Векторы на основе вирусов реферат

Обновлено: 02.07.2024

Для цитирования: Наумов Д.А. Генотерапия злокачественных новообразований. Состояние проблемы. РМЖ. 2012;1:9.

Реферат. В статье рассматриваются всесторонние вопросы таргетной терапии злокачественных опухолей – нового направления в лекарственном лечении онкологических заболеваний.

Ключевые слова: таргетная терапия, генотерапия рака, онкогены.

Литература
1. Киселев С.Л. Современная генная терапия: что это такое и каковы ее перспективы?// Практическая онкология. 2003. Т. 4, № 3. С. 170.
2. Примроуз С., Тваймен Р. Геномика. Роль в медицине. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2008.
3. Ram Z., Culver K.W., Oshiro E.M., Viola J.J., DeVroom H.L., Otto E., Long Z., Chiang Y., McGarrity G.J., Muul L.M., Katz D., Blaese R.M., Oldfield E.H.
4. Tai C.K., Wang W.J., Chen T.C., Kasahara N. Single–shot, multicycle suicide gene therapy by replication–competent retrovirus vectors achieves long–term survival benefit in experimental glioma // Mol. Ther. 2005. Vol. 12(5). P.842–851.
5. Rein D.T., Breidenbach M., Curiel D.T. Current developments in adenovirus–based cancer gene therapy // Future Oncol. 2006. Vol. 2(1). P.137–143.
6. Flotte T.R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno–associated virus (rAAV) vectors // Gene Ther. 2004. Vol. 11(10). P. 805–810.
7. Urabe M., Nakakura T., Xin K.Q. et al. Scalable generation of high–titer recombinant adeno–associated virus type 5 in insect cells // J. Virol. 2006. Vol. 80(4). P.1874–1885.
8. Harland J., Dunn P., Cameron E. et al. The herpes simplex virus (HSV) protein ICP34.5 is a virion component that forms a DNA–binding complex with proliferating cell nuclear antigen and HSV replication proteins // J. Neurovirol. 2003. Vol. 9(4). P.477–488.
9. Derubertis B.G., Stiles B.M., Bhargava A. et al. Cytokine–secreting herpes viral mutants effectively treat tumor in a murine metastatic colorectal liver model by oncolytic and T–cell–dependent mechanisms // Cancer. Gene. Ther. 2007, in press.
10. McIntosh D.P., Tan X.Y., Oh P., Schnitzer J.E. Targeting endothelium and its dynamic caveolae for tissue–specific transcytosis in vivo: a pathway to overcome cell barriers to drug and gene delivery // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P.1996–2001.
11. Li J., Le L.P., Sibley D.A. Genetic incorporation of HSV–1 thymidine kinase into the adenovirus protein ix for functioal display on the virion // Virol. 2005. Vol. 338. P.247–258.
12. Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S.K., Dobson J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine // J. Phys. D. Appl. Phys. 2003. Vol. 36.R167–R181.
13. Roth J.A., Nguyen D., Lawrence D.D., Kemp BL et al. Retrovirus–mediated wild–type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer // Nat. Med. 1996. Vol. 2. P.985–991.
14. Schuler M., Rochlitz C., Horowitz J.A. et al. A phase I study of adenovirus–mediated wild–type p53 gene transfer in patients with advanced nonsmall cell lung cancer // Hum. Gene Ther. 1998. Vol. 9(14). P.2075–2082.
15. Gahery–Segard H., Molinier–Frenkel V., Le Boulaire C. et al. Phase 1 trial of recombinant adenovirus gene transfer in lung cancer. Longitudinal study of the immune responses to transgene and viral products // J. Clin. Invest. 1997. Vol. 100. P.2218–2226.
16. Nemunaitis J., Swisher S.G., Timmons T. et al. Adenovirus–mediated p53 gene transfer in sequence with cisplatin to tumors of patients with non–smallcell lung cancer // J. Clin. Oncol. 2000. Vol.18. P.609–622.
17. Hwang H.C., Smythe W.R., Elshami A.A. et al. Gene therapy using adenovirus carrying the herpes simplex thymidine kinase gene to treat in vitro models of human malignant mesothelioma and lung cancer // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1995. Vol. 13. P.7–16.
18. Metharom P., Ellem K., Schmidt C., Wei M.Q. Lentiviral vectormediated tyrosinase–related protein–2 gene transfer to dentritic cells for the therapy of melanoma // Hum. Gene Ther. 2001. Vol. 12(18). P.2203–2213.
19. Zhang M., Zhang X., Bai C.X. et al. Inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) by RNA interference in A549 cells // Acta Pharmacol. Sin. 2004. Vol. 25(1). P.61–67.
20. Theys J., Landuyt A.W., Nuyts S. et al. Clostridium as a tumor–specific delivery system of therapeutic proteins // Cancer. Detect. Prev. 2001. Vol. 25(6). P.548–557.
21. Van Mellaert L., Barbe S., Anne J. Clostridium spores as antitumour agents // Trends Microbiol. 2006. Vol. 14(4). P.190–196.
22. Theys J., Pennington O., Dubois L. et al. Repeated cycles of Clostridium–directed enzyme prodrug therapy result in sustained antitumour effects in vivo // Br. J. Cancer. 2006. Vol.95(9). P.1212–1219.
23. Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? // J. Natl. Cancer. Inst.1990. Vol. 82. P.4–6.
24. Vaupel P., Mayer A. Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome // Cancer. Metastasis Rev. in press. 2007, Apr 18.
25. Hay J.G. The potential impact of hypoxia on the success of oncolytic virotherapy // Curr. Opin. Mol. Ther. 2005. Vol. 7(4). P. 353–358.
26. Xu L., Frederik P., Pirollo K.F. et al. Self–assembly of a virus–mimicking nanostructure system for efficient tumor–targeted gene delivery. // Hum. Gene Ther. 2002. Vol. 10;13(3). P.469–481.

Основным объектом при проведении экспертизы на возможность медицинского применения генетических конструкций на основе вирусов, предназначенных для введения генов в геном человека, являются получаемые биотехнологическим путем структуры, имитирующие в организме человека поведение вирусной частицы, но не вызывающие инфекционный процесс. В их состав входят: белки вируса, формирующие оболочку частицы, способную к узнаванию клеток-мишеней и к интернализации в цитоплазму; и трансген-экспрессирующая кассета, осуществляющая после доставки в клетку длительную экспрессию одного или нескольких генов. Распространение в практике генной терапии наследственных и инфекционных болезней приобрели векторные системы на основе лентивирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, ортопоксвирусов, герпесвирусов и отдельных РНК-вирусов, не относящихся к ретровирусам. Достигнутый уровень генной инженерии позволяет создавать векторные системы, нацеленные на разные типы клеток и участки генома человека (векторы на основе ВИЧ). Векторные системы, полученные на основе лентивирусов и аденоассоциированных вирусов, способны интегрировать трансген-экспрессирующую кассету с геномом клеток-мишеней. Псевдотипирование векторов с гликопротеинами оболочки вируса бешенства придает им способность ретроградно транспортировать трансгены по нейрональным аксонам в ЦНС. Для изменения тропизма векторных систем исследователями используются несколько приемов: физический таргетинг, заключающийся в покрытии вирусной частицы специальной оболочкой, изменяющей ее природный тропизм и делающей ее неузнаваемой для иммунной системы человека; и генетическая модификация вируса, предполагающая модификацию белков оболочки вектора. Повышение эффективности транскрипции трансгена в клетке-мишени достигается путем транскрипционального таргетинга, предполагающего введение в трансген-экспрессирующую кассету специфических для данных тканей промоторных последовательностей.

Библиографическое описание: Супотницкий М.В. Генотерапевтические векторные системы на основе вирусов // Биопрепараты. - 2011. - № 3. - С. 15-26.

The main objects of performing the expertise of the possibility of medical application of genetic constructions based on viruses, developed for inserting genes into human genome, are structures derived by biotechnologies, imitating virus particle behavior, but not causing infectious process. They content of viral proteins, forming the particle's coat, able to recognize target-cells and to internalize into cytoplasm; and transgene expression cassettes, performing longtime expression of one or more genes after being delivered to a cell. In gene therapy of hereditary and infectious diseases vector systems based on lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, orthopoxvirus, herpesviruses and single RNA- viruses, which do not relate to retroviruses are widespread. The achieved level of gene engineering allows to create vector systems, aimed at different cell types and parts of human genome (vectors, based on HIV). Vector systems, derived based on lentiviruses and adeno-associated viruses are able to integrate transgene expression cassette into target cells genome. Pseudotyping of vectors with lyssavirus glycoproteins coat provides them with a capability to retrograde transportation of transgenes to CNS by neuronal axons. For the purpose of changing vector systems tropism the scientists use few methods: physical targeting, which means covering virus particle with a special coat, changing it's natural tropism and making it incognoscible for human immune system; and virus genetic modification, which means modifying proteins of vector cover. Increasing of transgene transcription efficacy in a target-cell is performed by transcriptional targeting, which means inserting specific for the given tisues promotor sequences into transgene expression cassette.

Bibliographical description: Supotnitskiy M.V. Genotherapeutic vector systems based on viruses // Biopreparats (Biopharmaceuticals). - 2011. - No. 3. - P. 15-26.

Ретровирусные векторные системы. Ретровирусы относятся к группе вирусов, РНК-геном которых в инфицированных клетках конвертируется в ДНК. Геном ретровирусов включает три структурных гена, обозначенные как gag, pol и env, фланки- рованых элементами, названными длинными терминальными повторами (LTR, viral long terminal repeat). В LTR содержатся регуляторные элементы, выполняющие важные функции в жизненном цикле ретровируса. Эти повторы необходимы для интеграции ДНК копии генома вируса с геномом хозяина. Они определяют, где начало и где конец вирусного генома. LTR также служат энхансер-промоторными последовательностями, т.е. они контролируют экспрессию генов вируса. Большой геном ретровирусов облегчает генетические манипуляции.

После инфицирования клетки-мишени копия ретровирусной ДНК интегрируется с ее геномом строго определенным образом. Практически все инфицированные клетки способны экс- прессировать гены, привнесенные вирусом. Мощные транскрипционные энхансеры существенно повышают уровень экспрессии генов, клонированных в клетках различных типов. С их помощью можно переместить до 8 т.п.о., что в большинстве случаев более чем достаточно для синтеза крупномолекулярных белков. Весьма удобным для исследователя является то обстоятельство, что ретровирусные векторы можно размножать, достигая их высокой концентрации в небольшом объёме - более 10 9 вирусных частиц/см 3 . В опытах по инфицированию ретровирусами мозга, печени, мышц, глаз или клеток панкреатических островков грызунов показана устойчивая экспрессия трансгенов в течение более 6 мес. [9]. Ранние этапы жизненного цикла ретровирусов и векторов на их основе показаны на рис. 1.

Векторы на основе ретровирусов с самого начала их разработки предназначались для введения через неповрежденные клетки за счет механизмов слияния, обеспечиваемых поверхностными белками оболочки вируса. Чувствительность дыхательного эпителия к ретровирусным инфекциям подразумевает возможность ингаляционного пути введения в организм человека векторных конструкций на основе ретровирусов. Сравнение свойств наиболее распространенных генотерапев- тических векторных систем приведено в табл. 1.

Таблица 1. Сравнение свойств наиболее распространенных генотерапевтических векторных систем

Гамма- ретровирусные (MLV, FLV и др.)

Лентивирусные (ВИЧ-1 и ВИЧ-2, FIV, CAEV, EIAV, JDV, MVV и др.)

Вирус герпеса первого типа (HSV-1)

Адено- ассоциированный вирус (AAV)

Плазмидная ДНК (в искусственной векторной системе)

Максимальный размер вставки, т.п.о.

До 30 (на основе рекомбинантного вируса), до 150 т.п.о на основе ампликона

Обзор

иллюстрация автора статьи

Автор

Редакторы

Смертельные клешни

Человечество столкнулось с этой загадочной болезнью еще до нашей эры. Ее пытались понять и лечить ученые мужи в самых различных уголках мира: в Древнем Египте — Еберс, в Индии — Сушрута, Греции — Гиппократ. Все они и многие другие медики вели борьбу с опасным и серьезным противником — раком. И хоть эта битва продолжается до сих пор, сложно определить, есть ли шансы на полную и окончательную победу. Ведь чем больше мы изучаем болезнь, тем чаще возникают вопросы — можно ли полностью излечить рак? Как избежать болезни? Можно ли сделать лечение быстрым, доступным и недорогим?

Мутации: погибнуть или жить вечно?

Рисунок 1. Генетическая модель рака: рак толстой кишки. Первый шаг — потеря или инактивация двух аллелей гена АРS на пятой хромосоме. В случае семейного рака (familiar adenomatous polyposis, FAP) одна мутация гена АРС наследуется. Потеря обоих аллелей ведет к образованию доброкачественных аденом. Последующие мутации генов на 12, 17, 18 хромосомах доброкачественной аденомы могут привести к трансформации в злокачественную опухоль.

Очевидно, что развитие определенных видов рака включают в себя изменение большинства или даже всех этих генов и может проходить различными путями. Из этого следует, что каждую опухоль следует рассматривать как биологически уникальный объект. На сегодняшний день существуют специальные генетические информационные базы по раку, содержащих данные о 1,2 млн. мутаций из 8207 образцов тканей, относящихся к 20 видам опухолей: атлас Ракового Генома (Cancer Genome Atlas) и каталог соматических мутаций при раке (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, COSMIC) [2].

Рисунок 2. Распространение метастазов

Однако клетки вооружены специальными механизмами, защищающими от развития опухолей:

программируемая клеточная смерть — апоптоз и связанные регуляторные гены имеют огромное влияние на возникновение злокачественного фенотипа. Некоторые онкогенные мутации нарушают апоптоз, что приводит к инициации канцерогенеза и метастазирования [6];
иммунная система — активация естественных киллеров (NK — natural killer cells), макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и специфических Т-цитотоксических клеток; синтез цитокинов и специфических антител [7].

Традиционные методы и их недостатки

хирургическая (полное удаление опухоли). Используется, когда опухоль имеет небольшие размеры и хорошо локализована. Также удаляют часть тканей, которые контактируют со злокачественным новообразованием. Метод не применяется при наличии метастазов;
лучевая — облучение опухоли радиоактивными частицами для остановки и предотвращения деления раковых клеток. Здоровые клетки тоже чувствительны к этому излучению и часто погибают;
химиотерапия — используются лекарства, тормозящие рост быстро делящихся клеток. Лекарства оказывают негативное воздействие и на нормальные клетки.

Вышеописанные подходы не всегда могут избавить больного от рака. Часто при хирургическом лечении остаются единичные раковые клетки, и опухоль может дать рецидив, а при химиотерапии и лучевой терапии возникают побочные эффекты (снижение иммунитета, анемия, выпадение волос и др.), которые приводят к серьезным последствиям, а часто и к смерти пациента. Тем не менее, с каждым годом улучшаются традиционные и появляются новые методы лечения, которые могут победить рак, такие как биологическая терапия, гормональная терапия, использование стволовых клеток, трансплантация костного мозга, а также различные поддерживающие терапии. Наиболее перспективной считается генная терапия, так как она направлена на первопричину рака — компенсацию неправильной работы определенных генов.

Генная терапия как перспектива

По данным PubMed, интерес к генной терапии (ГТ) раковых заболеваний стремительно растет, и на сегодняшний день ГТ объединяет ряд методик, которые оперируют с раковыми клетками и в организме (in vivo) и вне его (ex vivo) (рис. 3).

Рисунок 3. Две основные стратегии генной терапии. ex vivo — генетический материал с помощью векторов переносится в клетки, выращиваемые в культуре (трансдукция), а затем трансгенные клетки вводят реципиенту; in vivo — введение вектора с нужным геном в определенную ткань или орган.

Вирусные векторы

В качестве вирусных векторов используют ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, лентивирусы, вирусы герпеса и другие. Эти вирусы отличаются по эффективности трансдукции, по взаимодействию с клетками (распознавание и заражение) и ДНК. Главным критерием является безопасность и отсутствие риска неконтролируемого распространения вирусной ДНК: если гены вставляются в неправильном месте генома человека, они могут создать вредные мутации и инициировать развитие опухоли. Также важно учитывать уровень экспрессии перенесенных генов, чтобы предотвратить воспалительные или иммунные реакции организма при гиперсинтезе целевых белков (табл. 1).

Таблица 1. Вирусные векторы. Источник: [10].

Вектор	Краткое описание
Вирус кори (measles virus)	содержит отрицательную последовательность РНК, которая не вызывает защитного ответа в раковых клетках
Вирус простого герпеса (HSV-1)	может переносить длинные последовательности трансгенов
Лентивирус	производный от ВИЧ, может интегрировать гены в неделящиеся клетки
Ретровирус (RCR)	не способный к самостоятельной репликации, обеспечивает эффективное встраивание чужеродной ДНК в геном и постоянство генетических изменений
Обезьяний пенистый вирус (SFV)	новый РНК-вектор, который передает трансген в опухоль и стимулирует его экспрессию
Рекомбинантный аденовирус (rAdv)	обеспечивает эффективную трансфекцию, но возможна сильная иммунная реакция
Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV)	способен к трансфекции многих типов клеток

Невирусные векторы

Синтетические катионные липосомы в настоящее время признаны перспективным способом доставки функциональных генов. Положительный заряд на поверхности частиц обеспечивает слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами. Катионные липосомы нейтрализуют отрицательный заряд цепи ДНК, делают более компактной ее пространственную структуру и способствуют эффективной конденсации. Плазмидно-липосомный комплекс имеет ряд важных достоинств: могут вмещать генетические конструкции практически неограниченных размеров, отсутствует риск репликации или рекомбинации, практически не вызывает иммунного ответа в организме хозяина. Недостаток этой системы состоит в низкой продолжительности терапевтического эффекта, а при повторном введении могут появляться побочные эффекты [12].

Электропорация является популярным методом невирусной доставки ДНК, довольно простым и не вызывающим иммунного ответа. С помощью индуцированных электрических импульсов на поверхности клеток образуются поры, и плазмидные ДНК легко проникают во внутриклеточное пространство [13]. Генная терапия іn vivo с использованием электропорации доказала свою эффективность в ряде экспериментов на мышиных опухолях. При этом можно переносить любые гены, например, гены цитокинов (IL-12) и цитотоксические гены (TRAIL), что способствует развитию широкого спектра терапевтических стратегий. Кроме того, этот подход может быть эффективным для лечения и метастатических, и первичных опухолей [14].

Выбор техники

В зависимости от типа опухоли и ее прогрессии, для пациента подбирается наиболее эффективная методика лечения. На сегодняшний день разработаны новые перспективные техники генной терапии против рака, среди которых онколитическая вирусная ГТ, пролекарственная ГТ (prodrug therapy), иммунотерапия, ГТ с использованием стволовых клеток.

Онколитическая вирусная генная терапия

Для этой методики используются вирусы, которые с помощью специальных генетических манипуляций становятся онколитическими — перестают размножаться в здоровых клетках и воздействуют только на опухолевые. Хорошим примером такой терапии является ONYX-015 — модифицированный аденовирус, который не экспрессирует белок Е1В. При отсутствии этого белка вирус не может реплицироваться в клетках с нормальным геном p53 [15]. Два вектора, сконструированных на базе вируса простого герпеса (HSV-1) — G207 и NV1020 — также несут в себе мутации нескольких генов, чтобы реплицироваться только в раковых клетках [16]. Большим преимуществом техники является то, что при проведении внутривенных инъекций онколитические вирусы разносятся с кровью по всему организму и могут бороться с метастазами. Основные проблемы, которые возникают при работе с вирусами — это возможный риск возникновения иммунного ответа в организме реципиента, а также неконтролируемое встраивание генетических конструкций в геном здоровых клеток, и, как следствие, возникновение раковой опухоли.

Геноопосредованная ферментативная пролекарственная терапия

Минус терапии состоит в том, что в опухолях присутствуют все защитные механизмы, свойственные здоровым клеткам, и они постепенно адаптируются к повреждающим факторам и пролекарству. Процессу адаптации способствует экспрессия цитокинов (аутокринная регуляция), факторов регуляции клеточного цикла (отбор самых стойких раковых клонов), MDR-гена (отвечает за восприимчивость к некоторым медикаментам).

Иммунотерапия

Благодаря генной терапии, в последнее время начала активно развиваться иммунотерапия — новый подход для лечения рака с помощью противоопухолевых вакцин. Основная стратегия метода — активная иммунизация организма против раковых антигенов (ТАА) с помощью технологии переноса генов [18].

Главным отличием рекомбинантных вакцин от других препаратов является то, что они помогают иммунной системе пациента распознавать раковые клетки и уничтожать их. На первом этапе раковые клетки получают из организма реципиента (аутологичные клетки) или из специальных клеточных линий (аллогенные клетки), а затем выращивают их в пробирке. Для того чтобы эти клетки могли узнаваться иммунной системой, вводят один или несколько генов, которые производят иммуностимулирующие молекулы (цитокины) или белки с повышенным количеством антигенов. После этих модификаций клетки продолжают культивировать, затем проводят лизис и получают готовую вакцину.

Когда было доказано, что большинство видов рака имеют специфические антигены и способны индуцировать свои защитные механизмы [22], была выдвинута гипотеза, что блокировка иммунной системы раковых клеток облегчит отторжение опухоли. Поэтому для производства большинства противоопухолевых вакцин в качестве источника антигенов используют опухолевые клетки пациента или специальные аллогенные клетки. Основные проблемы иммунотерапии опухолей — вероятность возникновения аутоиммунных реакций в организме больного, отсутствие противоопухолевого ответа, иммуностимуляция роста опухоли и другие.

Стволовые клетки

Заключение

Если подвести итоги, можно с уверенностью говорить, что наступает эпоха персонализированной медицины, когда для лечения каждого онкобольного будет подбираться определенная эффективная терапия. Уже разрабатываются индивидуальные программы лечения, которые обеспечивают своевременный и правильный уход и приводят к значительному улучшению состояния пациентов. Эволюционные подходы для персонализированной онкологии, такие как геномный анализ, производство таргетных препаратов, генная терапия рака и молекулярная диагностика с использованием биомаркеров уже приносят свои плоды [17].

Решение для измерения гомогенности вектора на основе rAAV: чистота (и более) – анализ вирусных частиц в растворе.

Векторы на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (rAAV) открывают перспективы для развития новых методов генной терапии, способных спасать жизни.

Классические методы, такие как электронная микроскопия и саузерн-блоттинг, позволяют охарактеризовать rAAV по гетерогенности и агрегации. Однако они не обеспечивают достаточного разрешения для количественной оценки гомогенности и нагрузки вирусными частицами. Когда речь идет о создании векторных препаратов на основе rAAV для потенциального клинического применения, достижение необходимого разрешения измерений всегда вызывает трудности.

При исследованиях в области генной терапии, быстрое получение отрицательного результата особенно важно на ранних этапах разработки продукта, когда ставки очень высоки. Но до настоящего времени, когда речь заходила о создании векторов на основе rAAV для клинического применения, этого невозможно было достичь с помощью обычных технологий.

Каково главное препятствие? Отсутствие метода количественного определения с высоким разрешением для контроля терапевтического качества с учетом:

Гомогенности
Чистоты
Консистенции продукта
Нагрузки вирусными частицами

Новое решение: анализ в растворе с применением аналитического ультрацентрифугирования (AUC).

Исследователи из Genethon и их коллеги установили, что благодаря возможности проведения безматричного анализа векторных препаратов на основе rAAV, независимо от серотипа и трансгенов, аналитическое ультрацентрифугирование позволяет:

Определять состояние или гомогенность вирусного микросообщества (пустое, полное, олигомер)
Проводить эмпирический количественный анализ агрегации
Определять загрязнение субчастицами
Проводить количественный анализ массы для точной оценки генетической полезной нагрузки

Просмотрите этот вебинар и узнайте, как Кристин Ле Бек из компании Genethon и ее исследовательская группа использовали AUC для изучения характеристик векторов scAAV и ssAAV – в частности определяли гомогенность и нагрузку вирусными частицами.

Читайте также: