Получение трансгенных растений реферат

Обновлено: 02.07.2024

Задачей селекционеров во все времена было получение хозяйственно ценных растений, животных, микроорганизмов. Основными методами традиционной селекции являются отбор, гибридизация, мутагенез, полиплоидия с целью получения нужного признака, который кодируется новым геном или новым комплексом генов.

Существенное продвижение в понимании того, как функционируют гены, расшифровка геномов и развитие методологии генной инженерии позволили перейти от длительных и трудоемких методов традиционной селекции к прямому генетическому конструированию нужных признаков у конкретного организма. При создании трансгенного организма новый генный комплекс конструируется в пробирке и напрямую вводится в организм, фактически таким методом получения нового признака ученые просто ускоряют эволюцию.

Новые методы селекции - это сочетание молекулярных и традиционных методов. Необходимо отметить, что старые методы также остаются широко востребованными при создании новых организмов. Выяснилось, что трансформированные с идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны, полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются по уровню экспрессии введенного гена, поскольку работает эффект положения и копийности гена.

И необходимо проводить дальнейший отбор с анализом наследования полученного признака, используя традиционные методы селекции. Генно-инженерные манипуляции с геномом, сформировавшимся в процессе длительной эволюции, могут нарушать, в какой-то степени, сбалансированные генные комплексы и, соответственно, жизнеспособность полученных трансгенных организмов.

Например, встраивание селективного гена, нужного только для отбора трансгенных растений, может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации.

Появляется необходимость дальнейшего скрещивания и отбора для удаления нежелательных побочных мутаций у трансгенов. Иногда имеется необходимость удаления маркерных генов вообще, так что для получения новых организмов применяется сочетание старых и новых методов селекции.

В настоящее время практическая генно-инженерная биотехнология развивается по двум основным направлениям.

Конструирование трансгенных растений

Возможность получения трансгенных растений основана на тотипотентности их некоторых клеток, т.е. способности в определенных условиях под действием фитогормонов дифференцироваться с образованием полноценного растения. Таким образом, из сконструированных генно-инженерными методами отдельных клеток можно получить фертильные растения, все клетки которых несут чужеродный генный комплекс (трансгенные растения).

Если такое растение цветет и дает жизнеспособные семена, то желаемый признак передается последующим поколениям. Кроме того, многие растения легко размножаются вегетативно. Существующими приемами микроклонального размножения in vitro из микроскопических кусочков ткани (эксплантов) можно быстро получить за короткий промежуток времени генетически однородный посадочный материал с высоким коэффициентом размножения, что важно для последующего применения трансгенного организма.

Для создания трансгенного растения необходимо трансформировать культивируемые клетки, их протопласты или клетки в составе органов, отделить от нетрансформированных клеток и получить из отдельных клеток целые трансгенные растения (рис. 2.12). К настоящему времени для трансформации растений разработано несколько эффективных систем переноса рекомбинантной ДНК в клетки и экспрессирующих векторов, которые работают в ряде растительных клеток.
Векторы на основе Ti-плазмид.

Рис. 2.12. Схема получения трансгенного растения трансформацией эксплантов (кусочки органа растения, например фрагменты тканей семядоли)

Бактерии рода Agrobacterium иногда называют природными генными инженерами за их способность переносить свою плазмидную ДНК в клетки зараженных растений, интегрировать ее в геном организма-хозяина и вызывать стабильную трансформацию этих клеток введенными генами. Все они приводят к образованию у двудольных растений корончатых галлов - трансформация индуцирует образование опухолей, похожих на раковые. Инфекционным агентом является так называемая Ti-плазмида (tumor-inducing plasmid) в 200-250 тнп (рис. 2.13), которая содержит все гены, необходимые для инфекционного процесса.

Рис. 2.13. Схема Ti-плазмиды. Указаны основные гены и их группы. Сайт инициации репликации (ori) обеспечивает удвоение плазмиды при делении клетки Agrobacterium. Колечками обозначены левая и правая фланкирующие
последовательности Т-ДНК

После присоединения Agrobacterium, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке, часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (Т-ДНК (transferred DNA), 12-24 тнп в зависимости от штамма), транспортируется в клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного конъюгации. При этом Т-ДНК транспортируется в одноцепочечной форме, и именно в такой форме она встраивается в хромосомную ДНК растения. С переносимой Т-ДНК остаются связанными два кодируемых Ti-плазмидой белка, способствующие ее вырезанию, и третий белок покрывает оболочкой переносимую одноцепочечную ДНК, предохраняя от деградации.

Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют небольшие векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами из переносимой Т-области, которая ограничена 24-нуклеотидными повторами.

Вместо онкогенов встраивают последовательности клонируемой чужеродной ДНК и селективный маркер. Наличие сайта инициации репликации E. coli в составе Ti-вектора позволяет проводить в кишечной палочке все стадии сборки генетической конструкции. В качестве селективного маркера используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые дают возможность отбирать трансформированные клетки растений. После введения целевой ДНК рекомбинантным Ti-вектором трансформируют клетки агробактерий, несущих модифицированную Ti-плазмиду-помощницу с удаленной Т-областью, но содержащую все необходимое для переноса в растительные клетки T-ДНК части с рекомбинантной плазмиды. Такие вектора получили название бинарных, поскольку только вместе с плазмидой-помощницей они составляют пару из двух элементов для полноценного функционирования системы переноса генов в растительную клетку с помощью агробактерий.

Генетически модифицированные растения получают простой инкубацией любых частей растения с суспензией рекомбинантных агробактерий. Во всех случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов (эухроматин).

Для внедрения больших фрагментов ДНК в клетки растений путем введения фланкирующих Т-область последовательностей из Ti-плазмиды в состав векторов для клонирования больших фрагментов ДНК получены соответствующие космидные векторы, а также векторы на основе искусственных бактериальных хромосом (ВАС), получившие название TAC (transformation-competent bacterial artificial chromosomes). ТАС-векторы могут быть реплицированы как в клетках Е. coli, так и агробактерий, что позволяет с помощью рекомбинантных агробактерий вводить в клетки растений фрагменты ДНК длиной более 150 тнп.

Другие векторы для конструирования трансгенных растений c прямым введением чужеродных генов в виде очищенной ДНК в растительные клетки также разработаны, поскольку эффективные системы переноса генов в растительный геном с помощью агробактерий работают не для всех видов растений. Эти векторы в основном предназначены для сборки эффективной экспрессионной генной конструкции в E. coli с последующим введением в растительную в клетку очищенной ДНК. Наиболее известные способы доставки рекомбинантной ДНК в растительные клетки приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1.Методы введения рекомбинантной ДНК в растительные клетки

Растительные векторы отличаются главным образом различными сигнальными и регуляторными последовательностями, которые обеспечивают эффективную транскрипцию генов в растительных тканях, и различными селективными маркерами. Наиболее важными из регуляторных последовательностей являются проксимальный участок промотора, связывающий РНК-полимеразу; участок, кодирующий 5'-конец мРНК, необходимый для связывания с рибосомой и инициации трансляции, и эукариотический сигнал полиаденилирования на З'-конце мРНК.

Среди эукариотических организмов эти конститутивные сигнальные элементы оказались, к счастью, высококонсервативными и достаточно универсальными, так что растительные клетки в основном правильно экспрессируют чужеродные гены не только растений других видов, но и млекопитающих, дрожжей и других эукариот.

Но для обеспечения достаточного уровня работы чужеродного гена необходимы сильные регуляторные и сигнальные элементы экспрессии, в которых ключевыми являются промоторы, хорошо работающие именно в клетке-мишени. Как и в других системах, для конструирования растительных векторов популярны элементы экспрессионной системы вирусов.

В настоящее время одним из наиболее широко используемых промоторов для двудольных является сильный конститутивный 35S-промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК, CaMV) из группы каулимовирусов. Также для двудольных широко используется nos-промотор гена нопалин-синтазы агробактерий, хотя он намного слабее 35S; для однодольных - промоторы гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (Adh) и гена актина 1 риса (Act).

Особенно нужны эффективные тканеспецифичные и индуцибельные промоторы для тканеспецифичной и/или индуцированной экспрессии трансгена. Экспрессия под сильными конститутивными промоторами, с одной стороны, приводит к большому количеству целевого белка, с другой - к синтезу этого белка во всех тканях растения, что может отрицательно сказаться на жизнеспособности и стабильности трансгенного растения и часто нежелательно для исследователей.

Векторы для трансформации хлоропластов высших растений (транспластомные векторы) относятся к интегративным векторам. Хлоропласты содержат полноценную генетическую систему, сходную с прокариотическими, т.е. все компоненты, необходимые для экспрессии генетической информации, включая белоксинтезирующий аппарат. Геном хлоропластов (пластом) размером 130-160 тнп заключает в себе более 100 различных генов. Векторы для трансформации хлоропластов предназначены для интеграции чужеродной ДНК в пластом с помощью гомологичной рекомбинации.

Представляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие кроме обычного векторного набора два участка длиной по 1 -2 тнп, гомологичные последовательностям ДНК хлоропластов, в которую и происходит встраивание. Экспрессионная кассета между этими гомологичными последовательностями состоит из 5'-некодирующей области с промотором, регулирующим транскрипцию (иногда включает последовательность лидерного пептида перед множественным клонирующим сайтом для целевой ДНК) и 3'-некодирующей регулятор-ной области с терминатором транскрипции, стабилизирующей структуру мРНК, что является одним из условий достижения высокого уровня экспрессии трансгена в хлоропластах.

Для получения эффективной транскрипции клонированного гена часто используют сильный Prrn-промотор оперона рибосомальных рРНК (rrn). В зависимости от размера хлопластной ДНК растения данная векторная система позволяет вводить в геном хлоропластов фрагменты ДНК длиной до 50 тнп, содержащие до 20-30 генов. В геноме хлоропластов описано, по крайней мере, около 20 сайтов, по которым удалось получить продуктивную интеграцию вектора.

Получение транспластомных растений, содержащих генетически измененные хлоропласты, является одним из перспективных направлений, поскольку хлоропласты не переносятся с пыльцой, а значит, устраняется опасность распространения трансгенов с пыльцой среди перекрестно опыляемых растений близких видов. Кроме того, сама пыльца трансгенных растений менее токсична для насекомых, которые не являются мишенью ее токсического воздействия у растений, синтезирующих инсектициды.

Для генома хлоропластов характерен высокий уровень полиплоидии -10-100 копий на хлоропласт. Учитывая большое число самих хлоропластов на клетку, каждая отдельная клетка с трансформированными хлоропластами содержит тысячи копий трансгена, что позволяет получать очень высокий уровень экспрессии соответствующих рекомбинантных белков (до 25 % от суммарного растворимого клеточного белка).

Заражение растительных тканей производят рекомбинантными вирусами, несущими в своем составе гены целевых белков. Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счет чего достигается высокая копийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме зараженных клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений. Иногда такую технологию применяют для масштабного коммерческого производства.

Для транзиентной продукции в растениях также используют векторы Ti-системы. При инфицировании целого растения или его части (листья) рекомбинантной Agrobacterium, содержащей целевой ген в составе бинарного вектора, уровень продукции чужеродного белка может достигать 10-30 % от общего растворимого белка растения в короткое время (5-10 дней). Такой способ также используется, когда требуется проверить сконструированную экспрессионную кассету перед получением стабильных трансформантов или разово наработать небольшое количество (порядка миллиграмма) рекомбинантного белка, например, для оценки его качества или доклинических испытаний.

Трансгенными могут называться те виды растений, в которых успешно функционирует ген (или гены) пересаженные из других видов растений или животных. Делается это для того, чтобы растение реципиент получило новые удобные для человека свойства, повышенную устойчивость к вирусам, к гербицидам, к вредителям и болезням растений. Пищевые продукты, полученные из таких генноизмененных культур, могут иметь улучшенные вкусовые качества, лучше выглядеть и дольше храниться. Также часто такие растения дают более богатый и стабильный урожай, чем их природные аналоги.

Последнее десятилетие ученые строят неутешительные прогнозы относительно быстрорастущего потребления сельскохозяйственных продуктов на фоне снижения площади посевных земель. Решение данной проблемы возможно с помощью технологий получения трансгенных растений, направленных на эффективную защиту сельскохозяйственных культур и увеличение урожайности.

Получение трансгенных растений является на данный момент одной из перспективных и наиболее развивающихся направлений агропроизводства. Существуют проблемы, которые не могут быть решены такими традиционными направлениями как селекция, кроме того, что на подобные разработки требуются годы, а иногда и десятилетия. Создание трансгенных растений, обладающих нужными свойствами, требует гораздо меньшего времени и позволяет получать растения с заданными хозяйственно ценными признаками, а также обладающих свойствами, не имеющими аналогов в природе. Примером последнего могут служить полученные методами генной инженерии сорта растений, обладающих повышенной устойчивостью к засухе.

Создание трансгенных растений в настоящее время развиваются по следующим направлениям:

Получение сортов с/х культур с более высокой урожайностью

Получение с/х культур, дающих несколько урожаев в год (например, в существуют ремантантные сорта клубники, дающие два урожая за лето)

Создание сортов с/х культур, токсичных для некоторых видов вредителей (например, ведутся разработки, направленные на получение сортов картофеля, листья которого являются остро токсичными для колорадского жука и его личинок).

Создание сортов с/х культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (например, были получены устойчивые к засухе трансгенные растения, имеющие в своем геноме ген скорпиона) .

Создание сортов растений, способных синтезировать некоторые белки животного происхождения (например, в Китае получен сорт табака синтезирующий лактоферрин человека).

Таким образом, создание трансгенных растений позволяет решить целый комплекс проблем, как агротехнических и продовольственных, так и технологических, фармакологических и т.д. Кроме того, уходят в небытие пестициды и другие виды ядохимикатов, которые нарушали естественный баланс в локальных экосистемах и наносили невосполнимый ущерб окружающей среде.

Обзор

Есть или не есть ГМО? В этом вопрос.

Автор

Редакторы

Немного истории

На самом деле, фермеры изменяли генетический аппарат растений уже тысячи лет. Интуитивно скрещивая друг с другом определенные растения с наилучшими свойствами, фермеры заметили, что эти свойства сохраняются в потомстве. Так зарождалась селекция. После того, как в начале XX века наука взяла на вооружение генетические законы Менделя, работа селекционеров значительно упростилась. А уже в конце 20-х годов ΧΧ века исследователи обнаружили, что можно улучшить нужные свойства растений с помощью мутаций. Количество мутаций можно было увеличить с помощью рентгеновских лучей и различных химикатов. В результате таких экспериментов было получено около двух десятков различных сортов растений для пищевых целей, и такие эксперименты продолжаются и сегодня [1]. Но данный метод дает довольно непредсказуемые результаты, ведь мутации спонтанны, и сложно предугадать, какая получится — полезная или нет.

Рисунок 1. Человек занимался модификацией растений еще с древних времен. Иначе откуда у нас столько сортов каждого овоща или фрукта?

Но уже в 1981 году Шелл и его команда создала первое трансгенное растение — новый сорт табака — с помощью методик генной инженерии. С тех пор многие лаборатории по всему миру пользуются этим методом, создавая новые трансгенные растения, благодаря которым может быть побежден голод и загрязнение планеты неумеренным использованием удобрений [2].

Генетически модифицированные растения — это растения, генотип (то есть, совокупность всех генов) которых был искусственно изменен с помощью генной инженерии. Генетическая модификация отличается целенаправленным изменением генотипа организма в отличие от случайного изменения, характерного для естественного и искусственного мутационного процесса [3].

Этапы создания генетически модифицированных растений

Получение изолированного гена. Мы получаем нужный ген либо путем химического синтеза из составляющих ДНК нуклеотидов (что очень долго и дорого, а потому обычно нецелесообразно), либо путем его выделения из клеток других организмов с помощью специальных методик.
Введение гена в вектор для переноса в организм. Вектор — структура, переносящая в клетку соответствующую генетическую информацию, в данном случае тот полезный ген, который был выделен в пункте 1. Обычно в виде векторов используют плазмиды или инактивированные оболочки вирусов. Для трансформации растений иногда также используют липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина.
Перенос вектора с геном в модифицируемый организм с помощью различных манипуляций. В зависимости от используемых клеток и векторов манипуляции могут быть самые разные — от простого капания вектора на необходимые клетки до обстрела клеток вектором из генной пушки.
Выращивание растений из модифицированных клеток.
Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Предположим, что создание трансгенного организма завершено (см. врезку), осталось посадить его и вырастить. Но нужно ли это делать?

Почему мы боимся трансгенных растений и оправдано ли это?

Применение трансгенных растений в сельском хозяйстве возбудило опасения и недовольство общества относительно их возможного влияния на дикую природу, здоровье человека и экологию. Например, дебаты разгорелись после публикации результатов лабораторных исследований, в которых пыльца трансгенной кукурузы убивает гусениц бабочки-монарха. Хотя вскоре после этого Агентство по охране окружающей среды США показало, что вероятность влияния кукурузы на личиночную стадию бабочки совершенно незначительна в естественных условиях или вовсе отсутствует из-за различных мест их обитания [5].

Или нашумевший эксперимент с крысами. Животных кормили трансгенной кукурузой, и у них стали появляться опухоли. Но исследователи использовали крыс линии Спраг Доули, которые в норме дают опухоли у 80% популяции. Эксперимент был опровергнут многими учеными, так как не была установлена зависимость от количества потребления кукурузы, не было контрольной линии крыс и возникало множество вопросов о правильности постановки эксперимента [6]. Но все же именно этот опыт с крысами дал достаточно сильный резонанс в обществе и подтолкнул общественность к резко негативному настрою против генно-модифицированных растений.

Рисунок 2. Крысы — одни из основных лабораторных животных. Есть множество линий этих грызунов, и многие из них отличаются серьезными особенностями физиологии. Поэтому при любом эксперименте важно правильно подбирать подопытных животных, а также проводить такое исследование, чтобы оно могло быть принято и учеными сообществом, и населением планеты.

Как трансгенные растения могут спасти экологию и людей от постоянного отравления?

ΧΧ век был веком торжества химии. Именно тогда активно применялись многие пестициды — вещества различной химической природы, используемые для защиты культурных растений от сорняков, вредителей и болезней, т.е. химические средства защиты растений. Однако для человека эти вещества могут быть вредны.

Несмотря на то, что используется много способов для очищения продуктов питания от пестицидов, они все равно так или иначе попадают на стол потребителя — через растения, которые впитали их с водой из почвы; через молоко или мясо коров и других животных, которые съели опрысканные химикатами растения; через воду, которая принесла в городскую систему водоснабжения пестициды с опрысканных полей. Пестициды будут присутствовать в продукте даже при интенсивной физической обработке, так как не разрушаются ни при высокой температуре, ни при консервации. Ни один производитель не напишет на упаковке, что в его продукте присутствуют пестициды, а они там всегда есть, хотя бы в очень малых количествах; за последние 10 лет уровень пестицидов в продуктах увеличился в 5 раз [5]. Впору задуматься. А ведь именно ненавистные многим генно-модифицированные растения могут спасти человека от ежедневного поедания химикатов.

Основной способ исключить использование пестицидов — это создать растения, устойчивые к насекомым-вредителям. Создание этой устойчивости включает в себя внедрение в генотип растения гена, отвечающего за синтез вещества, которое пагубно действует на насекомых. Были проведены исследования, которые доказали, что это вещество никак не действует на птиц, млекопитающих и человека, зато насекомые, пытающиеся съесть такое растение, погибают [4]. Именно этот способ борьбы с насекомыми спасает ежегодно многие гектары посевных площадей без вреда для окружающей среды, человека и животных.

Рисунок 3. Нерегулируемое распыление пестицидов на поле. Откуда вы знаете, что ветер или вода не занесет химикаты на ваш стол, в ваши форточки или в вашу питьевую воду?

Растения, которые спасают десятки тысяч жизней

Очень часто можно слышать или читать о вреде трансгенных растений, о подозрительных экспериментах, проводимых над животными, но почему-то обычно на второй план уходит одна из главных задач этих организмов, с которой они замечательно справляются — спасение от голода и нехватки жизненно важных питательных веществ жителей нашей планеты. Количество населения растет с каждым годом: нас уже больше 7 миллиардов [7], и традиционное сельское хозяйство не может прокормить такое количество народа. Вспомним трансгенные растения, благодаря которым удалось спасти миллионы жизней.

Рисунок 4. Обыкновенный (слева) и золотой (справа) рис. Первый шаг к спасению от мирового голода и дефицита незаменимых веществ.

Опасны ли трансгенные растения для человека и экосистемы?

Каждый интересующийся темой трансгенных растений слышал ужасающую историю о том, что части их ДНК могут встраиваться в человеческие хромосомы и вызывать невероятные, опасные для жизни мутации. Вряд ли сейчас кто-либо может дать ответ, где и когда появилась эта идея, но разъяснить ее необходимо.

Рисунок 5. Строение ДНК — от хромосомы до нуклеотида. Строение ДНК одинаково у всех организмов независимо от их вида, происхождения или модификации. А пищеварительная система человека устроена именно так, чтобы разбить любую попадающую в нее ДНК на ее составляющие — нуклеотиды.

Первой проблемой обеспокоено много ученых, ведь, на первый взгляд, все трансгенные растения приспособленнее своих диких собратьев. Но на деле это те же культурные сорта растений, которым необходим уход и забота со стороны человека, иначе их вытеснят сорняки [10]. Да, проблема является до сих пор открытой и вызывает множество споров; однако заметим, что за тридцатилетнюю историю культивирования трансгенных растений ни одно из них еще не встречалось в дикой природе.

Делая обзор о проблемах генно-модифицированных растений, всегда необходимо упоминать об экологических проблемах, о рисках влияния на окружающую среду. Но вряд ли риски генно-модифицированных растений сравнятся с рисками выбросов химических соединений, используемых при традиционном культивировании растений, в атмосферу и воду.

Какое будущее нас ждет?

Население нашей планеты неуклонно растет, а каждый новый человек требует ресурсов для жизни. Традиционное сельское хозяйство, в частности растениеводство, не может удовлетворить потребности всех людей, и поэтому его приходится совершенствовать. Новое всегда пугает и вызывает опасения. В начале развития компьютеров человечество боялось их; так и теперь боится новых, непонятных достижений генной инженерии. Общество подозрительно, люди хотят знать, что они едят. И это правильно, но отказываться от новых способов прокормить миллиарды человек было бы совершенно неразумно, особенно если учесть тот факт, что на данный момент это единственное разрешение проблемы голода и недостатка важнейших питательных веществ для людей во всем мире. Главное — не бояться видеть в новом положительное, узнавать о нем все, что можно узнать, и делать выводы на достоверных фактах. Тогда мы сможем спастись от множества заблуждений.

Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.

Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения

Успехи в области генетической инженерии растений открыли новые возможности для получения рекомбинантных белков. Для этой цели широко используются клетки бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако такие системы имеют ряд существенных недостатков. В клетках прокариот не происходят посттрансля-ционная модификация и правильная укладка (фолдинг) полипептидных цепей многих эукариотических белков. Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых лишены подобных недостатков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков (Russel, Clarke, 1999).

По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения имеют ряд особенностей и преиму-ществ. Прежде всего необходимо отметить, что в клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует доро-гостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность реком-бинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и широкого терапевтического использования. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своём составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных белков медицинского назначения. Хотя стоимость выделения и очистки целевого белка из растений-продуцентов может быть сопоставима с таковой для других систем, наработка сырого материала обходится значительно дешевле. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве "съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется. В дополнение ко всему перенос фраг-ментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходят значительно проще по сравнению с животными (Daniell et al., 2001).

Известно, что аппарат транскрипции и трансляции у растений является универсальным и может быть адап-тирован не только для накопления гомологичных белков, не синтезируемых данным видом растения, но и для синтеза гетерологичных белков как бактериального, так и животного происхождения. С другой стороны, сами растения in vivo могут служить благоприятной средой для развития различных организмов - бактерий и вирусов, геном которых может быть модифицирован и адаптирован для синтеза соответствующих гетерологич-ных белков. Анализируя данные литературы, необходимо отметить, что поиск различных систем для экспрессии чужеродных генов за последние десять лет был связан с развитием трёх основных подходов.

Первым из них был предложен путь использования трансгенных растений, в ядерный геном которых перене-сены гены, контролирующие синтез соответствующих гетерологичных белков (De la Riva, 1998). Получение таких растений было основано на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Именно эта часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных конструкций, включающих различные целевые гены. В качестве целевых можно было использовать и гены гетерологичных белков меди-цинского назначения. Необходимо отметить, что использование только агробактериального переноса в значи-тельной степени сужало круг растений-реципиентов и ограничивало его, как правило, до двудольных. Поэтому дальнейшее развитие идеи использования растительного генома для синтеза гетерологичных белков стимули-ровало поиск новых способов переноса фрагментов экзогенной ДНК в геном растений. Были разработаны мето-ды прямой доставки чужеродных генов в растительный геном, такие, как микроинъекции (Neuhaus et al. , 1987), электропорация (Fromm et al. , 1985) и методы биобаллистики (Klein et al. , 1987). В этом слу-чае для переноса использовалась очищенная плазмидная ДНК, в которой содержались генетические конструк-ции с целевыми генами.

При переносе в геном растения чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются и передаются по-томкам в последующих поколениях согласно законам Менделя (Horsch et al., 1984; Budar et al. , 1986; De-roles, Gardner, 1988; Heberle-Bors et al. , 1988).

Хотя идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них не-обходимо отметить низкий уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных промоторов. Содержание сывороточного альбумина человека в трансгенных тканях табака составило 0,02 % от суммарного белка (Sijmons et al. , 1990). Ещё меньшие значения были получены для эритропоэтина (0,003 %) и b -интерферона (0,001 %) (Edelbaum, 1992; Kusnadi et al. , 1997). Одной из причин этого, по-видимому, является увеличение скорости деградации мРНК чужеродно-го гена, когда её уровень достигает порогового значения. Этот механизм, возможно, служит одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов (Matzke et al. , 1994; Matzke M., Matzke A., 1995; Vaucheret, 2001). Второй причиной низкого уровня продукции является протеолиз чужеродных белков в цитоплазме расти-тельной клетки. Введение в полипептидную цепь целевого белка сигнальных последовательностей, направляю-щих его накопление в эндоплазматической сети или секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже, позволяет достичь повышения продуктивности трансгенных растений в 100 раз (Giddings et al. , 2000; Menassa et al. , 2001). Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уровень биодеградации ниже, чем в обводнённых тканях (листья, плоды), способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Так, содер-жание химерного энкефалина человека в семенах трансгенного A. thaliana составило 2,9 % от суммарного белка. Этого удалось достичь введением в полипептидную цепь энкефалина сигнальной последовательности глю-телина (запасного белка риса), направляющей его транспортировку в компартменты накопления запасных белков. Химерный ген находился под контролем промотора гена глютелина, который направлял его тканеспецифичную транскрипцию в клетках запасной ткани семян (Vandekerckhove et al. , 1989).

Интеграция чужеродных генов в ядерный геном растения сопряжена и с рядом проблем биобезопасности использования генетически модифицированных организмов. При получении трансгенных растений в сель-скохозяйственных масштабах существует опасность утечки трансгена в окружающую среду (выход из-под контроля) в результате переопыления с близкородственными дикорастущими видами. Для повышения уров-ня биобезопасности рядом исследователей было предложено использовать для трансгенеза стерильные по мужской линии растения (Menassa et al. , 2001).

Другой проблемой, возникающей при интеграции гетерологичных генов в ядерный геном растений, явля-ется вероятность "замолкания" трансгенов в последующих поколениях (сайленсинг). Вероятность сайлен-синга резко возрастает при встраивании множества копий чужеродного гена на геном растения (Finnegan, McElroy, 1994; Matzke et al. , 1994; Matzke М., Matzke А., 1995). Поэтому при создании трансгенных растений-биопродуцентов рекомбинантных белков среди трансформантов отбирают растения, содержащие только одну встройку чужеродного гена.

В связи с вышеперечисленными проблемами, возникающими при интеграции трансгенов в ядерный ге-ном, весьма привлекательным представляется способ переноса экзогенной ДНК в геном хлоропластов. Хлоропласты - органеллы растительной клетки, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, а также ряд дру-гих пигментов, принимающих участие в поглощении световой энергии и осуществлении фотохимических реак-ций. По форме и размерам хлоропласты высших растений достаточно однородны. Некоторая вариабельность наблюдается в отношении их числа в расчете на одну клетку, которое варьирует от нескольких десятков до сот-ни и более. Каждый отдельный хлоропласт окружен двойной мембраной и имеет сложную внутреннюю структу-ру. В одной растительной клетке в среднем содержится от 5 до 10 тыс. копий хлоропластной ДНК, за счёт чего уровень экспрессии чужеродных белков достигает значений, сравнимых с уровнем экспрессии в E. coli (до 40 % от суммарного белка клетки) (Staub et al. , 2000; De Cosa et al. , 2001). Однако в литературе встречаются только единичные работы по получению растений с генетически модифицированными хлоропла-стами. Это связано с чрезвычайной сложностью методов их трансформации и последующего отбора.

Третий путь использования растений для накопления белков гетерологичного происхождения основан на природной способности растительных вирусов проникать в клетки растений и колонизировать растительные тка-ни (Mushegian, Shepherd, 1995). На этой основе возникает реальная возможность модификации вирусного гено-ма и адаптации его не только в качестве вектора для доставки в растения соответствующих генетических конст-рукций, но и в качестве матриц для транзиентной экспрессии генов, кодирующих синтез белков, представляющих коммерческий интерес. Для заражения растительных тканей используются рекомбинантные (+)РНК-содержащие вирусы растений, несущие в составе своего генома транскрипт чужеродного гена (Mushegian, Shepherd, 1995). Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счёт чего достигается высокая ко-пийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме заражённых клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений (Giddings et al. , 2000).

В настоящее время широко используются два вида вирусов для продукции чужеродных белков в растениях: ви-рус табачной мозаики (ВТМ) и вирус мозаики коровьего гороха (ВМКГ). Вектор на основе РНК ВТМ использовался для получения ингибитора репликации ВИЧ α -трихосантина в Nicotiana benthamiana (Kumagai et al. , 1993). Для этого целевую последовательность, кодирующую α -трихосантин, поместили под субгеномный промотор белка оболочки ВТМ. Спустя две недели после заражения рекомбинантный α -трихосантин накапливался в листьях N. Benthamianaв количестве 2 % от суммарного белка. На основе ВМКГ удалось получить химерные частицы этого вируса с экспонированными на поверхности антигенными детерминантами ВИЧ1 (gp41) (Porta et al. , 1996). Для этого последовательность эпитопа gp41 была "сшита" с геном белка оболочки ВМКГ. Такие частицы обладали высокой иммунногенностью и были способны нейтрализовать инфекционные свойства ВИЧ1 in vivo.

Сравнивая пути наработки гетерологичных белков в растительных тканях, необходимо отметить, что каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. В трансгенных растениях перенесенные гены стабильно встраиваются в геном и сохраняются в последующих поколениях, тогда как при интеграции генов в геном вирусов в зараженных вирусами растениях обеспечивается их временная (транзиентная) экспрессия. Накопление соответствующих бел-ковых продуктов будет определяться периодом вегетации зараженного растения-хозяина. С другой стороны, пре-имуществом вирусного пути накопления белков в растениях является короткий период размножения вирусных час-тиц, простота инфицирования растений, а также широкий диапазон различных видов растений, которые могли бы быть использованы для этих целей.

Цель иммунизации организма вакцинами - индуцировать продукцию антител на патогенный агент. Альтерна-тивой такому подходу является метод пассивной иммунизации, основанный на введении готовых иммуноглобу-линов. Широкое применение такого подхода долгое время было ограничено высокой стоимостью антител, полу-чаемых традиционными способами. В 1989 г. была показана возможность сборки функционально активных им-муноглобулинов класса IgG и IgA из лёгкой и тяжёлой цепей в растениях табака (Hiatt et al. , 1989). С того момента в нескольких крупных лабораториях мира были получены трансгенные растения-продуценты различных типов антител к эпитопам ряда патогенных агентов. В таблице 1 представлена сводка этих результатов.

Читайте также: