некоторых хлорорганических пестицидов

Пестицид	Элюент	Величина R_F
Пестицид	Элюент	На окиси	На силикагеле
алюминия
Гексахлорбензол	Гексан	0,90	–
Альдрин	Гексан	0,83	0,68
ДДЭ	Гексан	0,78	0,66
Гексан-ацетон (6:1)	0,87	–
Гептахлор	Гексан	0,76	0,65
o, n¢-ДДТ	Гексан	0,67	0,54
n, n¢-ДДТ	Гексан	0,61	0,50
Гексан-ацетон (6:1)	0,75	–
Линдан	Гексан	0,34	0,20
ДДД	Гексан	0,30	0,40
Гексан-ацетон (6:1)	0,62	–
Метоксихлор	Гексан	0,15	–
Гексан-ацетон (6:1)	0,60	–
Кельтан	Гексан	0,05	–
Гексан-ацетон (6:1)	0,40	–
Бензол	0,44	–
Тедион	Гексан	0,03	–
Гексан-ацетон (6:1)	0,55	–
Эфирсульфонат	Гексан	0,00	–
Гексан-ацетон (6:1)	0,45	–
Диктал	Гексан-ацетон (2:1)	0,90	–

Из таблицы 1 следует, что в указанной системе растворителей разделение эффективнее идет на окиси алюминия.

Шесть изомерных гексахлорциклогексанов (из которых эффективен только g-изомер) подвергли разделению на силуфоле в системе растворителей: петролейный эфир – четыреххлористый углерод (1 :1); гексан; циклогексан-хлоро

форм (8 : 2); гептан-пропанол-2 (10 : 0,5) [6].

Целый ряд веществ удалось разделить простой или двумерной хроматографией в гептане, содержащем 0,3 % этанола. Силуфол удобен для разделения изомеров гексахлорциклогексана и гексахлорбензола. Для элюирования служил н-гептан для обнаружения – смесь нитрата серебра и 2-феноксиэтанола. При применении силикагеля, пропитанного 5 % жидким парафином, элюировали 96 %-ным этанолом. Хорошо разделялись a-, b-, g-, и d-изомеры гексахлорциклогексана и гексахлорбензола.

Для разделения ДДТ в присутствии полигалогенированных дифенилов использовали двумерное элюирование в S-образной камере. В первом направлении элюировали гептаном, во втором смесью – гептан-ацетон (98 : 2) [6].

2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и метаболит 2,4-ДХФ (2,4-дихлорфенол) разделяли на силуфоле. В качестве элюента использовали смесь растворителей: циклогексан, бензол, ледяная уксусная кислота в объемном соотношении 10 : 2 : 2. Для обнаружения применяли 0,1 н раствор нитрата серебра в 3 н.растворе азотной кислоты. Значения R_F: для 2,4-Д – 0,33; 2,4- ДХФ – 0,42 [3].

Приведены величины R_F некоторых фосфорорганических пестицидов (табл.2) [3].

2.Величина R_F фосфорорганических пестицидов [3]

Значительную группу фосфорорганических пестицидов представляют собой тиофосфаты. Для хроматографического разделения тиофосфатов пользуются системами растворителей средней полярности. В качестве сорбента служат преимущественно силикагель. Метод определения антио и фосфамида в кормах основан на извлечении их хлороформом с последующей очисткой экстракта. Хроматографическое разделение проводят на силикагеле в системе растворителей хлороформ-ацетон (9 : 1).

Для обнаружения антио и фосфамида применяют аммиачно-ацетоновый раствор нитрата серебра. Значения R_F: для антио – 0,72; фосфамида – 0,45 [3].

Заключение. Из литературных данных и собственных экспериментальных исследований следует, что ТСХ является экспресс-методом анализа химических соединений различных классов. ТСХ широко используется в медицине, фармации, ветеринарии, токсикологических исследованиях и других областях.

1. Березкин В.Г. О вкладе Н.А. Измайлова и М.С. Шрайбер в развитие тонкослойной хроматографии. // ЖАХ. – 2008. – т.63, №4, с. 438–443;

3. Кадырова Р.Г. Тонкослойная хроматография. Идентификация и разделение углеводов, витаминов и токсичных соединений: Монография. – Казань: Казан.гос.энерг.ун-т, 2010, – 96 с.

4. Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Березкин В.Г., и др. Новый метод тонкослойной хроматографии с управляемой газовой фазой. // ЖАХ – 2009. – т.64, №12, с.1256–1264; 5. Пат. 2101705. Россия. RUCl. (6G01 № 33/50).12.01.95. Способ определения галактозы в сыворотке крови / Р.Г. Кадырова, М.Г. Зухрабов;

6. Шаршунова М. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. – М.: Мир. ч. II, 1980. с. 382–387, с.510–519.;

7. Темердашев З.А., Киселева Н.В., Клищенко Р.А., Удалов А.В. Разделение и идентификация соединений ряда фенотиазина методом тонкослойной хроматографии. // ЖАХ. – 2006. – т. 61, № 1. с. 6–9;

8. Бородина Е.В., Китаева Т.А., Сафонова Е.Ф., Селеменев В.Ф., Назарова А.А. Определение a-токоферола и эргокальцеферола методом тонкослойной хроматографии.// ЖАХ. – 2007. – т.62, № 11, с.1181–1185;

9. Другов Ю.С., Беликов А.Б., Дьякова Г.А., Тульчинский В.М. Методы анализа загрязнений воздуха. – М.: Химия, 1984. с. 232–253.;

10. Гранберг И.И. Органическая химия. – М.: Дрофа, 2002. с.569–588.;

11. Хроматография. Практическое приложение метода. ч.2. пер. с анг.(Ш. Чармс, Л.Фишбейн, Дж. Вагман и др.) / Под ред. Э.Хефтмана. – М.: Мир, 422 с.;

12. Тремасов М.Я., Папуниди К.Х., Степанов В.И., Шангараев Н.Г, Иванов А.В. Принципы диагностики отравлений животных. // Ветеринария. – 2010. – № 6.56–58 с.

13. Смирнов А.М. Достижения и актуальные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии. // Ветеринария.–2010. – №2. 3–6 с.

14. Березкин В.Г. Новый подход к определению величин относительного удерживания в тонкослойной жидкостной хроматографии. // ЖАХ.– 2007. т.62, №4 406–408 с.

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ – ЭКСПРЕСС МЕТОД АНАЛИЗА ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

Кабиров Г.Ф., Кадырова Р.Г., Муллахметов Р.Р.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является экспресс-методом анализа химических соединений различных классов. ТСХ широко используется в медицине, фармации, ветеринарии, токсикологических исследованиях и других областях. Компания Петролазер предлагает приборы для тонкослойной хроматографии собственного производства.

THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY –EXPRESS METHOD OF CHEMIC AL COMPOUNDS ANALYSIS

Kabirov G.F., Kadyrova R.G., Mullakhmetov R.R.

Thin-layer chromatography (TLCH) is an express method of chemical compounds analysis of different classes. Thin-layer chromatography is widely used in medicine, pharmaceutics, veterinary, toxicologic investigations and other spheres of science.

Документ для скачивания расположен по ссылке ниже.

ТСХ-254/365 — ультрафиолетовый облучатель

Ультрафиолетовый облучатель ТСХ-254/365 - ультрафиолетовый облучатель ТСХ-254/365 предназначен для просмотра тонкослойных хроматограмм при облучении пластин ТСХ ультрафиолетовым светом двух длин волн: 254 и 365 нм (по выбору либо совместно).

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее простых и эффективных экспресс - методов разделения и анализа веществ в пищевых продуктах, биологических жидкостях и других объектах, не требующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения). Этим методом можно определить 10-20 мкг вещества с точностью до 5 -7%.

В зависимости от природы НФ тонкослойная хроматография может быть адсорбционной и распределительной. Наиболее широко применим в ТСХ первый вариант разделения.

Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, силикагель и др.) тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или пластмассовую пластинку, закрепляется слой с помощью крахмала или гипса (иногда используют пластинки с незакрепленным слоем). Для хроматорафирования могут использоваться готовые пластинки, выпускаемые промышленностью, размером 5 х!5 или 20x20 см.

На расстоянии 2 см от края пластинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца наносят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3-5 мм). После испарения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно которой налит растворитель (ПФ) в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой.

Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Например, разделение хлорорганических пестицидов на пластинке с силикагелем проводят в среде гексана. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хрома-тографировании аминокислот используют смесь Н-бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов - водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН.

При хроматографировании растворитель движется снизу вверх (восходящий вариант) вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. После окончания хроматографического процесса пластинку вынимают из камеры, отмечают линию фронта растворителя (обычно « 10 см) и высушивают.

Если компоненты смеси окрашены, то они четко видны на пластине после разделения. Неокрашенные соединения обнаруживают различными способами. Если пластину поместить в камеру с парами йода, то четко проявляются коричневые пятна для органических соединений с непредельными связями. Хроматограмму можно проявить, опрыскивая ее каким-либо реагентом, дающим с компонентами пробы окрашенные соединения. В состав нанесенного слоя в готовые пластины часто вводят люминофор. При облучении такой пластины ультрафиолетовым (УФ) светом она флуоресцирует, а разделенные компоненты пробы видны в виде темных пятен. Вещества, имеющие собственную флуоресценцию, также обнаруживают в УФ - свете (например, пестициды).

Идентификацию веществ на хроматограмме осуществляют по характеру окраски пятен, параметру удерживания Rf и с помощью стандартных веществ (свидетелей).

При стандартных условиях величина Rf является постоянной величиной, характерной для данного соединения. Но практика показывает, насколько трудно создавать постоянство всех факторов, от которых зависит воспроизводимость значений Rf. На величину Rf влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителей и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю.

Качественный анализ после разделения компонентов смеси методом ТСХ часто используют для определения состава пищевых продуктов. Так, на рис.7.3.2 представлена хроматограмма жира, выделенного из мясного фарша различного состава.

Хроматографирование проводили на пластинках с силика-гелем в системе гексан-диэтиловый эфир (в соотношении 3:1), пятна детектировали 10% раствором фосфорно-молибденовой кислоты, идентифицировали по голубому цвету зон на желтом фоне пластинки. Как видно из хроматограммы, при данных условиях произошло разделение фосфолипидов и триглицеридов. По характерному составу компонентов мяса и печени можно сделать вывод о натуральности мясного фарша в пробах 1 - 2, и добавках к нему печени в пробах 3 — 5.

Количественное определение в ТХС может быть проведено непосредственно на пластинке, или после удаления веществ с плаСтинки. При непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным способом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества.

Более точен денситометрический метод определения веществ на хро-матограммах (ошибка 1-2%). В методе денситометрии производят измерение оптического поглощения проявленной хроматограммы сканирующим лучом в проходящем или отраженном свете на специальных приборах -денситометрах (рис.7.3.4.).

На денситограмме получают пики, площадь которых пропорциональна содержанию вещества в пятне. Построив с помощью стандартов калибровочный график, измеряют площадь пика компонента и по графику определяют его массу в пробе. Получают развитие также спектрофото-денситометрическос и флуори-метрическое определение веществ на хроматограммах. В первом случае используют специальные спектрофотоденситометры, измеряющие поглощение вещества в монохроматическом свете, во втором измеряют флюоресценцию пятна при облучении хроматограммы УФ светом. Широкое распространение получил способ экстрагирования компонентов из зон подходящим растворителем. При применении этого способа на хроматограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. После получеты хроматограммы производят ее обработку, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его экстрагирование подходящим растворителем. Полученный раствор анализируют инструментальным методом, имеющим высокую чувствительность. Чаще всего применяют спектрофотометрические и фотоколориметрические методы. Если вещество не имеет цвета или не обладает поглощением в УФ-области, с экстрактом проводят фотометрическую реакцию, позволяющую получить интенсивно поглощающее производное вещества.

Тонкослойная хроматография находит применение при исследовании некоторых видов пищевых продуктов на безопасность. Например, для определения токсинов (афлатоксинов, микотоксинов, патулина и др.) в арахисе, в зерновых, овощах, фруктах, напитках; для определения пестицидов (ДЦ'Г и др.) в растительных и животных продуктах , определения гистами-на как показателя порчи рыбы. Кроме того, ТСХ часто сочетают с газовой хроматографией, электрофорезом и другими методами.

Тонкослойная хроматография (хроматография в тонком слое сорбента) – хроматографический процесс, протекающий при движении подвижной фазы в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (пластинку) из соответствующего материала – стекла, металла или полимера.

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Взамен ст. ГФ XI, вып.1

Тонкослойная хроматография (ТСХ) может использоваться для анализа как однокомпонентных, так и многокомпонентных лекарственных средств. В последнем случае подбираются условия хроматографирования, обеспечивающие разделение компонентов смеси.

Разделение может осуществляться по различным механизмам: адсорбционному, распределительному, ионообменному или какой-либо их комбинации.

Хроматографическое разделение осуществляется в результате движения анализируемых веществ в тонком слое (неподвижной фазе), растворенных в растворителе или соответствующей смеси растворителей (подвижная фаза, элюент). При разделении вещества образуют на поверхности сорбента зоны адсорбции в виде пятен (круглых или эллипсовидных) или полос.

Параметры R_f и R_st используются для идентификации веществ и для оценки разделительной способности системы.

Область применения

Тонкослойная хроматография используется при испытаниях лекарственных средств на подлинность (идентификация анализируемых веществ), посторонние примеси (испытание на чистоту) полуколичественным и количественным методами.

Основные приборы и материалы

пластинки с закрепленным слоем сорбента (неподвижной фазы) различных модификаций;
хроматографические камеры;
калиброванные капилляры и микрошприцы;
устройства для нанесения на хроматограммы обнаруживающих реаген-тов (пульверизаторы для опрыскивания, камеры для погружения хро-матограмм в раствор и др.);
стандартные образцы, растворители, реагенты для обнаружения хрома-тографических зон;
ультрахемископы с УФ-лампами на 254 и 365 нм;
системы обработки и хранения данных.

Используемая лампа должна удовлетворять следующим требованиям теста.

Проверка работы лампы. На пластинку силикагель G наносят 5 мкл 0,04 % раствора натрия салицилата в спирте 96 % для ламп с максимумом излучения при 254 нм или 5 мкл 0,2 % раствора натрия салицилата в спирте 96 % для ламп с максимумом излучения при 365 нм в виде пятна диаметром около 5 мм; пятно должно светиться. Проверка работы ламп проводится не реже одного раза в три месяца, а также при возникновении сомнений в правильности работы лампы с учетом срока её эксплуатации.

При проведении анализов расстояние между лампой и хроматографической пластинкой не должно превышать расстояния, используемого при проверке работы лампы.

Примечание. Используемый спирт должен быть свободен от флуоресцирующих веществ.

Хроматографические пластинки

Пластинка для тонкослойной хроматографии представляет собой твердую подложку (стеклянную, металлическую или полимерную) с нанесенным слоем сорбента. Толщина слоя сорбента от 0,10 до 0,25 мм для аналитического варианта и от 0,5 до 2,0 мм для препаративного.

В качестве сорбента в пластинках для тонкослойной хроматографии чаще всего используются: алюминия оксид, модифицированный и немодифицированный силикагель, модифицированная и немодифицированная целлюлоза.

Готовые хроматографические пластинки могут содержать флуоресцентный индикатор для детектирования веществ, поглощающих в ультрафиолетовой области спектра при 254 и 365 нм.

Размер частиц сорбента для классического аналитического варианта ТСХ составляет 10 – 20 мкм. Наряду с такими пластинками можно использовать пластинки для высокоэффективной тонкослойной хроматографии, содержащие сорбент с частицами размером 5 – 7 мкм. Такие пластинки позволяют увеличить эффективность разделения и уменьшить предел обнаружения.

Выпускаются также пластинки с монолитными сорбентами и пластинки с концентрирующей зоной (двухфазовые пластинки). Последние используются в фармацевтическом анализе для разделения сложных и гетерогенных смесей (экстракты из лекарственного растительного сырья, растворы таблеток со вспомогательными компонентами, мягкие лекарственные формы, смеси, содержащие пигменты, суспензии и др.).

Предварительная подготовка пластинок. В некоторых случаях перед хроматографированием предусмотрена предварительная обработка пластинок. Это может быть предварительное хроматографирование чистых пластинок в соответствующем растворителе, импрегнирование пластинок при помощи опрыскивания, погружения или элюирования. При необходимости перед использованием пластинки активируют нагреванием в сушильном шкафу в течение 1 ч при температуре 100 – 105 °С. Описание предварительной обработки пластинок должно быть приведено в фармакопейной статье.

Хроматографические камеры

Используют хроматографические камеры для вертикального или горизонтального элюирования с герметичными крышками. Камеры для горизонтального элюирования снабжены также устройствами для подачи подвижной фазы на пластинку. Использование камеры для горизонтального элюирования позволяет осуществлять одновременное элюирование с противоположных сторон пластинки, что увеличивает производительность анализа в два раза по сравнению с использованием камеры для вертикального элюирования. при этом также уменьшается расход подвижной фазы приблизительно в 10 раз. В горизонтальной камере движение подвижной фазы по пластинке происходит только за счет капиллярных сил, вклад гравитации при этом отсутствует, что повышает эффективность разделения по сравнению с камерами для вертикального элюирования.

Подвижные фазы

Подвижные фазы (элюенты) должны быть предпочтительно малотоксичными, содержать минимум компонентов, не вступать в химические реакции ни с сорбентом (неподвижной фазой), ни с компонентами разделяемой смеси. Подвижные фазы должны также достаточно быстро испаряться с поверхности хроматограмм после элюирования.

Для подавления диссоциации полярных молекул компонентов разделяемой смеси к подвижной фазе добавляют вещества кислого или основного характера (модификаторы).

Нанесение проб

Нанесение проб осуществляют:

калиброванными капиллярами с тупым концом;
поршневыми микрошприцами с тупым концом иглы;
полуавтоматическими или автоматическими приборами для нанесения образцов.

Нанесение осуществляют двумя способами: в виде пятен 2 – 5 мм диаметром (1 – 2 мм на высокоэффективных пластинках) с промежутками между пятнами не менее 10 мм и в виде полос длиной 10 – 20 мм (5 – 10 мм на высокоэффективных пластинках) с промежутком между ними не менее 10 мм. Расстояние до линии старта от нижнего края пластинки должно составлять не менее 10 мм. Если в методике фармакопейной статьи предусмотрено использование как обычных, так и высокоэффективных пластинок, условия для высокоэффективных пластинок должны быть указаны в квадратных скобках. Расстояния на стартовой линии от боковых краев пластинки до мест нанесения первой и последней проб должны составлять не менее 10 мм. В процессе нанесения проб недопустимо повреждение сорбента на линии старта. Подсушивание нанесенных проб осуществляют в токе холодного или теплого воздуха, либо на специальном столе с электроподогревом.

Способы элюирования

Используют следующие способы элюирования: восходящее элюирование (одно- и многоступенчатое, одномерное и двумерное – с поворотом пластинки на 90° или 180°) и горизонтальное.

Восходящая хроматография

Если не указано иначе в фармакопейной статье, пластинку с нанесенными пробами помещают вертикально в камеру. При необходимости камеру предварительно насыщают парами подвижной фазы (в этом случае в фармакопейной статье должно быть указано время насыщения). Для этого перед проведением анализа обычно внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, смоченной подвижной фазой. Уровень подвижной фазы должен быть расположен ниже линии старта. Камеру закрывают и проводят процесс при 20 – 25 °С в защищенном от света месте. После прохождения фронтом подвижной фазы расстояния, указанного в нормативном документе, пластинку вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, проявляют и детектируют зоны адсорбции указанным способом.

При проведении двумерной хроматографии пластинку сушат после хроматографирования в первом направлении и хроматографируют в направлении, перпендикулярном первому.

Горизонтальная хроматография

Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру и направляют поток подвижной фазы из лотка в камеру согласно инструкции к прибору для горизонтального элюирования. Процесс проводят при 20 – 25 °С (если это указано в фармакопейной статье, одновременно с противоположных сторон пластинки). Когда подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в нормативном документе, пластинку вынимают, сушат до удаления следов растворителей, проявляют и детектируют зоны адсорбции указанным способом.

ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА

Обнаружение (детектирование) зон адсорбции после проведения качественной и полуколичественной ТСХ осуществляют следующими способами:

в видимом и ультрафиолетовом свете (при определенной длине волны);
опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов;
выдерживанием в парах обнаруживающего реагента;
погружением в растворы обнаруживающих реагентов с использованием для этих целей специальных камер.

Идентификация

Испытание на посторонние примеси

При испытаниях на чистоту основное вещество и примеси в условиях хроматографирования должны иметь разные значения R_f. При этом о степени чистоты анализируемого вещества можно судить по величине и интенсивности зон адсорбции обнаруживаемых на хроматограмме примесей. Их содержание может быть определено полуколичественно. Для этого на пластинку наносят определенные количества анализируемого вещества и свидетелей. Для определения идентифицированных примесей в качестве свидетелей используют стандартные образцы идентифицированных примесей в количествах, соответствующих их предельно допустимому содержанию. Для определения неидентифицированных примесей чаще всего используют растворы сравнения, приготовленные путем разведения испытуемого раствора. Содержание примеси в анализируемом лекарственном средстве оценивают, сравнивая зону адсорбции примеси по совокупности величины и интенсивности поглощения или окраски с соответствующими зонами адсорбции на хроматограмме свидетелей. Дополнительное пятно (пятна) на хроматограмме испытуемого раствора сравнивают визуально с дополнительным пятном (пятнами) на хроматограмме стандартного раствора, содержащего примесь (примеси), или с пятном на хроматограмме раствора сравнения, приготовленного из разбавленного испытуемого раствора.

Проверка разделительной способности хроматографической системы

Требования к проверке разделительной способности приводят в фармакопейной статье.

Проверка определения предела обнаружения определяемых примесей

Чувствительность считается удовлетворительной, если зона адсорбции четко обнаруживается на хроматограмме наиболее разбавленного стандартного раствора примеси или раствора сравнения.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ

Если вещества, разделяемые методом тонкослойной хроматографии реагируют на излучение в ультрафиолетовой или видимой области спектра, их можно количественно определить непосредственно на пластинке, используя соответствующее оборудование. Для этого измеряют интенсивность отраженного света, передвигая пластинку или регистрирующее устройство вдоль оси хроматограммы. Аналогичным образом можно измерять флуоресценцию.

Вещества, содержащие радионуклиды, могут быть количественно определены непосредственно на пластинке с использованием соответствующего счетчика радиоактивных веществ, а также удалением неподвижной фазы в районе зон адсорбции и измерением радиоактивности с использованием жидкостного сцинциляционного счетчика.

Оборудование. Для проведения количественных измерений непосредственно на хроматографической пластинке оборудование содержит:

Высокоэффективная тонкослойная хроматография

Эффективность разделения увеличивается как вследствие увеличения площади раздела подвижной и неподвижной фазы за счет уменьшения диаметра частиц сорбента, так и благодаря большей однородности размеров этих частиц. Применяют пластинки для высокоэффективной тонкослойной хроматографии, выполненные как в нормально-фазовом (полярная неподвижная фаза), так и в обращенно-фазовом (неполярная неподвижная фаза) вариантах.

По сравнению с классической ТСХ использование высокоэффективных пластинок позволяет:

увеличить число анализируемых проб за счет уменьшения размеров зон адсорбции первичной хроматограммы: диаметра пятен (до 1 – 2 мм) или длины полос (до 5 – 10 мм);
значительно увеличить разделительную способность системы;
снизить пределы обнаружения и количественного определения анализируемых веществ в 10 – 100 раз.

Применение высокоэффективной тонкослойной хроматографии обеспечивает получение более компактных зон адсорбции разделяемых соединений, что улучшает метрологические характеристики количественного определения с помощью сканирующей хроматоденситометрии.

литературе имеется значительное число работ, посвященных обнаружению методом ТСХ пестицидов в различных пищевых продуктах, почве, воде, лекарственных растениях [3].