Метод серийных разведений микробиология кратко

Обновлено: 05.07.2024

Позволяют количественно оценить чувствительность выделенного микроба к антибактериальным средствам и определить МИК препарата. Методы серийных разведений основаны на прямом определении величины МИК.

Для определения величины МИК заданные концентрации антибиотиков вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают метод серийных разведений в бульоне, метод серийных разведений в агаре.

В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют также методы серийных макро – и микроразведений.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций антибиотиков или даже одной концентрации, соответствующих пороговым (то есть концентрациям, отделяющим чувствительные микроорганизмы от промежуточных и промежуточные от резистентных). Метод обеспечивает получение качественных результатов, позволяющих отнести исследуемый микроорганизм к определенной категории чувствительности, и часто используется в коммерческих тест-системах.

Метод серийного разведения антибиотика в питательной среде (бульоне).

Первоначально готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотиков в специальном растворителе. Из него готовят ряд убывающих разведений антибиотиков в пробирках с бульоном (чаще двухкратные) и добавляют испытуемую культуру (обычно 10 5 -10 6 бактериальных клеток). Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотиков. Сроки инкубации зависят от вида микроорганизма (чаще сутки). Определяют МИК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (прозрачная питательная среда). Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) из нескольких последних пробирок с задержкой роста делают посев петлей на сектора чашки Петри. За МБК, которая, как правило, на несколько разведений меньше МИК, принимают концентрацию препарата в последней пробирке, посев из которой не дал роста.

Метод серийных разведений в плотной питательной среде.

Этот метод более чувствителен и точен, чем метод бумажных дисков. Каждый антибиотик испытывают, как правило, в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в чашки Петри. Контролем служит чашка с агаром без антибиотиков. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотиков 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста в термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет роста ни одной колонии.

- чувствительные культуры – их рост подавлен всеми тремя концентрациями (можно применять антибиотики в средней терапевтической дозе);

- среднечувствительные (можно применять антибиотики только в увеличенной дозе) – рост подавляют вторая и третья концентрация антибиотиков;

- умеренно-устойчивые подавляет только третья наиболее высокая концентрация (антибиотики применяют только местно);

- устойчивые (антибиотики применять нельзя по тестам in vitro) - растут на всех трех концентрациях.

Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макрометод (пробирочный) и микрометод (при величине конечного объема 0,2 мл и меньше). Область применения макрометода из-за низкой производительности ограничивается случаями необходимости оценки чувствительности единичных штаммов.

Макрометод

Процедура

Тестирование проводится в объеме 1 мл каждого разведения АБП с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма примерно 5 x 10 5 КОЕ/мл.

Питательная среда

Питательный бульон для определения чувствительности разливают по 0,5 мл в каждую пробирку. Количество пробирок определяется необходимым диапазоном разведений АБП и увеличивается на одну для постановки "отрицательного" контроля.

Приготовление серийных разведений АБП (рис. 1)

Рабочий раствор АБП готовят из основного раствора с использованием жидкой питательной среды. Концентрацию рабочего раствора рассчитывают исходя из необходимой максимальной концентрации в ряду серийных разведений, учитывая фактор разбавления препарата при последующей инокуляции. Затем рабочий раствор в количестве 0,5 мл при помощи микропипетки со стерильным наконечником вносят в первую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона. Тщательно перемешивают и новым стерильным наконечником переносят 0,5 мл раствора АБП в бульоне во вторую пробирку, содержавшую первоначально 0,5 мл бульона. Эту процедуру повторяют, пока не будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0,5 мл бульона удаляют.

Таким образом, получается ряд пробирок с растворами АБПов, концентрации которых отличаются в соседних пробирках в 2 раза. Одновременно готовятся дополнительные ряды серийных разведений АБП для тестирования контрольных штаммов. Серия разведений обязательно должна включать в себя пограничные концентрации и допустимые диапазоны МПК для контрольных штаммов.

Приготовление инокулюма и инокуляция

Для инокуляции используют стандартную микробную взвесь, эквивалентную 0,5 по стандарту МакФарланда, разведенную в 100 раз на питательном бульоне, после чего концентрация микроорганизма в ней составит примерно 10 6 КОЕ/мл.

По 0,5 мл инокулюма вносят в каждую пробирку, содержащую по 0,5 мл соответствующего разведения АБП, и в одну пробирку с 0,5 мл питательного бульона без антибиотика ("отрицательный" контроль). Конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке достигнет необходимой - примерно 5 x 10 5 КОЕ/мл. Инокулюм должен быть внесен в пробирки с разведениями АБП не позднее 15 - 30 мин. с момента приготовления.

Инкубация

Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или металлическими колпачками, и все пробирки с тестируемыми штаммами, кроме пробирки "отрицательный" контроль, инкубируются в обычной атмосфере при температуре 35 °С в течение 16 - 20 или 20 - 24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма). Пробирка "отрицательный" контроль помещается в холодильник при + 4 °С, где хранится до учета результатов.

Учет результатов

Для определения наличия роста микроорганизма пробирки с посевами просматриваются в проходящем свете. Рост культуры в присутствии АБП сравнивается с референтной пробиркой ("отрицательный" контроль), содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. МПК определяется по наименьшей концентрации АБП, которая подавляет видимый рост микроорганизма.

Рисунок 1

Микрометод

Преимуществами микрометода является высокая производительность и возможность длительного хранения заранее приготовленных планшетов. Тестирование проводится при величине конечного объема 0,2 мл и меньше, что позволяет значительно сократить количество расходных материалов. Методика не имеет отличий от макрометода, за исключением используемых объемов питательного бульона с разведениями антибиотиков и инокулюма, но требует дополнительного оснащения лаборатории многоканальными пипетками, 96-луночными планшетами для иммунологических исследований (с плоским дном) со стерильными крышками.

Первым этапом является изготовление планшетов, пригодных для хранения. После внесения рабочих растворов антибиотиков в лунки, запаянные в полиэтилен планшеты могут храниться при температуре ниже - 60 °С до момента использования. Повторное замораживание-оттаивание не допускается.

Для проведения исследования планшеты после извлечения из холодильника выдерживают до достижения ими комнатной температуры, после чего проводят инокуляцию приготовленной суспензией исследуемого микроорганизма. При проведении инкубации планшет обязательно должен быть закрыт крышкой для предотвращения высыхания содержимого лунок.

Учет результатов проводят визуально или спектрофотометрически, сравнивая рост микроорганизма в присутствии АБП с ростом культуры в ячейке без АБП. За МПК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста исследуемого штамма.

Метод серийных микроразведений в бульоне легко поддается модификациям для разработки коммерческих тест-систем. При использовании коммерческих тест-систем следует пользоваться инструкциями изготовителей.

Контроль качества

При постановке методов серийных разведений в бульоне необходимо проводить контроль роста культуры в среде без АБП. Необходимо также контролировать чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды. Каждая партия тестируемых штаммов сопровождается внутренним контролем качества исследования с использованием соответствующих контрольных (референтных) штаммов.

Приготовление растворов антибиотиков. Различают основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие — те, которые необходимо использовать ex tempore для приготовления питательных сред.

Для приготовления основных растворов антибиотиков используют субстанции препаратов с известной активностью; лекарственные формы непригодны. Для приготовления навесок антибиотиков следует использовать аналитические весы или другие равного класса точности.

Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора проводят по формуле

Масса навески = (Объем растворителя ∙ Необходимая концентрация):(Активность субстанции (содержание антибиотика))

В связи с тем что антибактериальные препараты существенно различаются по растворимости, в ряде случаев используют разные растворители, а для доведения их до заданной концентрации — разбавители. В тех случаях, когда растворители и разбавители являются разными веществами, для солюбилизации антибиотика необходимо использовать минимально возможное количество растворителя.

Основные растворы необходимо хранить при температуре не выше —20 °С (сроки хранения отдельных антибиотиков при этой температуре существенно различаются). Оптимальные условия для хранения основных растворов антибиотиков — температура —60 °С и ниже, продолжительность не более 6 мес. При этом необходимо иметь в виду, что основные растворы бета-лактамных антибиотиков могут терять активность и в более ранние сроки.

Извлеченные из холодильника флаконы с основными растворами не открывают и доводят до комнатной температуры для предотвращения конденсации влаги. Размороженные основные растворы должны быть использованы для приготовления рабочих растворов; повторное замораживание не допускается.

Из основных растворов готовят рабочие 2-кратные концентрации антибиотиков. За основу принимают конечную концентрацию антибиотика в питательной среде — 1 мкг/мл (более высокие — 2, 4, 8 и т. д.; более низкие — 0,5, 0,25, 0,125 и т. д.). При этом, рассчитывая реальные концентрации рабочих растворов, учитывают фактор разбавления раствора антибиотика в питательной среде (обычно 1 : 10). Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода. Диапазон концентраций зависит от целей исследования.

Метод серийных разведений в агаре. Приготовление чашек Петри с растворами антибиотиков. Сухую агаризованную питательную среду растворяют и автоклавируют в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещают на водяную баню, где выдерживают до достижения 48…50 °С. После этого в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара) и при необходимости термолабильные питательные добавки. Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри; толщина слоя должна быть 3…4 мм.

Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4…8 °С в течение 5 сут, однако некоторые бета-лактамные антибиотики (прежде всего ампициллин, цефаклор, имипенем), особенно при низких концентрациях, не выдерживают даже указанный срок хранения. В этой связи стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референтных штаммов.

Для контроля роста используют чашки Петри без антибиотиков.

Инокуляция, инкубация. Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 10 4 КОЕ. Поскольку коммерческие инокуляторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3 мм переносят 1…2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в исходной суспензии должна быть 10 7 КОЕ/мл.

Полученную суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5…8 мм.

После засева чашки Петри оставляют при комнатной температуре для подсыхания, затем переворачивают и инкубируют при 37 °С в течение 16…20 ч.

Для контроля качества приготовления суспензий периодически проводят подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на неселективные питательные среды.

Важнейшим требованием контроля качества применения метода оценки антибиотикочувствительности является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду (например, МПА) для контроля чистоты культуры.

Оценивать антибиотикочувствительностъ имеет смысл только при подтверждении чистоты культуры.

Учет результатов. Учет результатов проводят, поместив чашку на темную неотражающую поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать лупу. Наличие единственной колонии на чашке с концентрацией на одно разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.

Методы серийных разведений в бульоне. Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макрометод (пробирочный) и микрометод (при величине конечного объема 0,2 мл и меньше).

Рабочие растворы антибиотиков для макро — и микрометодов готовят по одинаковой схеме, аналогичной той, которая была описана для метода серийных разведений в агаре. Отличие заключается в том, что для приготовления используют не дистиллированную воду, а жидкую питательную среду. Необходимо также рассчитать концентрацию рабочего раствора антибиотика так, чтобы после инокуляции конечная его концентрация была равна заданной.

Жидкую питательную среду, прошедшую предварительный контроль качества, готовят в соответствии с инструкцией изготовителя.

При постановке методов серийных разведений необходим контроль роста культуры в среде без антибиотика и качества с использованием референтных штаммов. Выбор референтного штамма определяется видом исследуемого микроорганизма. Необходимо также контролировать чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды.

Макрометод серийных разведений в бульоне. Наиболее распространен следующий способ.

Рабочие растворы антибиотиков в жидкой среде, приготовленные в асептических условиях в концентрациях, в 2 раза превышающих заданные, вносят по 1 мл в пробирки.

Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из бульонной или агаровой культуры на стерильном изотоническом растворе. Затем ее разводят в жидкой питательной среде до концентрации 10 6 КОЕ/мл и вносят по 1 мл в пробирки с растворами антибиотиков. Таким образом, конечная концентрация микроорганизмов в инкубационной среде будет равна 5 ∙ 10 5 КОЕ/мл.

Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или металлическими колпачками, инкубируют при 37 °С в течение 16…20 ч.

Микрометод серийных разведений в бульоне. Метод серийных разведений в бульоне легко поддается модификациям для разработки коммерческих тест-систем. При использовании коммерческих тест-систем следует пользоваться инструкциями изготовителей.

Постановка метода в системах, изготовленных в лабораторных условиях, во многом сходна с методом серийных макроразведений. Наиболее удобно для постановки метода в лабораторных условиях использовать 96-луночные планшеты для иммунологических исследований. Значительным преимуществом метода микроразведений является возможность одновременно применять достаточное количество планшетов, хранить их и использовать по мере необходимости.

Первым этапом является изготовление планшетов, пригодных для хранения. Концентрацию рабочих растворов антибиотиков, вносимых в лунки планшетов, рассчитывают исходя из схемы последующей инокуляции, которая должна основываться на необходимости создания в лунке конечной концентрации исследуемого микроорганизма 5 ∙ 10 5 КОЕ/мл. После внесения рабочих растворов антибиотиков в лунки запаянные в полиэтилен планшеты могут храниться при температуре ниже —60 °С до момента использования. Повторное замораживание не допускается.

Для проведения исследования планшеты после извлечения из холодильника выдерживают до достижения ими комнатной температуры. Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из агаровой или бульонной культуры и доводят до заданной концентрации.

Инокуляцию проводят в течение 15 мин после приготовления суспензии. Инкубацию осуществляют при 37 °С в течение 16…20 ч. Для предотвращения высыхания содержимого лунок планшеты закрывают крышкой.

Учет результатов при постановке макро — и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МИК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.

Общие замечания по методам серийных разведений. Несмотря на то что методы серийных разведений наиболее точные и информативные, их постановка в практических лабораториях сопряжена с определенными методическими трудностями: необходимость использования антибиотиков с четко известным уровнем активности, соблюдения жестких низкотемпературных режимов хранения, контроля качества питательных сред и трудоемкость приготовления рабочих растворов антибиотиков.

Так как одним из важнейших принципов правильного лечения инфекционных заболеваний является выбор антибиотика, к которому возбудитель наиболее чувствителен, перед назначением антибиотиков проводится определение чувствительности возбудителя заболевания к антибиотикам, т.е. устанавливается антибиотикограмма.

Наиболее известны 3 метода:

Читайте также: