Современные методы цитологического анализа хромосом кратко

Обновлено: 02.07.2024

Цитогенетика: значение, методы

Клиническая цитогенетика — исследование хромосом, их структуры и наследования в практике медицинской генетики. За 50 лет стало ясным, что хромосомные аномалии — видимые под микроскопом изменения в количестве или структуре хромосом — могут вызывать множество клинически значимых состояний, рассматриваемых как хромосомные болезни.

Обратив внимание на хромосомный материал, цитогенетики первыми открыли участие генома в медицинской генетике. Сегодня хромосомный анализ с улучшенным разрешением и точностью как на цитологическом, так и на геномном уровнях — чрезвычайно важная диагностическая процедура во многих областях клинической медицины.

Хромосомные болезни формируют крупную группу генетических заболеваний. Они составляют большую часть всех репродуктивных потерь, врожденных пороков развития, причин задержки умственного развития и играют важную роль в патогенезе злокачественных опухолей.

Специфические хромосомные аномалии ответственны за сотни идентифицированных синдромов, суммарная частота которых выше, чем всех вместе взятых моногенных менделирующих заболеваний. Цитогенетические нарушения присутствуют почти у 1% живорожденных детей, примерно в 2% беременностей у женщин старше 35 лет, прошедших дородовую диагностику, и в половине всех спонтанных абортов первого триместра.

Исследуемые при хромосомном анализе в обычных клинических целях клетки должны быть способны к росту и быстрому делению в культуре. Легкодоступные клетки, удовлетворяющие этому требованию, — белые кровяные клетки, в частности Т-лимфоциты. Для того чтобы приготовить краткосрочную культуру, пригодную для цитогенетического анализа, получают образец периферической крови, обычно при пункции вены, и для предотвращения свертывания смешивают ее с гепарином.

Лейкоциты отбирают, переносят в культуральную среду и стимулируют к делению. Через несколько дней делящиеся клетки останавливают на стадии метафазы (с помощью химических веществ, тормозящих митотическое веретено), собирают и обрабатывают гипотоническим раствором для получения хромосом. Полученные хромосомы раскапывают на стекла и окрашивают тем или иным методом, в зависимости от конкретной диагностической процедуры. Теперь они готовы для анализа.

Обычный цитологический анализ кариотипа можно дополнить геномным методом, так называемым молекулярным кариотипированием, для оценки целостности и количества генетического материала кариотипа в целом. Определение наиболее подходящего метода для конкретных диагностических или научно-исследовательских целей — быстро меняющаяся область, так как разрешение, чувствительность и удобство хромосомного и геномного анализа постоянно возрастают.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

В некоторых случаях цитогенетического исследования бывает недостаточно для выдачи заключения о кариотипе, в этих случаях используют молекулярно-цитогенетические методы в частности флуоресцентную гибридизацию in situ (англ. – Fluorescence In Situ Hybridization – FISH) [5].

Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, базирующихся преимущественно на in situ гибридизации нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики. Метод in situ гибридизации был разработан для локализации конкретных последовательностей ДНК непосредственно на цитологических препаратах. Произошел переход в идентификации хромосом и хромосомных районов с анализа цитологической организации хромосомы на анализ последовательностей ДНК, входящих в их состав. Сравнение эффективности классических цитологических методов выявления и анализа хромосомных перестроек, таких как дифференциальные окраски хромосом, с современными молекулярно-цитогенетическими технологиями показало, что при гематологических нарушениях цитологический анализ хромосом детектирует и правильно идентифицирует лишь около трети хромосомных перестроек, выявляемых при использовании спектрального кариотипирования (SKY). Еще около трети перестроек идентифицируются цитологическими методами неверно, а треть остается совсем незамеченной. Классические методы цитогенетического анализа позволяют выявлять лишь около 15 % хромосомных перестроек, идентифицируемых с помощью SKY.

В методе FISH используются флуоресцирующие молекулы для прижизненной окраски генов или хромосом. Метод используется для картирования генов и идентификации хромосомных аберраций.

Методика начинается с приготовления коротких последовательностей ДНК, называемых зондами, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения. Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и благодаря тому, что они помечены флуоресцентной меткой, позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается гибкость метода.

FISH может применяться для различных целей с использованием зондов трех различных типов:

• локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом;

• альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа;

Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH)

Материалом для исследования является кровь, костный мозг, биопсия опухоли, плацента, эмбриональные ткани или амниотическая жидкость. Образцы для исследования должны доставляться в лабораторию в свежем виде. Препараты (слайды) готовятся непосредственно из образцов ткани или после их культивирования. Могут использоваться как метафазные, так и интерфазные препараты клеток. Меченные флуоресцентными метками специфические ДНК-зонды гибридизуюся с хромосомной ДНК, причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам.

FISH является полезным и чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции (в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом. В онкологии с помощью FISH можно выявлять рад транслокаций (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), связанных с гематологическими злокачественными новообразованиями. Метод также может использоваться для мониторинга остаточных явлений онкозаболевания после химиотерапии и пересадки костного мозга и выявления усиленных онкогенов (c-myc/n-myc), связанных с неблагоприятным прогнозом в отношении некоторых опухолей. FISH также используется для контроля приживаемости аллотрансплантата костного мозга, полученного от индивида противоположного пола.

FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (> 500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК [6].

Цитогенетические методы, применяемые для диагностики гемобластозов и других заболеваний системы кроветворения, включают в себя стандартное цитогенетическое исследование (СЦИ) и флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH).

При помощи СЦИ анализируют хромосомы метафазных пластинок, обработанных таким образом, чтобы можно было получить характерную исчерченность хромосом, позволяющую их идентифицировать (Рис.1), а также выявлять перестройки отдельных хромосомных сегментов, называемых локусами.

Рис. 1. Стандартное цитогенетическое исследование (47,XY,+12).

Для многих видов гемобластозов известны повторяющиеся маркерные хромосомные аномалии: транслокации, делеции, инверсии, а так же численные аномалии (моносомия, трисомия). Обнаружение таких маркерных хромосом позволяет устанавливать однозначный диагноз и контролировать динамику роста опухолевой массы. Кроме того, в опухолевых клетках у больных гемобластозами часто возникают дополнительные хромосомные поломки, это явление называют клональной эволюцией опухоли. Клональная эволюция опухоли, которую обнаруживают при помощи СЦИ, является важным прогностическим признаком. Возможность выявления многочисленных дефектов хромосом при помощи СЦИ является важным преимуществом этого метода. Однако чувствительность СЦИ не превышает 5%, поэтому при значительном снижении опухолевой массы на фоне проводимой терапии дальнейший мониторинг необходимо осуществлять при помощи молекулярных методов, а также при помощи FISH.

Метод FISH основан на использовании протяженных ДНК-зондов, комплементарных тем хромосомным локусам, в которых при гематологических заболеваниях происходят перестройки. Современные зонды для FISH несут в своем составе флуоресцентные группировки, позволяющие визуализировать точки связывания зондов с соответствующими локусами, причем не только в хромосомах из метафазных пластинок, но и в том случае, когда они находятся в интерфазных ядрах (Рис.2).

Рис. 2 Транслокация (9;22). Зонд ON BCR/ABL t(9;22) Dual-color Extra Signal (Kreatech) красный сигнал 9q34, включающий ген ABL, зеленый сигнал -22q11, включающий ген BCR. Место наложения сигналов - слитый ген BCR/ABL.

Рис. 3 Амплификация гена KMT2A (MLL) Зонд ON MLL (11q23), Break

Красный и зеленый сигналы визуализируют увеличение числа копий гена МLL.

В связи с этим чувствительность метода FISH оказывается на порядок выше, чем у СЦИ, однако все же уступает на 1-2 порядка чувствительности молекулярных методов.

ДНК находится в клетке внутри ядра. Она особым образом организована в виде хромосом – эти нитеподобные структуры можно рассмотреть в микроскоп с достаточно большим увеличением. Внутри хромосомы ДНК намотана на белки – гистоны. Когда гены неактивны, они расположены очень компактно, а во время считывания генетического материала молекула ДНК расплетается.

22 пары аутосом одинаковы у мужчин и женщин. В каждой паре хромосомы имеют одинаковую длину и содержат одинаковые наборы генов.
Одна пара половых хромосом. У женщин это две X-хромосомы. Одна из них неактивна и плотно свернута – ее называют тельцем Барра. У мужчин одна половая хромосома представлена X-хромосомой, а вторая – Y-хромосомой, она меньше по размерам.

Методы исследования хромосом

Для исследования кариотипа применяют специальный метод – световую микроскопию дифференциально окрашенных метафазных хромосом культивированных лимфоцитов периферической крови.

Этот анализ применяется для диагностики различных хромосомных заболеваний. Он позволяет выявлять такие нарушения, как:

Грубые изменения в кариотипе – изменение количества хромосом. Например, при синдроме Дауна в клетках ребенка присутствует лишняя хромосома №21.
Присутствие в организме клеток с разными кариотипами. Это явление называется мозаицизмом.
Хромосомные аберрации – нарушение структуры хромосом, внутрихромосомные и межхромосомные перестройки. Сюда относятся делеции (утрата участка хромосомы), дупликации (удвоение участка хромосомы), инверсии (поворот участка хромосомы на 180 градусов), транслокации (перенос участка одной хромосомы в другую).

Однако с помощью исследования кариотипа можно выявить не все генетические нарушения. Оно не способно обнаружить такие изменения, как:

Для получения дополнительной информации, не видимой в световой микроскоп, используют хромосомный микроматричный анализ (ХМА). С его помощью можно изучить все клинически значимые участки генома и выявить изменения в количестве и структуре хромосом, а именно микрополомки (микроделеции и микродупликации).

Во время хромосомного микроматричного анализа применяют технологию полногеномной амплификации и гибридизации фрагментов опытной ДНК с олигонуклеотидами, нанесенными на микроматрицу. Если объяснять простыми словами, то сначала ДНК, которую необходимо изучить, копируют, чтобы увеличить ее количество, а затем смешивают ее со специальными ДНК-микрочипами, которые помогают выявлять различные нарушения.

С помощью ХМА можно выявлять:

изменения числа хромосом;
дупликации и делеции, в том числе микродупликации и микроделеции;
отсутствие гетерозиготности – утрату одной из двух копий гена. Это явление имеет важное значение в онкологии, при болезнях импринтинга (когда активность гена зависит от того, от какого из родителей он получен), аутосомно-рецессивных заболеваниях (связанных с рецессивными генами – о них мы поговорим ниже), близкородственных браках;
однородительские дисомии, когда в геноме ребенка присутствуют две хромосомы от одного родителя.

Однако, как и предыдущий метод, хромосомный микроматричный анализ имеет некоторые ограничения. Он не позволяет выявлять или ограничен в выявлении таких аномалий, как:

Мутации в генах и заболевания, к которым они способны приводить

Все внешние признаки и особенности работы организма, которые человек получает от родителей, передаются с помощью генов. Это важнейшее свойство всех живых организмов называется наследственностью. В зависимости от того, как проявляются гены в тех или иных признаках, их делят на две большие группы.

Как выявляют рецессивные мутации?

Для выявления мутаций, которые передаются рецессивно, используют целый ряд исследований.

Если неизвестно, какую нужно выявить мутацию, то используют специальные панели.

Не в каждой семье можно отследить все возможные рецессивные заболевания. Тогда на помощь приходит секвенирование экзома – тест для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК путем исследования в одном тесте практически всех областей генома, кодирующих белки, изменения которых являются причиной наследственных болезней.

Секвенирование следующего поколения-NGS – определение последовательности нуклеотидов в геномной ДНК или в совокупности информационных РНК (транскриптоме) путем амплификации (копирования) множества коротких участков генов. Это разнообразие генных фрагментов в итоге покрывает всю совокупность целевых генов или, при необходимости, весь геном.

Анализ позволяет выявить точечные мутации, вставки, делеции, инверсии и перестановки в экзоме. Анализ не позволяет выявить большие перестройки; мутации с изменением числа копий (CNV); мутации, вовлеченные в трехаллельное наследование; мутации митохондриального генома; эпигенетические эффекты; большие тринуклеотидные повторы; рецессивные мутации, связанные с Х-хромосомой, у женщин при заболеваниях, связанных с неравномерной Х-деактивацией, фенокопии и однородительские дисомии, и гены, имеющие близкие по структуре псевдогены, могут не распознаваться.

Что делать, если в семье есть наследственное заболевание?

Существуют два способа выявить наследственные генетические мутации у эмбриона:

Предимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) в цикле ЭКО. Это диагностика генетических заболеваний у эмбриона человека перед имплантацией в слизистую оболочку матки, то есть до начала беременности. Обычно для анализа проводится биопсия одного бластомера (клетки зародыша) у эмбриона на стадии дробления (4–10 бластомеров). Существует несколько видов ПГТ: на хромосомные отклонения, на моногенные заболевания и на структурные хромосомные перестройки. Данные Simon с соавторами (2018) говорят о том, что в случае проведения ЭКО с ПГТ у пациентки 38–40 лет результативность ЭКО составляет 60%. Но при исследовании эмбриона есть ряд ограничений. Так, из-за ограниченного числа клеток можно не определить мозаицизм.

Если нет возможности провести ЭКО с ПГТ, то используют второй вариант – исследование плодного материала во время беременности.

Для забора плодного материала используют инвазивные методы:

биопсия хориона – когда берут клетки из плаценты;
амниоцентез – когда берут клетки амниотической жидкости.

Далее эти клетки исследуют при помощи одного или нескольких генетических тестов (которые имеют свои ограничения). Проведение инвазивных методов может быть связано с риском для беременности порядка 1%.

Таким образом, проведя дополнительные исследования, можно значительно снизить риск рождения ребенка с генетическим заболеванием в конкретной семье. Но привести этот риск к нулю на сегодняшний день, к сожалению, невозможно, так как любой генетический тест имеет ряд ограничений, что делает невозможным исключить абсолютно все генетические болезни.

Автор статьи

Пелина Ангелина Георгиевна

Ведёт генетическое обследование доноров Репробанка, осуществляет подбор доноров для пар, имеющих ранее рождённых детей с установленной генетической патологией.

Читайте также: