Технология crispr cas9 реферат

Обновлено: 05.07.2024

Вчера стало известно, что Великобритании разрешат в исследовательских целях редактировать геном эмбрионов человека. Для этого будет использоваться открытая буквально несколько лет назад технология CRISPR/Cas9. Мы попытались ответить на самые очевидные вопросы, которые в связи с этим возникают: что это такое, зачем это нужно и как новая технология изменит медицину.

Что конкретно произошло?

Британское государственное агентство HFEA (Human Fertilisation and Embryology Authority — Управление по эмбриологии и искусственному оплодотворению) разрешило проводить генетическую модификацию человеческих эмбрионов с помощью технологии CRISPR/Cas9. До сих пор подобные исследования в Соединенном Королевстве и на Западе вообще были запрещены. Ранее, около года назад, первые эксперименты были проведены в Китае, но их легальный статус был неясен и они вызвали поток критики со стороны исследователей. Великобритания же станет первой из западных стран, официально разрешивших применение технологии редактирования генома по отношению к человеческим эмбрионам.

Стоит отметить, что разрешение касается только исследовательских целей. Выдано оно пока единственному научному коллективу — группе, возглавляемой Кети Никен (Kathy Niakan) из Института Френсиса Крика. Ученые будут обязаны уничтожить полученные ГМ-эмбрионы в течение 14 дней после их получения. И, конечно, их нельзя будет подсаживать женщине для вынашивания.

И что же тогда в этом сенсационного?

Эта технология позволит лечить рак?

Проблема в том, что для большинства онкологических заболеваний наследственность не играет большой роли, а значит, технология редактирования генома будет почти бесполезна. С другой стороны, существуют тяжелые наследственные заболевания, у которых высокая наследуемость, но она настолько сложна и запутана, что не понятно, где и какие нужно вносить изменения в геном, чтобы снизить риск их возникновения. Типичный пример — шизофрения, риск развития которой, как считается, наследуется на 80 процентов (это показано на однояйцевых близнецах). При этом молекулярный механизм наследования шизофрении до самого последнего времени был совершенно непонятен и только сейчас стал проясняться.

Если говорить о том, что с помощью CRISPR/Cas9 можно будет лечить в первую очередь, то это прежде всего простые моногенные заболевания вроде бета-талассемии, муковисцидоза или гемофилии.

Что нового в этой технологии, если методы создания ГМ-животных давно известны?

Получить ГМО можно разными путями, в том числе и с помощью системы CRISPR/Cas9. Сейчас именно на эту технологию переходит все больше и больше бионженеров. Однако между старыми и новыми технологиями есть одно принципиальное отличие: это направленность внесения изменений. Именно в ней заключается принципиальное отличие технологии CRISPR/Cas9.

Раньше, чтобы добиться появления нового нужного свойства у организма биоинженеры просто встраивали ДНК-конструкцию в клетки. При этом место в геноме, куда эта конструкция попадет, предсказать было невозможно (за исключением отдельных случаев вроде пекарских дрожжей). Это приводило к тому, что, во-первых, природная версия гена в геноме сохранялась (если она там, конечно, была) и только дополнялась новой, искусственной версией.

Такой метод подходит для получения какого-то нового свойства, например, усиленной выработки гормона роста у ГМ-лосося или для синтеза витамина А в зернах риса. Однако когда речь идет о замене сломанного гена на его правильную копию, тем более в человеческой ДНК, то понятно, что ненаправленность — это большой минус. Кроме того, случайное встраивание в геном может приводить к неэффективной работе трансгена — активность любого гена у ядерных организмов зависит от его окружения, от локальной структуры хроматина. Поэтому трансген, попавший в неудачный кусок генома, может оказаться просто-напросто выключен или, наоборот, слишком активен. В отличие от старых методов технология CRISPR/Cas9 позволяет не просто встроить новую последовательность в ДНК, а заменить ее старую версию на новую.

И как это работает?

В два этапа. Сначала специальная нуклеаза (т. е. фермент, разрезающий ДНК), вносит двуцепочечный разрыв в нужное место генома. Это место нуклеаза находит с помощью короткой направляющей РНК (подобранной учеными), чья последовательность должна с точностью до буквы совпадать с нужной последовательностью в геноме. После того, как разрыв внесен, включаются внутренние механизмы клетки, так называемая система репарации.

Система гомологичной рекомбинации известна с 70-х годов прошлого века, что нового привнесла технология CRISPR/Cas9?

Метод редактирования генома CRISPR/Cas9, по крайней мере в той форме, что существует сейчас, никак не затрагивает природный механизм рекомбинации — после того, как разрыв внесен, замена ДНК происходит за счет природных механизмов.

Сложность с редактированием генома до сих пор заключалась именно в том, чтобы внести этот разрыв. Он должен появится в одном-единственном месте генома и нигде больше — именно потому, что такие разрывы ведут к появлению мутаций. Для сравнения, размер генома человека составляет около трех миллиардов нуклеотидов, а направляющая последовательность РНК, которая должна найти в геноме свое место посадки, имеет в длину около двадцати-сорока нуклеотидов. Удивительно, что ей вообще это удается. Если же речь идет не об отдельной клетке, а о генной терапии целой ткани, то задача становится еще сложнее — все клетки должны быть модифицированы, но каждая только по одному разу.

До открытия системы CRISPR/Cas9 ученые уже пытались разработать методы внесения направленных разрывов в ДНК. Например, большую работу в этом направлении проделал наш бывший соотечественник Федор Урнов. Речь идет о рациональном дизайне белков-нуклеаз, которые бы самостоятельно (без направляющей РНК) находили уникальные последовательности в геноме. Сложность с этими методами в том, что они требуют разработки под каждую конкретную задачу своего собственного белка, который затем нужно синтезировать, выделить, протестировать и т. д. Работать с универсальной нуклеазой и специфической направляющей РНК гораздо проще, но ученые не знали о такой возможности, пока не была открыта система бактериального иммунитета.

И при чем здесь бактерии?

За технологией CRISPR/Cas9, которую мы рассматриваем просто как способ редактирования генома, стоит фундаментальное и очень важное для современной биологии открытие. Оно заключается в том, что огромное число бактерий несут в своем геноме (где, казалось бы, все давным-давно понятно) изящную систему адаптивного иммунитета против вирусов. Основа этой системы это особые участки генома — короткие палиндромные кластерные повторы или CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats).

Ближе к практике. Когда с помощью CRISPR/Cas9 будут лечить?

Уже лечат, хотя пока только лабораторных животных. В начале этого года появились обнадеживающие данные по лечению миодистрофии Дюшена у взрослых мышей, причем эксперименты были проведены в трех различных лабораториях независимо. Буквально на днях стало известно об успешном применении технологии для лечении тяжелого пигментного ретинита.

Стартап Editas Medicine, тесно связанный с первооткрывателями технологии, уже привлек более 120 миллионов долларов инвестиций (в том числе от Google). Эти деньги пойдут на создание экспериментального лечения амавроза Лебера десятого типа — это наследственная слепота, связанная с повреждением одного из генов, необходимых для работы светочувствительных клеток сетчатки. Клинические (то есть на людях) испытания в Editas Medicine обещают начать уже в следующем году.

Почему же китайская работа с эмбрионами вызвала скандал и зачем британцы разрешили работу только в исследовательских целях? В чем проблема?

Проблема в долгосрочных последствиях процедуры редактирования генома, которые сейчас сложно предсказать. Это звучит как бессмысленный алармизм, обычно исходящий из уст противников ГМО, но на самом деле здесь ситуация принципиально иная.

Какова реальная эффективность — вопрос более сложный, чем кажется, ведь она сильно зависит от типа и природы клеток, в которых проводится редактирование. То, что хорошо работает на мышах, может плохо работать на людях. И пока исследователи не станут работать с реальными человеческими эмбрионами и яйцеклетками об эффективности процедуры и уровне случайных разрывов можно будет только догадываться.

На сегодняшний день есть результаты только одного эксперимента с редактированием генома в человеческом эмбрионе — те самые, что были опубликованы китайской группой в апреле прошлого года (и отвергнуты Science и Nature по этическим основаниям). Тогда ученые работали с 86 оплодотворенными яйцеклетками, из которых 71 выжила и 54 были отобраны на анализ. В 28 из 54 клеток фермент Cas9 внес нужные разрывы в геном, но только в четырех случаях репарация разрыва завершилась заменой последовательности гена на нужную. Одновременно с этим ученые обнаружили в геноме клеток множественные разрывы там, где их не должно быть.

И что теперь будет?

Будем надеяться, что технологию удастся довести до приемлемого уровня точности и эффективности. Многое в этом направлении было сделано уже после публикации китайской работы. Например, в декабре прошлого года ученым удалось создать искусственную версию фермента Cas9, которая во много раз точнее природной и почти не вносит лишних разрывов в геном.

Эффективность замены последовательности повысить будет сложнее, так как она целиком полагается на природные механизмы гомологичной рекомбинации, но работа в этом направлении ведется. Однако даже если эффективность останется низкой, при отсутствии побочных эффектов технологию CRISPR/Cas9 все же можно будет применить для внесения наследуемых изменений в зародышевую линию человека. Например, можно взять у пациента клетки соединительной ткани, провести редактирование генома и отобрать только те из них, где редактирование прошло без осложнений. Эти клетки можно использовать для получения индуцированных стволовых клеток, из которых можно затем получить сперматозоиды и использовать их в ЭКО. Здесь возникают свои сложности, но по крайней мере на животных эта технология работает.

Но не все так радужно на CRISPR-горизонте. Чем ближе реальное клиническое применение технологии, тем сильнее разгорается спор о том, кто получит от нее доход. По некоторым оценкам, стоимость исключительного патента на технологию может достигать многих сотен миллионов долларов (по крайней мере в таких суммах измеряется объем венчурного финансирования CRISPR/Cas9-стартапов). Патентный спор вокруг CRISPR/Cas9 обещает быть громче, чем все, что когда-либо происходило в сфере интеллектуальной собственности на биотехнологии.

Ученые, которые поначалу совместно пытались довести технологию до ума, разделились как минимум на два оппозиционных лагеря, каждый из которых претендует на приоритет открытия. С одной стороны, это Дженифер Дудна, которая совместно с Эммануэль Шарпетье опубликовала ключевую работу по практическому применению Cas9 при модификации генома. Вышла эта статья в конце 2012 года. Весной следующего года Дудна подала патент на эту технологию, но в том же году появилось множество сходных работ от других исследователей, которые пытались по-своему усовершенствовать метод. Один из них, Фен Женг (Feng Zhang) из Института Броуда подал собственный патент на CRISPR/Cas9 в октябре того же 2013. И хотя это произошло уже после подачи патента Дудны, патент Женг прошел по упрощенной процедуре и был выдан первым.

В начале 2013 года несколько групп ученых показали, что системы CRISPR/Cas могут работать не только в клетках бактерий, но и в клетках высших организмов, а значит, CRISPR/Cas-системы дают возможность исправлять неправильные последовательности генов и таким образом лечить наследственные заболевания человека.

Открытие иммунной системы бактерий

Для бактерий одного вида характерно наличие многочисленных штаммов, которые часто сильно отличаются друг от друга. В некотором смысле штаммы можно рассматривать как аналог рас или пород животных. Один штамм одного и того же вида бактерии может быть совершенно безобидным, а другой — опасным патогеном. У разных штаммов бактерий обнаружилась вариабельность, или полиморфизм, по наличию, отсутствию или порядку спейсеров в CRISPR-кассетах. Это свойство, значение которого было совершенно неизвестно, стало широко использоваться для типирования штаммов и эпидемиологического анализа. В частности, компания Danisco, занимающаяся производством заквасок для молочной промышленности, стала использовать это свойство для классификации своих коммерческих штаммов. Это было удобно и из патентных соображений, ведь несанкционированное использование типированных штаммов Danisco можно было легко выявить и засудить нарушителей.

Схематическое изображение системы CRISPR/Cas (Annual Review of Genetics)

Разработка технологии CRISPR/Cas9

Механизм геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas9

С помощью CRISPR/Cas9 можно делать мультиплексное редактирование сразу нескольких неправильных генов. Для этого достаточно ввести белок Cas9 и несколько разных РНК-гидов. Каждый из них направит Cas9 к собственной мишени, и вместе они устранят генетическую проблему.

Системы ZFNs и TALENs

CRISPR/Cas9 в лечении наследственных заболеваний

Надо понимать, что практическое применение CRISPR/Cas9 в медицине — это скорее отдаленное будущее, потребуется еще масса работы, улучшения технологии, ее надежности и безопасности. В целом ситуация с болезнями крови лучше, так как испорченный ген нужен только для кроветворения, а технологии клеточной терапии для таких болезней хорошо отработаны. Предположим, человек болеет лейкемией. Сейчас, для того чтобы устранить болезнь, его облучат, найдут подходящего донора и пересадят костный мозг. Донора искать долго, а полного иммунологического соответствия никогда не бывает.

Используя систему CRISPR/Cas9, мы могли бы получить образец костного мозга пациента и вылечить его собственные кроветворные стволовые клетки, изменив неправильную букву. Затем пациента придется облучить, чтобы убить пораженные кроветворные клетки, и ввести его же собственные отредактированные клетки обратно — не клетки ближайшего родственника или вообще незнакомого человека, а именно его, полностью совместимые. Они начнут делиться и производить здоровые кровяные клетки. Если же речь идет о редактировании, например, опухоли печени, все гораздо сложнее. Нужно будет решить главную медицинскую проблему — проблему доставки компонентов CRISPR/Cas9-системы именно к пораженным клеткам.

Эксперимент с человеческими эмбрионами

Плохая новость заключалась в том, что во всех клетках пролеченных эмбрионов присутствовало большое количество мутаций, которые появились вовсе не там, где предполагалось. Таким образом, технология нуждается в совершенствовании, она недостаточно точная. Точное редактирование получается, когда участок ДНК-мишени длиной чуть больше 20 нуклеотидов комплементарно взаимодействует с полностью соответствующим ему РНК-гидом. Но ведь в геноме может существовать большое количество вариантов последовательности-мишени, отличающихся от нее лишь на одну букву, еще больше вариантов, отличающихся на две, и так далее. Каждая из таких вариантных мишеней взаимодействует хуже, чем идеально подходящая мишень, допустим в 10 раз хуже. Но так как таких последовательностей много, неправильного узнавания (а следовательно, разрезания и редактирования) избежать очень трудно. Как с этим быть, пока неясно. Очевидно, нужно улучшать специфичность белка Cas9 и очень тщательно выбирать гиды.

Перспективы изучения CRISPR-систем

Среди имеющихся нерешенных проблем по биологии CRISPR/Cas-систем можно выделить следующие. Мы не знаем, откуда берется большинство спейсеров. Ведь только несколько процентов спейсеров имеют вирусное происхождение, похожи на участки ДНК известных вирусов, все остальные, подавляющее большинство, не похожи ни на что. Интересен вопрос эволюционного происхождения СRISPR/Cas-систем. Кунин предложил гипотезу, что они родственны транспозонам — участкам ДНК, которые кодируют специальные белки, занятые перестановкой тех самых участков ДНК, которые их кодируют. Такие необычные прыгающие гены. Сейчас эту гипотезу стараются подтвердить экспериментально. Кроме того, вполне актуален поиск новых, еще неизвестных CRISPR/Cas-систем. До недавнего времени было известно три разных типа, один из которых, тип II, оказался пригодным для редактирования. Недавно наша лаборатория в Сколтехе и Ратгерсе в сотрудничестве с группами Кунина и Жанга предсказала и экспериментально подтвердила наличие трех дополнительных типов этих систем, то есть мы не знаем всего их разнообразия. А среди неизвестных систем могут быть и такие, которые перспективны с практической точки зрения и свободны от недостатков систем на основе Cas9.

Об авторе:
Константин Северинов – доктор биологических наук, заведующий лабораторией регуляции экспрессии генов элементов прокариот Института молекулярной генетики РАН, заведующий лабораторией молекулярной генетики микроорганизмов Института биологии гена РАН, профессор Университета Ратгерса (США), профессор Сколковского института науки и технологий (SkolTech).

Возможность изменять фрагменты ДНК всегда была святым Граалем биотехнологии и медицины. CRISPR позволяет делать это с невиданной ранее скоростью и эффективностью. Считайте, что биологи раньше работали на пишущей машинке, а благодаря CRISPR в одночасье пересели на MacBook. Не зря открытие этого метода в 2020 году удостоилось Нобелевской премии по химии.

Резка молекулы ДНК с помощью CRISPR-Cas9 (рис. Джанет Иваса)

Под катом — рассказ о появлении CRISPR, принципах работы и применении в настоящем и будущем. Да, вы все верно поняли, это про редактирование коров, синюю клубнику и арбузы размером со сливу с Aliexpress.

Эта статья — переработанная версия лекции Бориса Климовича, научного сотрудника Университетской клиники Тюбингена и Немецкого центра исследований рака (DKFZ), которая прошла в конце ноября при поддержке Точки кипения ЯрГУ.

Признание к CRISPR пришло в 2012 году — после публикации нобелевской работы. Но, как это обычно бывает в науке, открытие — не личная заслуга пары авторов. В этот раз участников событий было много, и началось все вовсе не с генетики.

Аббревиатура CRISPR появилась в конце 80-х в ходе исследований солончаков рядом с испанским городом Аликанте. Аспирант Франсиско Мохика изучал архебактерий, живущих в соленой воде, и наткнулся на странные палиндромные последовательности в их геноме.

Фрагменты длиной около 30 нуклеотидов повторялись много раз и отделялись друг от друга уникальными участками ДНК примерно такой же длины.

Упрощенно обнаруженная структура выглядела так:

Продолжив работу в том же направлении, Мохика нашел похожие повторы у многих других бактерий. И эта закономерность привлекла внимание.

GenBank — открытая аннотированная база генетической информации. На июнь 2019 года в ней содержалась информация о 329 млрд пар оснований и 213 млн последовательностей. Источник — American Health Information Management Association

Поиск выявил интересную вещь: фрагменты CRISPR встречаются в ДНК бактериофагов — вирусов, которые инфицируют бактерии и убивают их. Получается, что бактерии хранят внутри себя фрагменты ДНК своих злейших врагов.

Так возникла ключевая догадка о том, что CRISPR — это иммунная память бактерий, сохраняющих информацию о вирусах, которыми болели.

Сформулировав эту теорию, Мохика сел писать статью, которую отправил в самый престижный биологический журнал — Nature. Статью отклонили. Затем он пытался ее пристроить в четыре других журнала, но успеха добился лишь через 18 месяцев.

Кстати, в этом он далеко не рекордсмен. В свое время работу Линн Маргулис, предложившую популярную нынче гипотезу симбиогенеза, отклоняли 15 раз! Можно сказать, что Мохика повезло. Его работу опубликовали быстрее, а идея нашла своих сторонников.

Основная функция CRISPR

Следующий шаг в развитии технологии сделал микробиолог Филипп Хорват. В своей докторской работе он исследовал закваски к эльзасской квашеной капусте, а если точнее — молочнокислые бактерии, которые ее квасят.

С появлением CRISPR закваска капусты стала беспроблемным делом (нет, саму капусту не трогали)

После докторской он ушел в молочную промышленность, где столкнулся с проблемой бактериофагов. Они сильно вредили заквасочным культурам, производители молочных продуктов несли огромные убытки. Ховарт искал способы сделать закваски устойчивыми к бактериофагам и наткнулся на работы о CRISPR. Исследуя эту тему, он доказал, что устойчивые к вирусам бактерии перенимают часть их ДНК.

Позже компанию, в которой работал Хорват, купила корпорация DuPont. А поскольку она производит примерно 40% заквасок для современной молочной промышленности, вы практически наверняка сталкивались с CRISPR в составе йогуртов, пиццы или сыра.

Работы Хорвата показали, что CRISPR-массивы — это действительно иммунная система бактерий.
Это работает так: кусочки ДНК бактериофагов сохраняются в ДНК бактерий в виде CRISPR-массивов. Затем они превращаются в РНК. В этом же куске генома у бактерий кодируется так называемая тракр-РНК (tracrRNA). Вместе они формируют guideRNA, или наводящую РНК, которая затем объединяется с белком Cas9.
Cas9 — это нуклеаза, фермент, который умеет резать ДНК. При помощи guideRNA этот фермент наводится на специфический сегмент в ДНК бактериофага, садится на него и разрезает, как ножницами, чем нарушает размножение вируса.

Нобелевская статья по редактированию генов

Когда две замечательные женщины-ученые Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна встретились на конференции в Коста-Рике, предназначение CRISPR уже было известно. Им пришла в голову смелая идея: приспособить эту систему для резки любой ДНК. Они объединили силы своих лабораторий и в 2012 году в журнале Science опубликовали результаты работы.

Иллюстрация из оригинальной статьи

Им удалось объединить две РНК в одну single guide RNA и показать, что механизм резки работает.

Тут надо пояснить, что резка — это и есть основной этап редактирования ДНК. А CRISPR — генетические ножницы. Все детали ниже.

За эту работу в 2020 году они получили Нобелевскую премию по химии.

Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна

Это событие уникально по двум параметрам.

Влияние технологии CRISPR проще всего проиллюстрировать, показав частоту упоминаний этой аббревиатуры в научной литературе, которая после 2012 года растет как на дрожжах.

Число упоминаний CRISPR в научной литературе

Второй показатель — количество патентов.

Эта статистика показывает, насколько все изменилось. Технологии редактирования генома предлагались и ранее, но ни одна из них не достигла такого успеха.

Как происходит редактирование ДНК

Первая нобелевская статья демонстрировала редактирование ДНК в пробирке. Перед учеными стояла амбициозная задача — повторить процесс в клетках человека. Фэн Чжан из MIT оптимизировал процесс, сделав его совместимым с живыми клетками, у которых есть ядра.

Фэн Чжан перенес технологию из пробирки в живые клетки

Важно понимать, что ДНК — это очень стабильная молекула. Ее можно кипятить или оставлять лежать в земле на сотни тысяч лет.

Самая старая секвенированная ДНК на сегодняшний день имеет возраст 1,7 млн лет.

Однако молекула ДНК очень чувствительна к разрывам. Если это случается, клетка запускает процесс починки ДНК. Он может идти двумя путями:

Не гомологичный вариант — когда место разрыва устраняется с дефектами. В результате в ДНК может появиться маленькая вставка или произойти потеря фрагмента. Генетический код — это типлеты, то есть три нуклеотида кодируют одну аминокислоту. Если вы вырезали два или вставили четыре нуклеотида, нарушится последовательность, кодирующая белок. Возникнет сдвиг рамки считывания, в результате которого ген фактически перестанет выполнять свою функцию, так как клетка не сможет использовать его информацию, чтобы синтезировать функциональный белок.

Сломать ген можно было и раньше, просто это довольно трудоемко: надо облучать гены радиацией, месяцами искать мутации. Благодаря CRISPR процесс стал гораздо проще.

Гомологичная рекомбинация. У всех животных в клетках как минимум две копии каждой хромосомы. Если возникает разрыв, клетка может использовать вторую хромосому и на ее основании достроить поврежденный участок — скопировать его в поврежденную хромосому. В этой ситуации клетку можно обмануть и подсунуть ей вместо второй хромосомы похожий фрагмент ДНК, но с мутацией. Тогда клетка починит разрыв, встроив в него то, что мы подсунули, — так называемую матрицу.

За счет прицельно вносимого разрыва, который делает CRISPR, появилась возможность очень просто и эффективно заменять фрагменты в геноме — вносить строго определенные мутации и чинить сломанные гены. Но есть проблема: репарация чаще всего проходит по не гомологичному пути. Существуют разные методы, позволяющие сдвинуть процесс в сторону гомологичной репликации, но пока они работают не очень хорошо.

Левая ветвь — не гомологичный вариант замены, приводящий к разрушению гена, правая — успешная починка подходящим фрагментом

Технологии редактирования генома существовали и ранее. Но они требовали сборки так называемых кастомных белков — под заказ. Для каждой операции нужно было собирать новый белок. Это занимало несколько недель и даже месяцев. Стоил каждый такой белок несколько тысяч евро. А CRISPR-реагенты стоят 10‒20 евро — в сотни раз меньше. Стало возможным проводить эксперименты гораздо быстрее и в огромных масштабах. Если вам в воскресенье пришла хорошая идея, то через неделю у вас уже будет клеточная линия с готовой мутацией, — и идею можно будет проверить.

Естественно, это подтолкнуло развитие биотехнологий и промышленности. Появились тысячи компаний, которые пытаются коммерциализировать CRISPR. Параллельно идет патентная война между MIT и Университетом Беркли, где работает Дженнифер Даудна.

Применение CRISPR-Cas9

Что можно сделать с помощью CRISPR? Можно сломать, починить, заменить практически любой ген в геноме. Факт: биологи любят ломать гены, чтобы выяснить, как они работают.

Можно сделать хромосомную перестройку. Это очень важно в онкологии, где ряд заболеваний вызывают хромосомные перестройки.

Ученые уже научились активировать или репрессировать работу гена — редактировать эпигеном. Известно, что некоторые гены в организме метилированные, кроме того, существуют специальные белки — гистоны, которые связаны с ДНК. Все это определяет, как ведет себя клетка. CRISPR позволяет влиять и на это.

При помощи CRISPR можно производить высокоточную микроскопию участков генома. Это создает огромные возможности для изучения и настоящий взрыв технологий, который до 2012 года невозможно было себе представить.

Редактируем коров, собак и помидоры

Для чего еще используется подобное редактирование? Например, пятна у породы коров сделали из черно-белых серо-белыми. Считается, что так они лучше переносят жару.

Собакам породы бигль добавили мышц. Практический смысл этой, несомненно, большой работы мне неясен. Но работу выполняли китайцы. Возможно, у них свое представление о прекрасном.

Человеческих органов для пересадки всегда не хватает, поэтому пересаживают органы свиней. Но тут есть проблема: у них в геноме присутствует много спящих ретровирусов, которые после пересадки могут активироваться и угрожать здоровью пациента. У свинок на фото эти фрагменты в геноме инактивировали.

Еще пример: с помощью CRISPR отредактировали количество ветвлений на томатной ветке. А также размеры плодов. Все это на фото выше.

Отредактированных растений уже очень много. О масштабах можно судить по количеству публикаций в научных журналах.

Теперь вы знаете, откуда на Aliexpress семена синей клубники, черных помидоров и арбузов размером со сливу

Но в магазинах (по крайней мере в Европе) CRISPR-модифицированных продуктов нет. Это связано исключительно с осторожностью регулятора, на мой взгляд, излишней.

CRISPR позволяет вносить мутации, не оставляя следов, поскольку внедряемые РНК и белок в клетке деградируют. От них ничего не остается, сохраняется только сама мутация. Фактически CRISPR делает то же самое, что происходит при селекции. Несмотря на это, суперосторожные регуляторы решили, что разрешать CRISPR пока не стоит.

Я, как ученый, считаю, что нужно разрешать, и тогда нас ждет настоящий взрыв технологического развития. С помощью CRISPR мы сможем решить очень многие проблемы, в том числе связанные с глобальным потеплением.

Например, вывести засухоустойчивые или более продуктивные сорта растений, которые позволят использовать меньше пахотных земель, не применять пестициды или удобрения.

CRISPR в биомедицине

К примеру, мутацию, вызывающую диабет, надо чинить во всей поджелудочной железе. Это непросто, потому что клетки прекрасно себя защищают от вторжения чужеродной ДНК. Поэтому исследователи начали с тех вещей, которые можно из человека вынуть, отредактировать в пробирке, затем размножить и вернуть обратно, — с костного мозга и крови.

Здесь показано, как с помощью CRISPR лечат бета-талассемию и серповидноклеточную анемию.

Эти болезни вызваны двумя разными мутациями в гене бета-гемоглобина.

Больным бета-талассемией нужны частые переливания крови. У больных серповидноклеточной анемией эритроциты забивают сосуды. Качество жизни у них низкое, и есть риск ранней смерти.

Что в такой ситуации позволяет сделать CRISPR? У человека есть третий ген гемоглобина — фетальный гемоглобин, который активен только у эмбрионов до рождения. После рождения он выключается, работают взрослые альфа- и бета-гемоглобины. CRISPR позволяет включить ген фетального гемоглобина — выключив ген, который его контролирует.

У двух больных женщин забрали клетки костного мозга и при помощи вируса внедрили в них CRISPR-конструкцию, которая инактивировала ген BCL11A. В этих клетках заработал фетальный гемоглобин. Правильно отредактированные, отселектированные и размноженные клетки вернули пациентам обратно — пересадили им их же костный мозг. После этого пациентке с бета-талассемией, которой нужно было в среднем 16 переливаний крови в год, в течение года не понадобилось ни одной процедуры. То же произошло и с больной серповидноклеточной анемией — их реально вылечили.

Эти работы перешли на следующую стадию клинических испытаний — в ближайшее время этот метод может войти в повсеместную практику.

Следующее направление работы — терапия ВИЧ. Есть люди, которые не заражаются вирусом иммунодефицита человека за счет мутации в гене CCR5 — делеции в 32 нуклеотида. Если у человека обе копии гена мутированы, вирус просто не может проникнуть в их клетки.

У части пациентов на фоне ВИЧ развивается лимфобластный лейкоз (рак крови). Если другие методы терапии не помогают, больным лимфобластным лейкозом часто пересаживают костный мозг. В этом случае взяли костный мозг у донора, который подходил для лечения лейкемии.

Перед пересадкой клетки отредактировали с помощью CRISPR, выключив в них ген CCR5, — повторили мутацию, которая существует в природе. Пересадка вылечила пациента и от лейкоза, и от ВИЧ.

На мой взгляд, это одна из самых ярких демонстраций возможностей CRISPR.

CRISPR и этика

Говоря о ВИЧ, нельзя не вспомнить о самом нашумевшем случае использования CRISPR. Это история 2018 года. Виновник событий — Цзянькуй Хэ, китайский ученый, который провел эксперимент с редактированием человеческих эмбрионов.

За редактирование ДНК человека Цзянькуй Хэ получил три года тюрьмы

Он занимается ЭКО. Получив эмбрионы от пар, где отцы были инфицированы ВИЧ, он попытался с помощью CRISPR выключить в них ген CCR5. В результате эксперимента родилось трое внешне здоровых детей.

Однако произошло лишь частичное редактирование. У одной девочки первая копия гена получилась с 15-нуклеотидной делецией, чего оказалось недостаточно, чтобы ген перестал функционировать. А вторая копия гена — без изменений. В итоге никакой защиты девочка не получила. Со второй девочкой получилось лучше, но ген все равно остался частично функциональным.

Проблема этого эксперимента — в нарушении этических норм и законов. Как выяснилось, Цзянькуй Хэ фальсифицировал разрешение этической комиссии, которая не одобрила это исследование. Во всех странах у нормальных ученых это означает полный запрет, но он его проигнорировал. Кроме того, эксперимент был плохо подготовлен, исследователь не взвесил возможные риски. Редактирование толком не получилось, а последствия этих экспериментов могут проявить себя позже. CRISPR не обладает стопроцентной точностью, он может вносить мутации где-то еще в геноме. И где он их внесет, предсказать сложно.

Если бы все дети с ВИЧ умирали, это меняло бы дело. Но с современными препаратами ВИЧ-инфицированные матери рожают ВИЧ-негативных детей более чем в 90% случаев. Поэтому эксперимент был еще и бессмысленный.

Ни один ученый в мире не сомневался, что технически метод CRISPR позволяет редактировать эмбрионы, то есть научной новизны в этом эксперименте тоже не было. Но это надо было делать с соблюдением всех норм и другим уровнем подготовки. А главное, технология еще недостаточно созрела, чтобы со стопроцентной гарантией отредактировать только нужное место в геноме и ничего не сломать в остальных.

Гражданин Хэ подорвал веру в ученых, получив вал критики, почти полмиллиона долларов штрафа и три года лишения свободы.

Я думаю, до широкой практики редактирования человеческих эмбрионов нам далеко. Но, безусловно, когда-то мы к этому придем, и при помощи CRISPR будут лечить тяжелые наследственные заболевания.

Кому сейчас доступен CRISPR

Некоторые экспериментируют прямо на собственной кухне

Если у вас есть мало-мальски оборудованная лаборатория для простейших молекулярно-биологических экспериментов, начать работать с CRISPR будет легко. И это действительно фантастический инструмент, который невероятно ускорил прогресс биомедицинской науки.

Вся эта история учит нас тому, что даже ковыряясь — буквально — в грязи, можно сделать невероятные открытия. Ну и еще тому, что наука интернациональна.

Нет никакой российской науки, немецкой науки, есть интернациональная наука.

Та же Эммануэль Шарпантье работала сначала в Нью-Йорке, потом в Мемфисе, в Вене, в Швеции, в Ганновере, а прямо сейчас работает в Берлине. Поэтому задача ученого — знать хотя бы один международный язык и пытаться развивать собственную мобильность — двигаться, искать связи и сотрудников, новых коллег. Шарпантье и Даудна встретились на конференции, заинтересовались общей проблемой и в итоге получили Нобелевскую премию. Кто знает, как бы сложилась история CRISPR, не будь этой встречи.

Обзор

Авторы

Редакторы

В конкурсе участвовала только инфографика!
Текст написала Ольга Волкова.

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

Спонсор публикации этой статьи — Дмитрий Геннадиевич Калашников.

Как устроена иммунная система прокариот?

Гены cas кодируют белки, берущие на себя всю тяжесть работы по встраиванию спейсеров и уничтожению агентов с идентичными последовательностями (протоспейсерами) и помогающие процессировать CRISPR-транскрипт: разделять фото-гирлянду на отдельные портреты. Функцию уничтожения выполняют Cas-белки, называемые эффекторными. В зависимости от типа эффекторов все CRISPR-системы разделяют на два класса: у I класса мишень уничтожается мультибелковым комплексом, а у II — одним крупным белком. Далее эти классы подразделяются на шесть типов. Большинство эффекторов атакует ДНК, лишь один — исключительно РНК [10], редкие — обе молекулы. Один организм может содержать несколько разных систем, а спейсеры различаются в разных клетках даже одной популяции .

Для решения инженерных задач больше всего подходит система II типа, относящаяся ко II классу, — она самая простая. Именно ее эффекторный белок называется Cas9 — то самое обозначение, что фигурирует в современных системах редактирования генома.

Как формируется CRISPR-опосредованный иммунитет?

Если в бактерию или архею, снабженную CRISPR-системой, проникает вирус, включается адаптационный функциональный модуль системы: специфические Cas-белки — у всех систем это как минимум Cas1 и Cas2 — вырезают из чужака понравившиеся фрагменты. Подобрать протоспейсер в некоторых случаях помогает и эффекторный белок. Белки выбирают участки рядом с особой последовательностью PAM (protospacer adjacent motif) — всего несколько нуклеотидов, но неодинаковых для разных CRISPR-систем. Затем эти же адаптационные белки встраивают фрагмент в CRISPR-кассету, всегда с одной стороны — у лидерной последовательности. Так образуется новый спейсер, а заодно с ним — и новый повтор. Весь этот процесс называют адаптацией, или приобретением, а по сути это — запоминание врага. Информацию обо всех запомнившихся врагах получает при делениях всё потомство клетки.

Как реализуется CRISPR-опосредованный иммунитет?

Для поиска повторно вторгающихся агентов CRISPR-кассета должна экспрессироваться. В результате ее транскрипции образуется длинная молекула РНК — pre-crРНК. С помощью РНКазы III и, как правило, Cas-белков транскрипт нарезается по повторам на отдельные crРНК — молекулы, содержащие один спейсер и кусочки окружающих его повторов (один из них длиннее). В системах II типа для этого процесса, называемого созреванием, необходим еще один участник — tracrРНК (trans-activating CRISPR RNA), которая закодирована рядом с cas-кластером [12].

Какие проблемы могут возникнуть при реализации иммунного ответа? Не исключено, что по мере удаления от лидерной последовательности, то есть от CRISPR-промотора, шансы спейсера транскрибироваться и созреть уменьшаются. Кроме того, есть мнение, что удаленные спейсеры со временем могут накапливать мутации, препятствующие эффективной интерференции с мишенью, или вовсе удаляться. Но раз адаптация новых спейсеров происходит вблизи промотора, удаленные спейсеры представляют собой фото агентов, давно не нападавших на эту клеточную линию, и в постоянной боеготовности по отношению к ним клетка не нуждается. Настоящей же проблемой могут стать даже однонуклеотидные мутации мишени. В общем, комплементарность в этом деле превыше всего.

А не приручить ли нам чужой иммунитет?

Детально изучив принципы работы стрептококковой системы CRISPR-Cas9 (II тип), ученые подумали: а почему бы не попробовать с ее помощью корректировать геномы других организмов? Появились новые надежды относительно лечения генетических (и не только) заболеваний человека, ведь этот способ редактирования in vivo мог оказаться эффективнее уже вовсю тестируемых в то время нуклеаз ZFN и TALEN [13].

Спектр применений CRISPR-Cas9 и ее модификаций

Преимущества коррекции генома в зародышевой линии (как совокупности любых генеративных клеток, связывающих друг с другом поколения организмов) и стволовых клетках очевидны, но даже изменения, вносимые в соматические клетки уже развитых органов, дают эффект. Особенно если речь идет о борьбе с болезнями печени и мышц. О результатах терапевтического применения CRISPR-Cas9 в разных типах клеток рассказывает свежий обзор [21].

Можно помечтать, что в терапии опухолей найдут применение варианты недавно описанной CRISPR-системы VI типа — той, что уничтожает только РНК, причем, как оказалось, любую клеточную РНК без разбора: запустить такую систему в раковую клетку — это как наслать на нее проклятье [14].

CRISPR-Cas — это не только иммунитет

Оказывается, для бактерий и их эволюции эта система значит намного больше.

Неканонические активности CRISPR-систем или их отдельных компонентов возникали как побочные продукты их иммунной функции либо как самостоятельно отбираемые признаки. Скорее всего, CRISPR-кассеты и Cas-белки когда-то работали порознь, причем исходная задача последних состояла в регуляции экспрессии генов и репарации ДНК [7]. Современные компоненты CRISPR-Cas замечены:

Инфографика выполнена совместно с Павлом Чирковым, магистром факультета политологии Санкт-Петербургского государственного университета. Одним файлом ее можно скачать здесь.

В статье авторы рассказывают о современном методе редактирования генов CRISPR/Cas9.

Ключевые слова: CRISPR, клетка, система, ген, стволовая клетка человека, ДНК.

Человеческое тело — довольно сложный механизм, который до сих пор изучен не до конца. В нашем организме существует более тридцати триллионов клеток, которые организуются вместе в ткани и выполняют определенные функции, они нужны для нормальной физиологии человека. Они поддерживают правильное протекание физиологических процессов и биохимических реакций. В клетках содержится ДНК, которая выполняет функцию хранения и передачи из поколения в поколение генетической программы функционирования организма. ДНК записывает на себе информацию о белках нашего тела с помощью нуклеотидов (генетического кода). Ежедневно в клетках человека, а именно в структуре ДНК, происходят повреждения. Они могут быть связаны с тем, что при естественном метаболизме образуются определённые химические соединения, такие как активные формы кислорода (ионы, свободные радикалы и перекиси), токсичные формы азота, алкилирующие агенты и т. д. Также последовательность ДНК может повреждаться из-за ионизирующего излучения и химических мутагенов. Клетка, в таких случаях, запускает процесс репарации ДНК, а именно, восстановления ДНК после химических повреждений или разрывов. В защите ДНК и всей клетки так же участвует система CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) и связанные с ней белки Cas. Они образуют целую систему защиты наследственной информации хозяина от чужеродной ДНК бактериофага. Впервые локус CRISPR был обнаружен в 1987 году у бактерии Escherichia Coli группой ученых во главе Ёсидзуми Исино. Тогда они заметили повторяющиеся элементы в ДНК, которые были разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Но в то время — это открытие не имело никакого значения, никто не понимал зачем же нужны эти повторяющиеся элементы. В 1993 г. исследователь Франсиско Мохика обнаружил такие же повторяющиеся последовательности в геноме археи и связал их с геномом E. coli. Далее он продолжил изучать этот вопрос и нашёл такие же палиндромные участки у 20 микроорганизмов. В 2002 г. Мохика вместе с коллегами опубликовали результаты исследований, в которых было сказано, что локусы CRISPR связаны с адаптивным иммунитетом прокариот. Такие выводы группа ученых сделала на основе того, что штаммы E. coli, чьи повторяющиеся участки содержат спейсер, соответствующий определенному фагу, являются устойчивыми к этому фагу. Позже, начались серьезные исследования систем CRISPR, были описаны виды этих систем и предложен механизм работы. Система CRISPR/Cas9 работает определенным образом.

Нуклеаза разрывает в сайтах-мишенях обе цепи ДНК, репарация которых впоследствии происходит по одному из следующих механизмов:

Соединение концов негомологичным образом, при условии которого возникают ошибки, приводит в результате к формированию в целевом локусе мутаций по типу делеций и инсерций.

Гомологичная рекомбинация, при которой гомолог, не подверженный повреждениям, служит матрицей для регенерации первоначальной структуры молекулы ДНК; подобное действие происходит весьма редко, однако использование CRISPR/Cas9 даёт возможность повысить вероятность проведения гомологичной рекомбинации в несколько раз.

Если добавить к компонентам CRISPR/Cas9 артифициально синтезированную молекулу ДНК, для которой свойственна гомологичность с нуклеотидной последовательностью в месте разрыва, она послужит матрицей для иного репаративного способа — HDR (homology-directed repair), который заключается во встраивании относительно небольшого фрагмента артифициальной матрицы в целевой локус. В качестве подобной матрицы в основном используют два типа структур: одноцепочечные олигонуклеотиды или плазмидные векторы.

В первом случае проводится искусственный синтез олигонуклеотидов, гомологичных сайту, в котором формируется двухцепочечный разрыв, оптимальная длина которого в среднем составляет около 90 нуклеотидов. Данные олигонуклеотиды могут в немногом отличаться от целевого сайта.

Таким образом, с помощью сайт-специфических эндонуклеаз могут быть получены мутации:

– Негомологичное соединение концов при условии отсутствия донорной плазмиды опосредует делеции или инсерции малого количества нуклеотидов сайта-мишени и, в качестве одного из результатов, произойдёт генный нокаут вследствие мутаций рамки считывания и образования стоп-кодонов;

– В случае присутствия двухцепочечных олигонуклеотидов или донорной плазмиды фрагменты ДНК длиной свыше 14 т.п.н. встраиаваются способом лигирования, сопровождающегося негомологичным сшиванием концов;

– Параллельное внесение определённого количества двухцепочечных разрывов приводит к делециям, инверсиям или транслокациям участков ДНК, расположенных между этими разрывами;

– Гомологичная рекомбинация при условии присутствия донорной плазмиды с гомологичными плечами, фланкирующими встраиваемый фрагмент, линейной донорной последовательности с гомологией не более, чем 50 т.п.н. или олигонуклеотида приводит к введению одного или нескольких трансгенов для исправления или замены имеющихся генов.

На данный момент описанные выше методы активно используются в фундаментальных или же прикладных исследованиях. Редактирование генома возможно как in vitro при доставке элементов системы CRISPR/Cas в культуры выращенных клеток, так и in vivo посредством инъецирования мРНК в зиготы.

Редактирование генома in vitro

Линии клеток НЕК293T/НЕК293FT, легко подвергаемые трансформированию плазмидами и достаточно простые в поддержании, наиболее часто применяются с целью проверки эффективности работы системы CRISPR/Cas в человеческой модели in vitro. По данным исследований разных авторов, уровень целевых мутаций, а также гомологичной рекомбинации с донорными плазмидами/олигонуклеотидами варьирует в широких пределах. Этот факт, скорее всего, обусловлен не только методом, но и линиями клеток и непосредственно сайтом-мишенью. Культивируемые линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и эмбриональных стволовых клеток человека являются особо интересным объектом изучения регенеративной медицины, исследования структуры и закономерностей работы сложных сетей генов, создания систем для поиска медикаментов и множества прочих фундаментальных биомедицинских исследований.

Посредством использования технологии, основанной на CRISPR/ Cas9, были созданы изогенные стволовые клетки человека, ведётся разработка методов коррекции мутантного фенотипа клеток, осуществляются работы по вопросу регуляции экспрессии генов, исследованию функциональных взаимоотношений между группами генов различной величины и визуализации функционирующих участков генома живых клеток.

Создание линий изогенных плюрипотентных стволовых клеток человека способствует осуществлению моделирования наследственных и многофакторных заболеваний, скринингу обширных библиотек лекарственных средств, а также поиску новых типов мутаций, участвующих в определённом патологическом процессе. На сегодняшний день активно проводятся работы по всем этим направлениям. Систему CRISPR/Cas9 эффективно использовали в целях создания модели синдрома ICF (immunodeficiency, centromeric region instability and facial anomalies syndrome; иммунодефицит, нестабильность центромерных районов хромосом и лицевые аномалии) на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека. Было произведено получение гомозиготных мутаций в гене DNMT3B с приблизительной частотой 63 %, причём для клеток был характерен фенотип центромерной нестабильности. Особую актуальность обретает изучение тяжелых нейродегенеративных заболеваний, самыми значительными из которых являются болезни Альцгеймера, Паркинсона, различной этиологии мышечные атрофии.

По причине того, что Cas9 распознаёт конкретную мишень в геноме при условии участия короткой последовательности направления в sgRNA, в современных условиях достаточно просто собрать достаточно большую библиотеку олигонуклеотидов и соответственно sgRN A, которая будет охватывать масштабы целого генома. Использование в качестве вектора, доставляющего компоненты CRISPR/Cas9, лентивирусов, стабильно поддерживающихся в геноме и реплицирующихся совместно с геномной ДНК, поспособствовало разработке новой технологии GeCKO — CRISPR-Cas9-нокаут в рамках генома (Genome-scale CRISPR/Cas9 knockout). Большая библиотека sgRNA делает возможным выключить транскрипцию большинства генов одновременно и сформировать тем самым функциональные взаимоотношения между этими генами, роль в определённых процессах жизнедеятельности или вовлеченность в процесс патогенеза. С помощью использования лентивирусной библиотеки, охватывающей 18080 генов (3–4 sgRNA на каждый ген), выявились гены, необходимые для жизнедеятельности канцерных клеток (А375 — клеточная линия меланомы человека) и плюрипотентных стволовых клеток (линия HUES62). Оказалось, что в формирование резистентности к вемурафенибу (PLX), являющемуся BRAF-ингибитором протеинкиназ при меланоме, вовлечены не только гены NF1 и MED12, но и ген CUL3, а также обширный комплекс гистон-специфических ацетилтрансфераз STAGA: TADA1 и TADA2. С помощью применения лентивирусной библиотеки, содержащей порядка 73000 sgRNA, по шаблону линий опухолевых клеток KBM7 и HL60 были изучены гены, задействованные в пролиферации и клеточном цикле. Доказано, что мутации, которые приводят к формированию нефункциональных продуктов 4 репаративных генов однонуклеотидных замен в ДНК (MMR) — MSH2, MSH6, MLH1, PMS2, способствуют формировании устойчивости к нуклеотидному аналогу 6-тиогуанину и, следовательно, индуцируют пролиферацию клеток. Были также исследованы закономерности функционирования генов TOP2A, CDK6, BCR, ABL1 и генов, кодирующих рибосомальные белки.

Таким образом, применение библиотек CRISPR/Cas9 делает возможным осуществление функционального скрининга геномов, который, в свою очередь, может дать важные сведения о физиологических и биохимических процессах клеток разного типа, способствуя раскрытию молекулярных механизмов патогенеза и выявлению потенциальных мишеней для медикаментозной и генной терапии.

Методы, базирующиеся на применении системы CRISPR/Cas9, могут быть эффективно использованы для редактирования геномов культур стволовых клеток. К примеру, применение систем редактирования геномов способствует исправлению точковых мутаций в клетках, полученных от организма больного. В роли объекта исследования в данном случае выступают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и региональные стволовые клетки. В свою очередь, донорными молекулами могут быть как сложные генетические конструкции, так и одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК.

Занимательным примером такого подхода является работа, в которой произведена коррекция локуса CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductor regulator, муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости) в культивируемых интестинальных стволовых клетках, полученных от больных муковисцидозом (CF — cystic fibrosis, муковисцидоз). Данный подход способствует получению так называемые органоидов — функциональных многоклеточных образований с редактированным геномом, аутологичных относительно донора клеток, которые повторно могут быть внедрены в организм больного. Бесспорно, это направление имеет невероятно большие перспективы для клеточной терапии заболеваний человека.

В контексте функциональной коррекции генетических аномалий, обусловленных делецией генов или нарушениями экспрессии, выраженных в значительном снижении уровня продуктов геноа, возможно использование контролируемого внедрения трансгенов в геном. Существуют определённые участки генома, внесение трансгенов в которые является безопасным. В их число входят сайты наподобие AAVS1, обеспечивающие стабильную экспрессию внедрённого трансгена. Таким образом, система CRISPR/Cas эффективно применяется в функциональной геномике клеток, в частности, с целью создания клеточных моделей заболеваний человека и клеточной терапии.

Область применения системы CRISPR-Cas9 и ее модификационных вариантов очень широка. Ее условно подразделяют на три большие группы: для исследований, для биотехнологий и для терапии.

CRISPR-Cas9 в области биотехнологий служит для трех основных целей. Первая — изменение свойств животных и растений, важных для сельского хозяйства. Благодаря системе улучшаются вкусовые качества и показатели пищевой ценности, появляется устойчивость к условиям окружающей среды и вредителям растений. У животных систему применяют для репрессии нежелательных генов. Вторая цель — осуществление контроля над распространяемыми животными инфекциями, например, малярийного плазмодия. Третья цель — получение новых или улучшенных ферментных систем бактерий или грибов, применяемых в промышленности. Система позволяет не только создавать такие системы, но и защищать их от мутаций.

CRISPR-Cas9 в терапии нашли колоссально широкое применение. На данный момент систему успешно применяют при лечении опухолей (белок уничтожает все виды РНК в данной клетке или группе клеток тем самым препятствует биосинтезу белка и ферментов, что приводит к неминуемой гибели клетки); хронических заболеваний вирусной природы, в том числе ВИЧ и гепатита (система вырезает участок вирусной ДНК из ДНК клетки хозяина). Система позволяет бороться с моногенными наследственными заболеваниями, в том числе серповидноклеточной анемией, муковисцидозом, синдромом миодисторфии Дюшенна, катаракты, гемофилии и лейкемии. Помимо этого на данном этапе используют редактирование генома не только зародыша и стволовых клеток, но и соматических клеток взрослого, уже сформированного организма.

За время существования системы CRISPR/Cas9, она хорошо зарекомендовала себя в опытах над животными, такими как мыши и рыбки Данио. Поэтому научная сфера решилась использовать технологию на людях.

Так, в апреле 2015 г. группа ученых из Китая под руководством генетика Цзюньцзю Хуана провела попытку редактирования генома эмбриона человека. Задачей было изменение гена, который отвечает за развитие бета-талассемии. В результате мутации в одном из аллей гена HBB (ген бета-глобина) нарушается синтез бета-цепи гемоглобина А и его количество в крови падает. Ученые использовали нежизнеспособные эмбрионы, которые проходят только первые стадии развития.

Уже в 2016 г. в лаборатории Oregon Health and Science University г. Портланд, США, группа американских исследователей вместе с коллегами из Южной Кореи, под руководством американского биолога Шухрата Миталипова, отредактировали геном человеческого эмбриона на ранней стадии развития. До этого попытки редактирования проводились в Китае, но в них имелись несколько неточностей:

Первое, наблюдался мозаицизм, то есть необходимое изменение было не у всех эмбрионов.
Второе, при использовании системы CRISPR/Cas9 обнаруживались побочные (нецелевые) мутации.

В данном исследовании использовалось несколько десятков эмбрионов, из ДНК которых удалили мутировавший ген MYBPC3, провоцирующий одну из разновидностей кардиомиопатии. При этом применённые эмбрионы не предполагали пересадить в матку для дальнейшего их развития и в последующем рождении, поэтому они были уничтожены на ранних стадиях развития. В итоге, в 72 % случаев результат оказался успешным, потому что мутировавший ген был удален, а мозаицизм и побочные мутации не наблюдались.

Начало ноября 2018 г. Университет науки и технологии в Шэньчжэне проводит набор пар, в которых отец должен быть ВИЧ-положительным. Эти пары будут участвовать в эксперименте, руководил которым молекулярный биолог Хэ Цзянькуй. Ученый хотел внести изменения в ДНК зародыша, тем самым сделав его невосприимчивым к ВИЧ.

В научной среде давно известно про мутацию CCR5-дельта32, в результате которой происходит нарушение функции белка CCR5. Дело в том что данный белок – рецептор, обладающий адгезивными свойствами и располагающийся на Т-лимфоцитах, а Вирус Иммунодефицита Человека использует эти рецепторы для проникновения в лимфоциты. Хэ Цзянькуй решил вызвать эту мутацию искусственно.

У эмбрионов в возрасте до двадцати четырех недель, используя систему CRISPR/Cas9, удалили 32 пары нуклеотидных оснований гена CCR5. Благодаря этому ВИЧ не сможет взаимодействовать с рецепторами. Следующим шагом было внедрение модифицированных эмбрионов в матку.

В положенный срок родилиcь две девочки Лулу и Нана, однако получить желаемой мутации не удалось. У одной, в одной копии гена удалилось 15 нуклеотидных пар, в другой копии—ничего не изменилось, у второй девочки в одной копии удалено 4 нуклеотидных пар, в другой наблюдалась вставка пары нуклеотидов. Вдобавок ко всему не удалось избежать мозаицизма.

Пусть некоторые из экспериментов и были удачными, они все равно подвергались общественной критике. Именно поэтому Хэ Цзянькуй был осужден и в 2019 г. получил три года лишения свободы. Так как из соображений этических норм человек не может быть использован в качестве подопытного.

Основные термины (генерируются автоматически): CRISPR, клетка, ген, система, HDR, стволовая клетка человека, гомологичная рекомбинация, мутация, мутировавший ген, редактирование генома.

Читайте также: