Реферат биотехнология получения аминокислот

Обновлено: 18.05.2024

Питательные среды в микробиологическом производстве. Классификация по составу. Сырье. Методы стерилизации. Сохранение биологической полноценности сред при их стерилизации.

Питательная среда перед засевом каким-либо биообъектом также должна быть стерильной. В таких случаях прибегают к тепловой стерилизации, заботясь при этом о сохранении стабильности ингредиентов среды. В микробной биотехнологии обычно используют методы периодической и непрерывной стерилизации. Первую из них осуществляют в аппаратах малой емкости непосредственно в ферментаторах глухим или острым паром под давлением в течение 30-40 мин, при температуре порядка 134°С (2,02650 х 10 5 Па) после удаления воздуха из аппарата при нагреве до 100°С. Затем среду охлаждают водой через змеевик или рубашку аппарата и засевают тем или иным биообъектом. Метод непрерывной стерилизации основан на том, что концентрат питательной среды подают насосом через систему конструкций, включающую нагреватель, выдерживатель (собственно стерилизатор) и теплообменник (охладитель, в котором охлаждение среды происходит до температуры, оптимальной для культивирования клеток).

В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред и некоторых других объектов осуществляют в автоклавах. Стерилизацию проводят паром под давлением, соблюдая необходимые режимы. В отдельных случаях прибегают к сухожаровой стерилизации.

Изучение технологии получения питательных сред

В промышленности микробного синтеза широко используются чистые углеводы, а также природные и технические продукты, богатые углеводами, К ним относятся глюкоза, сахароза, лактоза, крахмал, кукурузная мука, меласса, зеленая патока.

Для приготовления питательных сред используются техническая глюкоза. Она содержит не менее 99,5% редуцирующих веществ (в пересчете на сухой остаток) и фактически представляет собой чистый углевод.

Сахароза - свекловичный иди тростниковый сахар. Техническая сахароза, используемая в промышленности, содержит не менее 99,75% сахарозы, которая представляет собой дисахарид, состоящий из глюкозы и фруктозы.

Лактоза - молочный сахар. Она содержится только в молоке и в других природных продуктах не обнаружена. Получают лактозу из молочной сыворотки, которая образуется при производстве сыров, творогов, казеина. Лактоза представляет собой дисахарид состоящий из глюкозы и галактозы.

Крахмал - на 96-97% состоит из полисахаридов, кроме того, в нем присутствуют минеральные вещества и жирные кислоты. Полисахариды крахмала представлены двумя типами - амилазой (10-20%) и амилопектином (80-90%).

Крахмал получают из картофеля или кукурузы. Крахмалы разного происхождения значительно различаются по разветвленности цепей, степени полимеризации и некоторым другим свойствам. Под действием амилолитических ферментов крахмал расщепляется до глюкозы, которая в дальнейшем утилизируется продуцентом по гликолитическому или пентозофосфатному путям.

Кукурузную муку получают при разматывании зерен кукурузы. В промышленных средах кукурузная мука часто заменяет крахмал, являясь более дешевым сырьем. Кукурузная мука содержит:

другие углеводы (клетчатка, пептозаны, растворимые углеводы) - 10%;

Среди зольных элементов в небольшом количестве присутствуют ионы фосфора, калия, магния. Состав кукурузной муки может колебаться в значительных пределах в зависимости от сорта кукурузы, условий ее выращивания и хранения.

Меласса - отход сахарного производства. Она представляет собой маточный раствор, образующийся при отделении кристаллов сахарозы на центрифуге после третьей кристаллизации. По внешнему виду меласса - густая вязкая жидкость темно-коричневого цвета. Состав непостоянен и может колебаться в зависимости от почвенных и климатических условий выращивания свеклы, технологии ее переработки, условий транспортировки и хранении мелассы.

Нормальная меласса в среднем содержит: сухие вещества - 75-82%, сахароза - 45-50%, общий азот - 1,2-2,2%, зола 6-10%. В мелассной золе присутствует много калия, магния, кальция, железа, но сравнительно мало фосфора. Кроме того в мелассе содержится ряд аминокислот, витаминов группы В и органических кислот.

Зеленая патока - отход производства глюкозы их крахмала. Она содержит не менее 76% редуцирующих веществ, золы - не более 3,5%, сухих веществ - не менее 50%. Сахара зеленой патоки состоят в основном из глюкозы. Основная часть зольных элементов - хлористый натрий, образующийся при нейтрализации соляной кислоты, применяемой для гидролиза крахмала содой.

Азотное питание микроорганизмов по своему значению приближается к углеродному, хотя уступает последнему по объему. Азот входит в состав клеточных компонентов, которые обеспечивают жизнеспособность организмов. Источниками азотного питания для продуцентов БАВ служат различные азотсодержащие вещества неорганического и органического происхождения. Источниками минерального азота чаще всего являются соли аммония и азотной кислоты. В качестве органических источников азота в промышленности наиболее широко применяются кукурузный экстракт и соевая мука.

Кукурузный экстракт - это отход производства крахмала из кукурузы. По внешнему виду это густая жидкость темно-коричневого цвета с хлопьевидной взвесью или почти однородная. В состав кукурузного экстракта входят:

азот аминный - 1-3%;

органические кислоты - 15-20%;

зола - не более 24%.

Основными элементами золы являются фосфор, калий, магний. Кукурузный экстракт также содержит витамины группы. В некоторые ростовые вещества, биостимуляторы.

Соевую муку получают при размалывании соевых бобов, а также соевого жмыха и шрота, образующихся после извлечения соевого масла. Соевая мука подразделяется на необезжиренную, полуобезжиренную и обезжиренную. Кроме того, соевая мука бывает дезодорированная (обработанная паром) и недезодорированная. Обработка паром позволяет увеличить срок хранения, и дезодорированная мука может храниться в течение года, а недезодорированная - 1,5 - 3 месяца.

Из основных компонентов соевой муки особое значение для процессов ферментации имеют азотсодержащие вещества. Азот соевой муки находится главным образом в составе белков, на долю которых приходится 40,5%. Кроме белков в соевой муке содержатся углеводы - до 25%; органические кислоты - 1,5%; зола 4,5-6,5%. В необезжиренной муке присутствует 19,5% жира. В состав золы входят ионы калия, фосфора, магния, кальция, а также ряд микроэлементов.

Минеральные компоненты играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Содержание их в клетке относительно не велико, но функции чрезвычайно важны. Минеральные элементы в клетках микроорганизмов необходимы для регулирования осмотического давления, окислительно-восстановительных условий и величины рН. Они изменяют гидрофильность протоплазмы, а также играют и пластическую роль, входя в состав конструктивного материала клеток.

Минеральные элементы участвуют в формировании пространственной структуры биополимеров - белков и нуклеиновых кислот.

Одна из основных функций минеральных элементов - участие в ферментативном катализе. В настоящее время действие четвертой части всех ферментов в клетки связано с металлами. Минеральных состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клетки. Обычно клетки микроорганизмов имеют отрицательных заряд. При добавлении в среду электролитов он снижается и тем сильнее, чем выше валентность добавляемого противоиона. Изменение электрического потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность, воздействовать на селективность клеточной мембраны, вызвать флокуляцию или флотацию клеток.

Питательные среды по своему составу подразделяются на две группы: натуральные (естественные) и синтетические.

Натуральными называются среды, имеющие неопределенный химический состав, так как в них входят продукты растительного или животного происхождения, отходы различных производств. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития.

Синтетическими называются среды, в состав которых входят только определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Такие среды широко используются для исследований, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов.

По физическому состоянию среды подразделяются на жидкие, плотные и сыпучие.

Жидкие среды используются для накопления биомассы или продуктов метаболизма. Плотные среды готовят из жидких, добавляя агар-агар или кремнекислый гель (силикагель). Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не может использовать его в качестве субстрата и поэтому он является лишь уплотняющим средством. В холодной воде полисахарид нерастворим, но растворяется в ней при нагревании до высокой температуры (90-100° С). При охлаждении агаровая среда застывает в виде студня с гладкой поверхностью. Такие среды используются' для выделения чистых культур, для хранения культур, количественного учета микроорганизмов и в ряде других случаев.

Сыпучие среды - разваренное пшено, перловая крупа, Отруби, пропитанные питательным раствором - используют в промышленной микробиологии для получения некоторых БАВ, например, ферментов.

Биотехнология аминокислот. Микробиологический синтез. Продуценты. Преимущества микробиологического синтеза перед другими способами получения.

Аминокислоты являются составными элементами белков. Все 20 аминокислот являются мономерами для построения природных полипептидов и хорошо изучены (методы их синтеза давно подробно описаны). Известно также, что эти соединения существуют в виде оптических изомеров (вспомните теорию строения органических соединений Бутлерова A.M., открывшего ассиметрию атома углерода с четырьмя заместителями, определяющими направление и степень вращения плоскости поляризованного света) .

Современные методы органического синтеза позволяют синтезировать L- и D-формы аминокислот, но только как рацематы, дальнейшее разделение которых представляет трудную задачу и экономически не эффективно.

Другой способ получения аминокислот - это микробиологический синтез, когда используют штаммы-продуценты, осуществляющие сверхсинтез аминокислот. Избыточные количества аминокислот, например, L -лизина, L -глутаминовой кислоты, L -треонина, L -трептофана экскретируются (выходят) в культуральную (внешнюю) среду. Культуральная среда в этом случае может содержать от четырех, пяти и до ста граммов целевой аминокислоты на один литр жидкой фазы. В отличие от химического синтеза, в этом случае, то есть при биосинтезе аминокислот с помощью ферментных систем микроорганизмов, получаются исключительно L-формы аминокислот, обуславливающих терапевтический эффект, а не рацематы. Это обстоятельство решает проблему

выбора получения аминокислот в промышленном масштабе в пользу биотехнологических методов.

Аналогичная ситуация сложилась и в области производства антибиотиков. Химический синтез, как правило, не эффективен. Именно поэтому в фармацевтической промышленности антибиотики получают с помощью штаммов-продуцентов, которые генерируют нужный антибиотик в определенной фазе роста в заданном режиме культивирования. Однако, использование в дальнейшем химической трансформации природных антибиотиков рождает новые лекарственные средства и помогает преодолевать резистентность микроорганизмов к лекарственным препаратам, повышая эффективность лечения.

Сегодня известны 4 метода получения аминокислот:

1. химический метод (тонкий органический синтез)

2. химико-энзиматический метод (энзиматическая трансформация химически
синтезированных предшественников аминокислот с образованием
биологически активных L-изомеров). Метод достаточно дорогой.

3. биологический метод ( применение гидролиза белоксодержащих
субстратов)

4. прямой микробиологический метод (получение L-аминокислот). Метод
более дешевый, экономически выгодный.

Наиболее распространенными методами получения аминокислот являются химико-энзиматический и микробиологический.

В качестве примеров использования химико-энзиматического метода можно привести:

• синтез аспарагиновой кислоты из фумаровой (используются клетки
Escherichia coli)

• синтез L-фенилаланина из коричной кислоты (используются клетки
дрожжей).

Имея задачу получения аминокислот, используя природные микроорганизмы, надо помнить о механизмах регуляции биосинтеза по принципу обратной связи (ретроингибирование). Эта регуляция осуществляется либо за счет ингибирования активности одного из начальных ферментов собственного синтеза избыточным продуктом, то есть самой аминокислотой, либо репрессируется весь комплекс ферментов всей биохимической цепочки метаболизма клетки, что является естественной реакцией живого микроорганизма-продуцента для сохранения собственного равновесия на клеточном уровне. Таким образом перед биотехнологом стоит задача в нарушении этих механизмов, чтобы иметь возможность получить целевой продукт в необходимых количествах.

Как это делается, можно рассмотреть на примере продуцентов лизина (Corynebacterium glutaminicum) и треонина (Escherichia coli).

У Corynebacterium glutaminicum есть принцип согласованного ингибирования ферментативной активности, что является особенностью биосинтеза биосинтеза предшественника лизина. Ингибирование синтеза лизина в клетке возможно только при повышенной концентрации обеих конечных продуктов -лизина и треонина. Самостоятельно ни лизин, ни треонин не ингибируют активности ключевого фермента -аспартакиназы. Они ингибируют этот синтез только вместе. Таким образом, вызвать сверхсинтез лизина можно лишь нарушив синтез треонина или его предшественника - гомосерина.

Таким образом большинство продуцентов лизина нуждается в присутствии гомосерина или треонина, иначе они работать не будут. Зная это, биотехнолог, выращивая такие продуценты, должен обязательно вносить в питательную среду от половины грамма и до полутора граммов на один литр гомосерина или треонина. В этом случае происходит активный рост биомассы продуцента без синтеза лизина. Как только треонин исчезает из среды и рост биомассы прекращается, начинается активный синтез лизина. Таким образом, данный процесс имеет две стадии развития

1. рост биомассы

2. синтез лизина

Продолжительность синтеза составляет 2-3 суток. Уровень накопления продукта составляет 50-100 граммов на литр. Это особенности биосинтеза лизина.

Для решения задачи получения треонина в необходимых количествах пришлось сделать следующее:

1. изменить, сделать нечувствительным к треонину первый фермент треонина

2. снизить активность фермента, синтезирующего из треонина изолейцин

3. убрать механизм репрессии при недостаточном количестве изолейцина несмотря на избыток треонина

4. применить генную инженерию (выделить треониновые гены и размножить их на плазмидах в клетке микроорганизма, резко повысив синтез треонина клетками продуцента)

В рассматриваемом случае синтез треонина отличается от синтеза лизина тем, что его синтез происходит одновременно с ростом биомассы. Здесь уже нет двух стадий.

Особенности культивирования штаммов-продуцентов аминокислот приводят к следующему результату:

1. достигаются максимально высокие скорости синтеза аминокислот
клетками продуцента

2. достигается максимальная длительность работы продуцента

3. минимально образуются побочные продукты биосинтеза аминокислот.
Первая задача решается путем выращивания высокоактивной биомассы и помогают в этом случае наличие в питательной среде: источников углерода, аммонийного азота, минеральных солей, ростовых факторов; оптимизация рН (кислотность среды) температуры; дробная подача субстратов.

Для предотвращения закисления среды проводят автоматическое рН-статирвоание аммиачной водой и источниками углерода.

В случае биосинтеза лизина добавляют ростовые факторы по мере необходимости, что зависит от самого сырья, от аппаратуры, от температуры. Процесс биосинтеза энергоемкий и требует интенсивной аэрации и перемешивания.

Для длительной работы ауксотрофных продуцентов лизина в питательную среду вносят комплексный источник аминокислот (белковые гидролизаты).

Внимание! Синтез нужной аминокислоты может прекращаться, если на ее продуцент действуют его токсические метаболиты, которые синтезируются самим продуцентом. Например, в процессе биосинтеза фенилаланина, продуцентом которого является Bacillus subtilis, этот продуцент синтезирует примеси ацетоина и бутандиола, в результате этого клетки продуцента лизируются, образуют споры и прекращают вырабатывать фенилаланин. Чтобы избежать это явление, необходимо ферментацию вести в условиях лимита (ограничения) по источнику углерода. В этом случае весь сахар расходуется только на синтез фенилаланина, увеличивая как количество (в два раза), так и чистоту получаемого продукта.

В заключение можно сказать, что:

- эффективность использования субстрата при биосинтезе аминокислот зависит от продуктивности биомассы,

- если синтез аминокислот разобщен с ростом биомассы ( смотри лизин), то эффективность использования субстрата будет тем выше, чем дольше будет работать культура после остановки роста,

- если же синтез аминокислоты идет параллельно росту биомассы (смотри треонин), то эффективность биомассы можно увеличить добавляя определенное количество предшественников.

Наиболее перспективным направлением являются методы генетической инженерии - введение в клетку продуцента многокопийных плазмид, содержащих гены, контролирующие биосинтез аминокислот в ущерб синтезу биомассы и других клеточных компонентов.

С помощью гибридных плазмид в биосинтезе аминокислот мы получаем

1. рост продуктивности биомассы

2. исчезновение примесей (более чистый продукт)

3. возрастает коэффициент использования субстрата (его минимум дает максимум продукта).

Техническая микробиология не только быстро развивающаяся в настоящее время наука, но и наука, имеющая большое будущее. Ее достижения вносят вклад в решение очень важных социальных проблем, обусловленных истощением топливных, кормовых, пищевых ресурсов, происходящих на фоне быстрого роста населения на земном шаре. При участии промышленной микробиологии возможна частичная компенсация дефицита указанных продуктов на нашей планете. Она призвана участ¬вовать в очистке и охране окружающей среды от всевозможных загрязнений, создающих угрозу жизни.

Содержание

Введение …………………………………………………………. 3
Глава 1.Образование и получение аминокислот ……………….7
Глава 2. Микробиологический синтез. Получение аминокислот методом прямой ферментации. Использование диких штаммов ………… 11
2.1. Технология получения L-глутаминовой кислоты микробиологическим синтезом ……………………………………… 17
2.1.1. Одноступенчатый способ получения. ……………………. 20
2.1.2. Двухступенчатый способ получения. .…………………….. 25
Заключение …………………………………………………………. 30
Список литературы ………………………………………………….. 32

Вложенные файлы: 1 файл

Аминокислоты.doc

Глава 1.Образование и получение аминокислот ……………….7

Глава 2. Микробиологический синтез. Получение аминокислот методом прямой ферментации. Использование диких штаммов ………… 11

2.1. Технология получения L-глутаминовой кислоты микробиологическим синтезом ……………………………………… 17

2.1.1. Одноступенчатый способ получения. ……………………. 20

2.1.2. Двухступенчатый способ получения. .…………………….. 25

Техническая микробиология не только быстро развивающаяся в настоящее время наука, но и наука, имеющая большое будущее. Ее достижения вносят вклад в решение очень важных социальных проблем, обусловленных истощением топливных, кормовых, пищевых ресурсов, происходящих на фоне быстрого роста населения на земном шаре. При участии промышленной микробиологии возможна частичная компенсация дефицита указанных продуктов на нашей планете. Она призвана участвовать в очистке и охране окружающей среды от всевозможных загрязнений, создающих угрозу жизни.

Важная роль отводится промышленной микробиологии в создании и производстве лекарственных препаратов для охраны здоровья людей. Все эти многообразные формы участия прикладной микробиологии в поддержании жизни на земле обусловлены своеобразными свойствами микроорганизмов: они чрезвычайно быстро растут, обладают разнообразными субстратными возможностями и отличаются высоким содержанием белка в клетках — это, с одной стороны. С другой стороны, они могут использовать возобновляемое сырье.

Природные свойства микроорганизмов и достаточно высокий уровень знаний о них позволяют возлагать большие надежды на биотехнологию — ключевую технологию настоящего и будущего, в составе которой технической микробиологии отводится центральное место микробиологическим процессам, которые лежат в основе крупных промышленных микробиологических производств: получение ферментов, антибиотиков, аминокислот, препаратов на основе микробной биомассы.

Техническая микробиология изучает получение веществ, полезных человеку, с помощью микроорганизмов и занимаете также биологическими процессами биогеотехнологии и очистки окружающей среды. Около 40% всех продуктов развивающейся экономики имеет биологическую природу или происхождения. Производство ряда продуктов может полностью или частично базироваться на микробном синтезе. В первом случае продукт имеет, как правило, микробиологическое происхождение.

Исключение составляют некоторые белки человека, продуцируемые специально сконструированными штаммами кишечной палочки.

Во втором случае продукты имеют растительное, животне происхождение или синтезируются химическим путем.

Производства такого типа: сыроделие, виноделие, хлебопечение, синтез витамина С и другие включают микробиологические реакции как обязательные стадии общего процесса.

Микробиологическим путем производят: сложные белковые продукты — биомассу, ферменты, азотные бактериальные удобрения, которые химическим путем получить очень трудно.

Микробный синтез применяется для производства уникальных веществ сложного строения, синтезируемых только микрорганизмами, например витамина B12, некоторых антибиотиков и для производства простых веществ, например аминокислот или этилового спирта, бутанола, ацетона, некоторых органических кислот, которые могут быть получены иным путем (из белковых субстратов или нефтехимического сырья), но микробный синтез на данном этапе оказывается экономически выгодным.

В основе всех микробиологических производств лежит хорошее знание физиолого-биохимических свойств продуцента и его генетики. Конструирование новых штаммов методами генетической инженерии и достижения инженерной технологии сильно увеличили возможности промышленной микробиологии. Теперь с помощью микроорганизмов возможно получение веществ, которые они ранее никогда не синтезировали, например белков животных, растений и человека.

Важное значение имеют работы по сохранению ценных свойств штаммов, сконструированных методами генетической инженерии, созданию новых штаммов и усовершенствованию уже имеющихся.

Иммобилизация клеток и ферментов создает возможности для автоматизации производственных процессов.

Мы живем в период постепенного истощения пищевых и кормовых ресурсов. Потребность людей в животном белке удовлетворяется в настоящее время только на 40%, и одна четверть населения земного шара голодает. Дефицит животного белка увеличивается в связи с быстрым ростом народонаселения. Согласно официальным прогнозам население земного шара возрастет с 4,8 до 6,2 млрд. к 2000 г., а ежегодный прирост производства животного белка достигает пока лишь 2—3%.

Очевидные трудности в сельскохозяйственной практике связаны с потребностью в воде, соответствующими пределами температуры, необходимостью защиты растений от вредных насекомых и применения неорганических удобрений в большом масштабе, так как растения и животные уносят азот с сельскохозяйственных площадей.

Нельзя ли как-нибудь иначе добывать пищу? Можно, если к этой работе привлечь микроорганизмы. Для их культивирования не нужно больших площадей и вышеперечисленных условий. Стоимость микробных белковых препаратов не зависит от погоды, эпидемий и снижения урожая.

Существует много микроорганизмов, которые превращают неорганический азот в органическую форму за счет различных и многих источников энергии. Микроорганизмы очень быстро растут. Поросенок или цыпленок могут удваивать вес за 1 мес., а дрожжевая клетка за 3 ч. Причем около половины микробной клетки, растущей при соответствующих условиях, состоит из белка и высокие скорости синтеза белка микробной системой составляют самое большое преимущество в сравнении с традиционным сельским хозяйством. Микроорганизмы можно выращивать на дешевом, непищевом субстрате, каким служит клетчатка, метанол, метан, водород и др. Биомасса может быть источником белков (ферментов), липидов, полисахаридов, витаминов, каротиноидов.

Глава 1. Образование и получение аминокислот

Аминокислоты — важный строительный материал организма, из которого формируются пептиды и белки. Растения и микроорганизмы способны сами синтезировать-все нужные им аминокислоты. Однако человеческий организм способен синтезировать лишь 12 аминокислот из 20. Остальные 8, получившие название незаменимых являются изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, валин, фенилаланин., должны поступать в организм извне — с пищей. Для сельскохозяйственных животных к незаменимым относится также гистидин и аргинин, а для молодняка птицы — еще пролин.

Недостаток хотя бы одной из незаменимых аминокислот приводит к замедлению роста организма, возникновению болезней. В связи с этим важно корректировать рационы питания введением указанных аминокислот.

В мире получают их более 400 тыс. т. Производство многих аминокислот — крупнотоннажная отрасль химической промышленности. Но химики получают смесь оптических изомеров L- и D-аминокислот. В химических реакциях эти изомеры неразличимы, однако в большинстве случаев человеческий организм усваивает лишь L-аминокислоты. При микробиологическом производстве образуется только биологически активный L-изомер, в связи с этим 60% мировой продукции аминокислот получают путем микробиологического синтеза. Среди них наибольший объем производства имеют глутаминовая кислота и лизин.

Аминокислоты — это питательные вещества, ароматические и вкусовые агенты, и потому широко используются в пищевой промышленности в виде приправы к кушаньям.

Глутамат Na и глицин вносят в пищевые концентраты как ароматические вещества для усиления и улучшения вкуса пищи.

В большом количестве аминокислоты применяют как добавку к растительным кормам, которые дефицитны по метионину, треонину, триптофану и лизину. Корма содержат их на 30— 40% меньше, чем требуется животным, вследствие чего биологическая ценность белков растительных кормов сильно снижается. Введение в корма дефицитных аминокислот позволяет снизить содержание белков животного происхождения при сохранении того же ростового эффекта. За последние года количество аминокислот, добавляемых в корма, выросло в 14 раз. Около 66% общего количества аминокислот, получаемых в промышленности, используют в кормах, 31 — в пище и 4% — в медицине, косметике и в лабораторных исследованиях. По объему производства и по значимости первое место среди кормовых аминокислот занимает L-метионин. Во многих странах его добавляют к соевой муке — белковой добавке кормов, дефицитной по L-метионину. Поскольку млекопитающие могут утилизировать D-метионин, хотя и более медленно, чем L-форму, то применяют рацемическую смесь, получаемую химическим путем, так как это дешевле. Аминокислоты используют в медицине. Так, аргинин в cочетании, с аспартатом или глутаматом помогает при заболевании печени.

Под действием аргинина повышается активность иммунологической системы у послеоперационных больных. K-Na-аспартат снимает усталость и назначается для облегчения боли в сердце, его рекомендуют при заболевании печени и диабете. Цистеин защищает SH-ферменты в печени и других тканях от окисления и оказывает детоксицирующее действие. Он проявляет также защитное действие от повреждений, вызываемых облучением. Триптофан — антидепрессант, его используют при лечении алкоголизма и бессонницы.

Дегидроксифенилаланин и L-фенилаланин эффективны при болезни Паркинсона. Его аналог — 5-гидрокси-L-триптофан используют как психотерапевтическое средство. Из полиаминокислот получают хороший материал для хирургии и применяют его для замены человеческой кожи при лечении ожогов. Из аминокислот готовят искусственный подсластитель — метиловый эфир L-аспартил-L-фенилаланина — аспартам, который в 150 раз слаще, чем глюкоза. С помощью аспартама удается снизить на 95% калорийность ряда пищевых продуктов без изменения их вкусовых качеств. Аминокислоты применяют также в косметике. Для поддержания нормальной функции кожи их добавляют в кремы. В шампуни вносят цистеин. Таким образом, применение аминокислот многообразно, но пока ограничено уровнем производства и высокой себестоимостью. Аминокислоты относятся к важнейшим компонентам клетки, синтезируются в нужном для клетки количестве и их биосинтез находится под строгим генетическим контролем.

Для получения сверхсинтеза аминокислот нужно обойти этот контрольный механизм или изменить его. Если идут по первому пути, то работают с природным (диким) штаммом, выбор второго пути связан с получением мутантов. Из методов генетической инженерии для получения аминокислот наиболее употребительна амплификация генов.

Существуют 3 способа получения аминокислот: выделение из гидролизатов природных материалов; химический синтез; микробиологический или энзиматический синтез.

1-й и 3-й способы дают оптически активные изморы (обычно L-формы), химический синтез — рацемическую смесь и требуется ее последующее разделение.

Получение аминокислот из гидролизатов связано с многоступенчатой очисткой и экстракцией. В качестве гидролизуемого сырья используют кератин, куриный белок, кровь, кормовые дрожжи, растительные материалы.

Микроорганизмы, которые используют для получения аминокислот, подразделяют на 4 класса: дикие штаммы, ауксотрофные мутанты, регуляторные мутанты и ауксотрофные регуляторные мутанты. Для стабилизации продукции (предотвращения обратных мутаций) в ауксотрофные мутанты вносят разные маркеры.

Промышленные штаммы обычно несут несколько мутаций затрагивающих механизмы регуляции соответствующей аминокислоты и ее предшественников.

В промышленности чаще всего используют штаммы коринебактерий (С. gluiamicum), бревибактерий (В. flavum) и в последние годы — штаммы Е. coli, сконструированные с помощью методов генетической инженерии. По окончании ферментации для получения кормовых препаратов культуральную жидкость высушивают. Для получения высокоочищенных препаратов для медицины и пищевой промышленности аминокислоты экстрагируют из культуральной жидкости и очищают чаще всего с помощью ионообменных смол с последующей кристаллизацией.

Помимо применения в качестве пищевых добавок, биодобавок (БАДов), приправ и усилителей вкуса аминокислоты используются как сырье в химической, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве других веществ:

- глицин - как подсластитель, антиоксидант, бактеориостатик,
- аспарагиновая кислота – усилитель вкуса, сырье для синтеза аспартама (подсластителя),
- гистидин – противовоспалительное средство,
- глутаминовая кислота - усилитель вкуса, препарат для лечения психических заболеваний,
- метионин – пищевая и кормовая добавка,
- треонинин триптофан - пищевая и кормовая добавка,
- триптофан - пищевая и кормовая добавка,
- цистеин – фармацевтический препарат,
- фенилаланин – сырье для получения аспартама,
- лизин – пищевая и кормовая добавка, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

Гидролизом природного белковосодержащего сырья.
Химическим синтезом.
Микробиологическим синтезом.
Биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

Замещение галогена на аминогруппу в соответствующих галогензамещенных кислотах:

Присоединение аммиака к α, β- непредельным кислотам с образованием β-аминокислот:

Восстановление нитрозамещенных карбоновых кислот (применяется обычно для получения ароматических аминокислот):

Биотехнологический способ получения чистых α- аминокислот в виде индивидуальных оптических изомеров. Этот способ основан на способности специальных микроорганизмов вырабатывать в питательной среде определенную аминокислоту.

В данной работе рассматривается и предлагается два способа получения лизина. В первом способе лизин получают на среде, содержащей молотую массу или сок свеклы.
Новизной научно-технической проблемы является то, что производство аминокислот методом микробного синтеза проводят более, чем 40 лет, но предложений специалистов использовать в качестве сырья молотую массу и / или сок свеклы не было. Это решение оказалось неочевидным в ситуации, когда, с одной стороны, сахара, используемые в качестве сырья, и патока, кроме технического, имеют соответственно пищевое или кормовое значение и их ресурсы являются ограниченными и, с другой стороны, молотая масса и сок свеклы является сравнительно недорогими и их можно получать в достаточных объемах.
Целью исследования является расширение базы сырья и интенсификация процессов получения незаменимых аминокислот. Расширение базы сырья обусловлено тем, что в процессе производства аминокислот используется новый вид сырья – продукты переработки сахарной свеклы, масштабы которого достаточно велики. При этом сырье может использоваться частично или полностью в безводном виде. Интенсификация процессов производства аминокислот происходит в связи с высоким содержанием в сахарной свекле и продуктах его переработки – молотой массе и сока – веществ, используемых продуцентами, и в культуральной жидкости накапливается больше аминокислот и сырого протеина за более короткий промежуток времени.
Упрощается технология производства, поскольку для получения эквивалентного и даже большего количества аминокислот и сырого протеина не нужна операция твердофазного культивирования продуцента. Улучшение качества конечного продукта возникает за счет повышенного содержания в нем аминокислот и сырого протеина.
Сахарную свеклу перерабатывают на молотую массу и сок любым способом. К полученным продуктам добавляют необходимые источники азота, фосфора, хлора, калия, а также стимуляторы роста в виде минеральных солей, кукурузного экстракта и гидролизата дрожжей, а также воду в оптимальном количестве для биосинтеза отдельной аминокислоты. В среду вносят 5% посевного материала в виде суспензии Brevi bacterium sp. (Штамм С-7) с оптической плотностью 0,3. Биосинтез проводят при (30±1)ºС, рН 7,2±0,2 объема воздуха на объем среды за одну минуту. После 68 часов глубинного культивирования в среде накапливается 3,75% лизина и в пересчете на сухое вещество 40,6% сырого протеина.
Этот способ упрощает технологию получения лизина, повышает качество продукции, увеличивается выход конечного продукта в 1,5 раза, снижает затраты энергоемкости, что, в свою очередь, приводит к удешевления конечной продукции, а также снижает загрязнение окружающей среды.
Целью второго способа получения лизина является снижение стоимости за счет увеличения выхода продукта с единицы оборудования на стадии биосинтеза. При этом применяют новый штамм продуцента L-лизина Brevi bacterium sp. 90 Н, который хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, этаноле. Brevi bacterium sp. 90 Н – это аэроб, что растет при температуре и на среде с рН от 6 до 8,5. Этот штамм устойчив к бактериофагам.
При использовании мелассы из свеклы в культуральной жидкости накапливается бетаин – вещество, содержащее азот, которое не усваивается продуцентами лизина и полностью сохраняется в готовом продукте.
Так, кормовой препарат содержит от 7,5% до 14% бетаина.

Использование микроорганизмов как биологических агентов для получения биомассы, органических кислот, спиртов, аминокислот, ферментов, гормонов и других соединений, трансформации органических веществ (получение биогаза, очистка сточных вод и др.) является важной составной частью биотехнологии. Уникальность микробной клетки заключается в высокой интенсивности микробного метаболизма. Скорость образования белка у бактерий на много порядков выше, чем у растений и в 10 раз выше, чем у животных (А.Г.Лобанок и др.,1988). Это позволяет относительно дешево производить многие ценные продукты (белки, витамины, жиры, ферменты, антибиотики и др.). Субстратом для таких производств могут служить отходы сельского хозяйства, промышленности, что играет важную роль в охране окружающей среды. Микробиологическое производство ряда продуктов менее энергоемко в сравнении с химическим, а некоторые природные соединения получить на основе химического синтеза невозможно. Главными направлениями использования биотехнологии микроорганизмов является получение полезных продуктов, энергии и защита окружающей среды.
Эффективность биотехнологии микроорганизмов за последнее время повышается в связи с созданием на основе методов генной и клеточной инженерии штаммов с новыми полезными свойствами.

Получение аминокислот
По значению для м/организма аминокислоты подразделяют на заменимые и незаменимые. К незаменимым относят те аминокислоты, которые не синтезируются в человеческом и животном организме. Для человека- 8 аминокислот: изолейцин, лейцин, лизин, метиония, треонин, триптофан, валин, фенилаланин. М/организмы сами синтезируют аминокислоты из аммиака и нитратов. Потребность в аминокислотах велика. В мире производится 500 тыс.тонн в год аминокислот. Широко используются в пищевой промышленности как питательные добавки. В больших количествах аминокислоты применяют как добавку к растительным кормам. Также применяют в медицине-4%, косметике. По объему .и по значимости первое место занимает- метионин.
Технология получения аминокислот базируется на принципах ферментации продуцентов и выделении вторичных метаболитов. Размножают маточную культуру вначале на агаризованной среде в пробирках, затем на жидкой среде в колбах, посевных аппаратах, затем в головных ферментаторах.

Если аминокислота предусмотрена в качестве добавки к кормам, то биотехнологический процесс кормового продукта включает следующие стадии:

Известны 2 способа получения аминокислоты:

В медицине биотехнологические приемы и методы играют ведущую роль при создании новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов, предназначенных для ранней диагностики и лечения различных заболеваний. Антибиотики — самый большой класс фармацевтических соединений, получение которых осуществляется с помощью микробиологического синтеза. Созданы генноинженерные штаммы кишечной палочки, дрожжей, культивируемых клеток млекопитающих и насекомых, используемые для получения ростового гормона, инсулина и интерферона человека, различных ферментов и противовирусных вакцин. Изменяя нуклеотидную последовательность в генах, кодирующих соответствующие белки, оптимизируют структуру ферментов, гормонов и антигенов (так называемая белковая инженерия). Важнейшим открытием явилась разработанная в 1975 Г. Келером и С. Мильштейном техника использования гибридом для получения моноклональных антител желаемой специфичности. Моноклональные антитела используют как уникальные реагенты, для диагностики и лечения различных заболеваний.

Биотехнология в медицине

Производство аминокислот относится к одной из наиболее передовых областей биотехнологии. Аминокислоты получают путем химического синтеза или экстракцией из белковых гидролизатов.

Незаменимые аминокислоты могут получаться микробиологическим путем более эффективно, чем путем химического синтеза, так как при биологическом синтезе используемые микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме. Как продуценты лизина изучаются Brevibacterium lactofermentum и бактерии рода Corynebacterium, также предложены способы биотехнологического получения изолейцина, треонина при использовании E. coli. Большинство исследованных штаммов микроорганизмов независимо от их систематического положения преимущественно накапливают L-аланин и глутаминовую кислоту. Значительно меньше штаммов и в меньшем количестве выделяют аспарагиновую кислоту, лейцин, валин, изолейцин, лизин. За рубежом 60% мощностей по производству аминокислот занимают глутаминовая кислота, далее идут метионин, лизин и глицин. Глутаминовая кислота производится при участии в качестве продуцента штамма Corynebacterium.

С помощью микроорганизмов можно получить до 60 органических кислот. Многие из них получаются в промышленном масштабе - итаконовая, молочная, уксусная, лимонная, яблочная, янтарная. Эти пищевые кислоты используются как регуляторы кислотности и консерванты. Лимонную кислоту получают с помощью Yarrowia lipolytica, Aspergillus niger, молочную – Endomycopsis fibuligera, Rhisopus oryzae,
Lactobacillus casei, янтарную – Anaerobiospirillum succiniproducens. Уксусную кислоту получают путем микробиологической конверсии водорода и углекислого газа бактериями Acetobacterium woodi и Clostridium aceticum.

1. Классификация продуктов биотехнологии и потребности в первичных метаболитах.

2. Промышленное производство аминокислот.

2.1. Микроорганизмы – продуценты аминокислот.

2.2. Производство лизина.

2.3. Получение глутаминовой к-ты, аргинина, глутамина, треонина, пролина.

2.4. Производство триптофана в промышленных масштабах.

2.5. Получение аминокислот химико-ферментативным способом.

Определение понятия

Аминокислоты - это органические соединения, содержащие одновременно щелочную аминную группу (NH2-) и кислотную карбоксильную (СООН-).

Отсюда и их название: Амино-Кислоты. Важным свойством аминокислот является их способность к поликонденсации и образованию полимеров в виде полиамидов, в том числе пептидов, белков, нейлона, капрона, энанта. Из определённого класса аминокислот (альфа-аминокислоты) собираются молекулы природных белков.

По объему производства среди соединений, производимых биотехнологическими способами, аминокислоты стоят на первом месте, а по стоимости – на втором, уступая в этом только антибиотикам.

Объем мирового производства аминокислот составляет более 500 тыс. т. в год. Из них – 300 тыс. т. – глутамат натрия, 100 тыс. т. – лизин, 140 тыс. т. – метионин. Однако эти объемы – лишь небольшая часть требуемого.

По данным ВОЗ мировая потребность в наиболее востребованных аминокислотах составляет:

1. Лизин - 5 млн. т.

2. Метионин - 4 млн.т.

3. Треонин - 3,7 млн.т.

4. Триптофан - 2 млн. т.

Об аминокислотах как структурной единице белков

Незаменимые аминокислоты (для человека):

Недостаток каждой из них в пищевом рационе приводит к нарушению обмена, замедлению роста и развития.

Пищевая ценность белка определяется долей незаменимых аминокислот в пище при сравнении с таким же показателем при адекватном питании. Наиболее сопоставимыми с идеалом являются белки молока и яиц.

Белки растительного происхождения характеризуются дефицитом некоторых незаменимых аминокислот. Так, белки пшеницы и риса обеднены лизином и треонином, а белки кукурузы – лизином и триптофаном.

Введение незаменимых аминокислот в кормовые концентраты позволяет сбалансировать корма сельскохоз. животных. Добавление в рацион 3-4 дефицитных аминокислот к 1 т комбикорма приводит к уменьшению общего расхода кормов на 15-20%. Выход продукции при этом увеличивается на 20%.Таким образом, обогащение кормов незаменимыми аминокислотами очень выгодно.

- глицин - как подсластитель, антиоксидант, бактеориостатик,

- аспарагиновая кислота – усилитель вкуса, сырье для синтеза аспартама (подсластителя),

- гистидин – противовоспалительное средство,

- глутаминовая кислота - усилитель вкуса, препарат для лечения психических заболеваний,

- метионин – пищевая и кормовая добавка,

- треонинин триптофан - пищевая и кормовая добавка,

- триптофан - пищевая и кормовая добавка,

- цистеин – фармацевтический препарат,

- фенилаланин – сырье для получения аспартама,

- лизин – пищевая и кормовая добавка, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1. Гидролизом природного белковосодержащего сырья.

2. Химическим синтезо.

3. Микробиологическим синтезом.

4. Биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

При гидролизе отходы пищевой и молочной промышленности нагревают с растворами кислот или щелочей при 100-105 С в течение 20-48 час. Чаще всего используют 20% р-р соляной к-ты, обеспечивающий глубокий гидролиз белка. Лучшим способом уменьшения потерь белка при гидролизе является проведение его в вакууме или в атмосфере инертного газа, а также соблюдение высокого соотношения количества к-ты, взятой для гидролиза и массы белка (200:1). Раньше методом гидролиза получали аминокислоты исключительно для фармацевтических и научных целей. Сейчас сфера использования белковых гидролизатов существенно расширилась. Их применяют в медицине, животноводстве, пищевой и микробиологической промышленности.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот. Более 60% всех производимых в настоящее время высокоочищенных препаратов аминокислот получают этим способом. Главное преимущество которого состоит в возможности получения аминокислот на основе возобновляемого сырья. Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности некоторых микроорганизмов выделять в культуральную среду значительных кол-в какой-либо одной аминокислоты. При этом было подмечено, что продуктивные штаммы можно улучшать посредством селекции мутантов с измененной генетической программой. Это роды Brevibacterium, Micrococcus, Corinebacterium, Arthrobacter.

Производство лизина

Для культивироания штаммов микроорганизмов при производстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы – глюкоза, сахароза, реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторичное сырье – свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. В качестве источников азота применяют мочевину, соли аммония (сульфаты и фосфаты). Для успешного роста микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрожжей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, витамины группы В. В питательную среду добавляют некоторые макро- и микроэлементы: P, Ca, Mg, Mn, Fe и др. На процессы биосинтеза существенное влияние оказывает аэрация, при этом степень снабжения воздухом индивидуальная для каждой конкретной аминокислоты.

Среди соединений, получаемых биотехнологическими методами, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот составляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится на глутамат натрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин. Однако указанный объем — лишь небольшая доля от требуемого количества аминокислот. По данным ВОЗ, потребность человечества всего лишь в четырех незаменимых аминокислотах составляет, млн т: для лизина — 5, метионина — 4, треонина — 3,7 и триптофана — 2.

Аминокислоты — структурные единицы белков. Природные аминокислоты вовлечены в биосинтез ферментов, ряда гормонов, витаминов, антибиотиков, алкалоидов, токсинов и других азотсодержащих соединений (пурины, пиримидины, гем и пр.). В организме животного практически половина белковых аминокислот не синтезируется. Они называются незаменимыми аминокислотами и должны поступать в организм с пищей. Недостаток каждой из с этих аминокислот в пищевом или кормовом рационе приводит к нарушению обмена веществ, замедлению роста и развития. Сведения о ежедневной потребности человека в незаменимых аминокислотах представлены в табл. 3.2.

Таблица 3.3. Потребность ряда сельскохозяйственных животных в незаменимых аминокислотах ( % к сырому протеину)

Аминокислота	Свиноматки	Куры-несушки	Коровы
Лизин	5,0	5,0	4,5
Метионин	3,2	3,6	1,7
Триптофан	1,2	1,2	—
Треонин	6,0	4,0	3,4

Пищевая ценность белка определяется сравнением доли незаменимых аминокислот в пище с этим же показателем при адекватном питании. Чем ближе обе величины, тем выше качество белка. 5епки яйца и молока обладают высокой пищевой ценностью и используются в качестве эталона при оценке других белков. Многие белки растительного происхождения характеризуются дефицитом некоторых незаменимых аминокислот. Так, белки пшеницы и риса обеднены лизином и треонином, а белки кукурузы — пизином и триптофаном.

Введение синтетических незаменимых аминокислот в кормовые концентраты позволяет балансировать корма сельскохозяйственных животных по уровню белка. При добавлении 2 —4 дефицитных аминокислот к 1 т комбикорма общий расход кормов уменьшается на 15 — 20 %, выход продукции увеличивается на 20 %. Добавление к кормам аминокислот способствует переводу животноводства на промышленную основу. Данные о потребности некоторых сельскохозяйственных животных в незаменимых аминокислотах приведены в табл. 3.3.

Помимо применения в качестве пищевых добавок, приправ и усилителей вкуса аминокислоты используют как сырье в химической, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве ряда других веществ:

глицин — подсластитель, антиоксидант, бактериостатик;

аспарагиновая кислота — усилитель вкуса, сырье для синтеза асгтартама;

глутаминовая кислота — усилитель вкуса, препарат для лечения психических заболеваний;

гистидин — противовоспалительное средство;

метионин — пищевая и кормовая добавки;

цистеин — фармацевтический препарат;

треонин и триптофан — пищевые и кормовые добавки;

фенилаланин — сырье для получения аспартама;

лизин — пищевая и кормовая добавки, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

гидролизом природного белоксодержащего сырья;
химическим синтезом;
микробиологическим синтезом;
биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

При гидролизе белоксодержащее сырье (отходы пищевой и молочной промышленности) нагревают с растворами кислот или щелочей при температуре 100 —105 °С в течение 20—48 ч. Чаще всего используют 20 %-й раствор соляной кислоты, обеспечивающий глубокий гидролиз белка. Кроме того, для ускорения реакции гидролиза белков используют иммобилизованные протеолитические ферменты и ионообменные смолы. В ходе кислотного гидролиза белков происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их аминокислот. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10—30%). Лучшим способом уменьшения потерь аминокислот при гидролизе является проведение его в вакууме или в атмосфере инертного газа, а также соблюдение высокого соотношения количества кислоты, взятой для гидролиза, и массы белка (200:1). Рациональное использование сырья при гидролизе, характерное для многих других биотехнологических производств, обеспечивает создание безотходных технологий и способствует оздоровлению окружающей среды. Ранее методом гидролиза получали аминокислоты исключительно для фармацевтических и научных целей. В последнее время сфера использования белковых гидролизатов существенно расширилась. Их применяют в медицине, животноводстве, пищевой и микробиологической промышленности.

Существенный недостаток методов химического синтеза аминокислот состоит в получении целевых препаратов в виде рацемической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее большинство природных аминокислот относится к L-ряду. D-a-аминокислоты обнаружены лишь в составе гликопротеинов клеточных стенок бактерий, антибиотиков и некоторых токсинов. Проницаемость L-аминокислот в клетке в 500 раз превышает таковую ее антипода. Стереоспецифичны также транспорт и метаболизм аминокислот. Исключением в этом отношении является лишь метионин, метаболизм которого нестереоизбирателен, благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем химического синтеза. Разделение рацематов других аминокислот — дорогая и чрезвычайно трудоемкая процедура.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот. Более 60 % всех производимых в настоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главное преимущество которого в сравнении с методами химического синтеза состоит в возможности получения L-аминокислот на основ возобновляемого сырья.

В последние годы при производстве аминокислот все шире используют биотрансформацию предшественников аминокислот, особенно с помощью иммобилизованных ферментов или клеток микроорганизмов, предварительно получаемых химическим путем.

Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности у некоторых микроорганизмов выделять в культуральную среду значительные количества какой-либо одной аминокислоты (С. Киносита, 1955). При этом было подмечено, что большинство из нескольких тысяч проанализированных диких штаммов микроорганизмов продуцировали аминокислоты во внешнюю среду, но в очень незначительных количествах. Не зафиксировано никакой связи между таксономическим положением микроорганизма и способностью к продуцированию той или иной аминокислоты. Так, среди возможных продуцентов глутаминовой кислоты отмечены организмы, из которых 30 % — дрожжи, 30% — стрептомицеты, 20% — бактерии и 10% — микроскопические грибы. И лишь один из обследованных штаммов микроорганизмов — Corynebacterium glutamicum был способен к сверхсинтезу глутамата. Этот штамм использовали при организации первого в мире крупномасштабного производства глутаминовой кислоты микробиологическим методом в Токио (1956). В России изыскания в области промышленного синтеза аминокислот были начаты в 50-х годах прошлого столетия по инициативе акад. А. А. Александрова.

Таблица 3.4 Микроорганизмы ― продуценты аминокислот (по Н. Б. Градовой и О. А. Решетник, 1987)

Перспективные штаммы продуцентов постоянно улучшают посредством селекции мутантов с измененной генетической программой и регуляторными свойствами. Распространенные объекты селекции продуцентов — микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Arthrobacter (табл. 3.4).

Разработка технологической схемы получения отдельной аминокислоты полностью базируется на знании путей и механизмов регуляции биосинтеза конкретной аминокислоты. Необходимого дисбаланса метаболизма, обеспечивающего сверхсинтез целевого продукта, добиваются путем строго контролируемых изменений состава и условий среды.

Микробиологические методы производства аминокислот

Производство лизина. По содержанию лизина наименее сбалансированы белки злаковых культур, у которых его дефицит составляет от 20 до 50 %. На территории России недостаток лизина в кормах не может быть восполнен за счет сои, поэтому в нашей стране производство этой аминокислоты было организовано первым. Для удовлетворения потребностей животноводства в лизине крупнотоннажное производство налажено в Испании, Франции, Японии и США.

В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного метаболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот — лизина, метионина и треонина (рис. 3.3).

Таким образом, в процессе новообразования аминокислот из общего предшественника одновременно с лизином возникают две другие аминокислоты — метионин и треонин. В этом случае эффекта накопления в среде всего одной целевой аминокислоты добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных аминокислот, возникающих в связи с разветвлением метаболического пути.

Образование лизина в клетке бактерии находится под строгим метаболическим контролем. У типичных продуцентов L-лизина — Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum — фермент аспартаткиназа, открывающий метаболический путь, является аллостерическим белком, чувствительным к ингибированию по принципу обратной связи при совместном и согласованном действие побочных продуктов L-треонина и L-лизина. При накоплении треонина и лизина в избыточной концентрации ингибируется аспартаткиназа и их синтез останавливается, при пониженной концентрации любой из двух аминокислот процесс активизируется.

Чтобы добиться образования лизина в больших количества: получают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезруется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результате чего блокируется синтез метионина и треонина. Такие мутанты являются ауксотрофами по гомосерину или треонину (метионину); внутриклеточная концентрация треонина у них существенно снижена, что снимает блокаду с аспартаткиназы. Поэтому при выращивании мутантных штаммов в среде, где присутствуют лимитирующие концентрации метионина и треонина, они способны образовывать избыточные количества лизина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминирующему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора — лизина.

Важный фактор, обеспечивающий в культуральной среде высокие концентрации аминокислоты, синтезированной внутри клетки, — проницаемость клеточных мембран. Проницаемость клеточной мембраны увеличивают либо с помощью мутаций, либо путем изменения состава питательной среды. В последнем случае в культуральной среде создают дефицит биотина (1 — 5 мкл/л), добавляют пенициллин (2 — 4 мкг/л), детергенты (твин-40 и твин- 60) или производные высших жирных кислот (пальмитаты, стеараты). Биотин контролирует содержание в клеточной мембране фосфолипидов, а пенициллин нарушает биосинтез клеточных стенок бактерий, что повышает выделение аминокислот в среду.

Для культивирования штаммов микроорганизмов при производстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы — глюкоза, сахароза и реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторичное сырье: свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. Технология этого процесса совершенствуется в направлении разработки дешевых синтетических питательных сред на основе уксусной кислоты (до 1,5%), пропионовой кислоты, метанола, этанола (до 1 %) и н-парафинов. В качестве источников азота применяют мочевину и соли аммония (сульфаты и фосфаты).

Для успешного развития микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрожжей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, витамины группы В. Кроме того, в питательную среду добавляют необходимые для жизнедеятельности макро- и микроэлементы (Р, Са, Mg, Мп, Feи др.). На процесс биосинтеза аминокислот существенное влияние оказывает снабжение воздухом, при этом степень аэрации индивидуальна для производства каждой конкретной аминокислоты. Стерильный воздух подается специальными турбинными мешалками (рис. 3.4). Опыты показали, что лизин появляется в культуральной среде начиная с середины экспоненциальной фазы роста культуры клеток микроорганизма и достигает максимума к ее концу. Поэтому на первой стадии технологического процесса формируют биомассу продуцента, которую выращивают в специальных посевных аппаратах в течение суток (рН 7,0 — 7,2; температура 28 — 30 °С), а затем подают в производственный ферментер, заполненный питательной средой. Лизин начинает поступать в культуральную жидкость через 25 — 30 ч после начала ферментации. По завершении процесса ферментации (через 55 — 72 ч) жидкую фазу отделяют от культуры клеток микроорганизма фильтрованием и используют для выделения из нее лизина.

Высокоочищенные препараты лизина получают после фракционирования фильтрата культуральной жидкости методом ионообменной хроматографии на катеоните. С этой целью лизин переводят в форму катиона:

Для данного процесса фильтрат обрабатывают соляной кислотой до рН 1,6—2,0 (рН

Читайте также: