Получение первичных метаболитов реферат

Обновлено: 16.05.2024

1. Классификация продуктов биотехнологии и потребности в первичных метаболитах.

2. Промышленное производство аминокислот.

2.1. Микроорганизмы – продуценты аминокислот.

2.2. Производство лизина.

2.3. Получение глутаминовой к-ты, аргинина, глутамина, треонина, пролина.

2.4. Производство триптофана в промышленных масштабах.

2.5. Получение аминокислот химико-ферментативным способом.

Определение понятия

Аминокислоты - это органические соединения, содержащие одновременно щелочную аминную группу (NH2-) и кислотную карбоксильную (СООН-).

Отсюда и их название: Амино-Кислоты. Важным свойством аминокислот является их способность к поликонденсации и образованию полимеров в виде полиамидов, в том числе пептидов, белков, нейлона, капрона, энанта. Из определённого класса аминокислот (альфа-аминокислоты) собираются молекулы природных белков.

По объему производства среди соединений, производимых биотехнологическими способами, аминокислоты стоят на первом месте, а по стоимости – на втором, уступая в этом только антибиотикам.

Объем мирового производства аминокислот составляет более 500 тыс. т. в год. Из них – 300 тыс. т. – глутамат натрия, 100 тыс. т. – лизин, 140 тыс. т. – метионин. Однако эти объемы – лишь небольшая часть требуемого.

По данным ВОЗ мировая потребность в наиболее востребованных аминокислотах составляет:

1. Лизин - 5 млн. т.

2. Метионин - 4 млн.т.

3. Треонин - 3,7 млн.т.

4. Триптофан - 2 млн. т.

Об аминокислотах как структурной единице белков

Незаменимые аминокислоты (для человека):

Недостаток каждой из них в пищевом рационе приводит к нарушению обмена, замедлению роста и развития.

Пищевая ценность белка определяется долей незаменимых аминокислот в пище при сравнении с таким же показателем при адекватном питании. Наиболее сопоставимыми с идеалом являются белки молока и яиц.

Белки растительного происхождения характеризуются дефицитом некоторых незаменимых аминокислот. Так, белки пшеницы и риса обеднены лизином и треонином, а белки кукурузы – лизином и триптофаном.

Введение незаменимых аминокислот в кормовые концентраты позволяет сбалансировать корма сельскохоз. животных. Добавление в рацион 3-4 дефицитных аминокислот к 1 т комбикорма приводит к уменьшению общего расхода кормов на 15-20%. Выход продукции при этом увеличивается на 20%.Таким образом, обогащение кормов незаменимыми аминокислотами очень выгодно.

Помимо применения в качестве пищевых добавок, биодобавок (БАДов), приправ и усилителей вкуса аминокислоты используются как сырье в химической, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве других веществ:

- глицин - как подсластитель, антиоксидант, бактеориостатик,

- аспарагиновая кислота – усилитель вкуса, сырье для синтеза аспартама (подсластителя),

- гистидин – противовоспалительное средство,

- глутаминовая кислота - усилитель вкуса, препарат для лечения психических заболеваний,

- метионин – пищевая и кормовая добавка,

- треонинин триптофан - пищевая и кормовая добавка,

- триптофан - пищевая и кормовая добавка,

- цистеин – фармацевтический препарат,

- фенилаланин – сырье для получения аспартама,

- лизин – пищевая и кормовая добавка, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1. Гидролизом природного белковосодержащего сырья.

2. Химическим синтезо.

3. Микробиологическим синтезом.

4. Биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

При гидролизе отходы пищевой и молочной промышленности нагревают с растворами кислот или щелочей при 100-105 С в течение 20-48 час. Чаще всего используют 20% р-р соляной к-ты, обеспечивающий глубокий гидролиз белка. Лучшим способом уменьшения потерь белка при гидролизе является проведение его в вакууме или в атмосфере инертного газа, а также соблюдение высокого соотношения количества к-ты, взятой для гидролиза и массы белка (200:1). Раньше методом гидролиза получали аминокислоты исключительно для фармацевтических и научных целей. Сейчас сфера использования белковых гидролизатов существенно расширилась. Их применяют в медицине, животноводстве, пищевой и микробиологической промышленности.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот. Более 60% всех производимых в настоящее время высокоочищенных препаратов аминокислот получают этим способом. Главное преимущество которого состоит в возможности получения аминокислот на основе возобновляемого сырья. Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности некоторых микроорганизмов выделять в культуральную среду значительных кол-в какой-либо одной аминокислоты. При этом было подмечено, что продуктивные штаммы можно улучшать посредством селекции мутантов с измененной генетической программой. Это роды Brevibacterium, Micrococcus, Corinebacterium, Arthrobacter.

Производство лизина

Для культивироания штаммов микроорганизмов при производстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы – глюкоза, сахароза, реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторичное сырье – свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. В качестве источников азота применяют мочевину, соли аммония (сульфаты и фосфаты). Для успешного роста микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрожжей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, витамины группы В. В питательную среду добавляют некоторые макро- и микроэлементы: P, Ca, Mg, Mn, Fe и др. На процессы биосинтеза существенное влияние оказывает аэрация, при этом степень снабжения воздухом индивидуальная для каждой конкретной аминокислоты.

Среди соединений, получаемых биотехнологическими метода­ми, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот со­ставляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится на глутамат натрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин. Одна­ко указанный объем — лишь небольшая доля от требуемого коли­чества аминокислот. По данным ВОЗ, потребность человечества всего лишь в четырех незаменимых аминокислотах составляет, млн т: для лизина — 5, метионина — 4, треонина — 3,7 и триптофана — 2.

Аминокислоты — структурные единицы белков. Природные ами­нокислоты вовлечены в биосинтез ферментов, ряда гормонов, витаминов, антибиотиков, алкалоидов, токсинов и других азот­содержащих соединений (пурины, пиримидины, гем и пр.). В орга­низме животного практически половина белковых аминокислот не синтезируется. Они называются незаменимыми аминокислотами и должны поступать в организм с пищей. Недостаток каждой из с этих аминокислот в пищевом или кормовом рационе приводит к нарушению обмена веществ, замедлению роста и развития. Сведе­ния о ежедневной потребности человека в незаменимых амино­кислотах представлены в табл. 3.2.

Таблица 3.3. Потребность ряда сельскохозяйственных животных в незаменимых аминокислотах ( % к сырому протеину)

Аминокислота Свиноматки Куры-несушки Коровы
Лизин 5,0 5,0 4,5
Метионин 3,2 3,6 1,7
Триптофан 1,2 1,2 —
Треонин 6,0 4,0 3,4

Пищевая ценность белка определяется сравнением доли неза­менимых аминокислот в пище с этим же показателем при адекватном питании. Чем ближе обе величины, тем выше качество белка. 5епки яйца и молока обладают высокой пищевой ценностью и используются в качестве эталона при оценке других белков. Многие белки растительного происхождения характеризуются дефи­цитом некоторых незаменимых аминокислот. Так, белки пшени­цы и риса обеднены лизином и треонином, а белки кукурузы — пизином и триптофаном.

Введение синтетических незаменимых аминокислот в кормо­вые концентраты позволяет балансировать корма сельскохозяй­ственных животных по уровню белка. При добавлении 2 —4 дефи­цитных аминокислот к 1 т комбикорма общий расход кормов уменьшается на 15 — 20 %, выход продукции увеличивается на 20 %. Добавление к кормам аминокислот способствует переводу живот­новодства на промышленную основу. Данные о потребности не­которых сельскохозяйственных животных в незаменимых амино­кислотах приведены в табл. 3.3.


Помимо применения в качестве пищевых добавок, приправ и усилителей вкуса аминокислоты используют как сырье в хими­ческой, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве ряда других веществ:

глицин — подсластитель, антиоксидант, бактериостатик;

аспарагиновая кислота — усилитель вкуса, сырье для синтеза асгтартама;

глутаминовая кислота — усилитель вкуса, препарат для лече­ния психических заболеваний;

гистидин — противовоспалительное средство;

метионин — пищевая и кормовая добавки;

цистеин — фармацевтический препарат;

треонин и триптофан — пищевые и кормовые добавки;

фенилаланин — сырье для получения аспартама;

лизин — пищевая и кормовая добавки, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

  1. гидролизом природного белоксодержащего сырья;
  2. химическим синтезом;
  3. микробиологическим синтезом;
  4. биотрансформацией предшественников аминокислот с по­мощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (хи­мико-микробиологический метод).

При гидролизе белоксодержащее сырье (отходы пищевой и молоч­ной промышленности) нагревают с растворами кислот или щело­чей при температуре 100 —105 °С в течение 20—48 ч. Чаще всего используют 20 %-й раствор соляной кислоты, обеспечивающий глу­бокий гидролиз белка. Кроме того, для ускорения реакции гидро­лиза белков используют иммобилизованные протеолитические фер­менты и ионообменные смолы. В ходе кислотного гидролиза белков происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их аминокислот. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10—30%). Лучшим способом уменьшения потерь аминокислот при гидролизе является проведение его в вакууме или в атмосфере инертного газа, а также соблюдение высокого соотно­шения количества кислоты, взятой для гидролиза, и массы белка (200:1). Рациональное использование сырья при гидролизе, харак­терное для многих других биотехнологических производств, обес­печивает создание безотходных технологий и способствует оздо­ровлению окружающей среды. Ранее методом гидролиза получали аминокислоты исключительно для фармацевтических и научных це­лей. В последнее время сфера использования белковых гидролизатов существенно расширилась. Их применяют в медицине, живот­новодстве, пищевой и микробиологической промышленности.

Существенный недостаток методов химического синтеза ами­нокислот состоит в получении целевых препаратов в виде раце­мической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее боль­шинство природных аминокислот относится к L-ряду. D-a-аминокислоты обнаружены лишь в составе гликопротеинов клеточ­ных стенок бактерий, антибиотиков и некоторых токсинов. Проницаемость L-аминокислот в клетке в 500 раз превышает таковую ее антипода. Стереоспецифичны также транспорт и метаболизм аминокислот. Исключением в этом отношении является лишь ме­тионин, метаболизм которого нестереоизбирателен, благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем хими­ческого синтеза. Разделение рацематов других аминокислот — до­рогая и чрезвычайно трудоемкая процедура.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиоло­гический синтез аминокислот. Более 60 % всех производимых в настоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главное преимущество которого в сравнении с методами химического синтеза состоит в возможности получения L-аминокислот на основ возобновляемого сырья.

В последние годы при производстве аминокислот все шире ис­пользуют биотрансформацию предшественников аминокислот, особенно с помощью иммобилизованных ферментов или клеток микроорганизмов, предварительно получаемых химическим путем.

Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности у некоторых микроорганизмов вы­делять в культуральную среду значительные количества какой-либо одной аминокислоты (С. Киносита, 1955). При этом было подме­чено, что большинство из нескольких тысяч проанализированных диких штаммов микроорганизмов продуцировали аминокислоты во внешнюю среду, но в очень незначительных количествах. Не зафиксировано никакой связи между таксономическим положе­нием микроорганизма и способностью к продуцированию той или иной аминокислоты. Так, среди возможных продуцентов глутаминовой кислоты отмечены организмы, из которых 30 % — дрожжи, 30% — стрептомицеты, 20% — бактерии и 10% — микроскопи­ческие грибы. И лишь один из обследованных штаммов микроорга­низмов — Corynebacterium glutamicum был способен к сверхсинтезу глутамата. Этот штамм использовали при организации первого в мире крупномасштабного производства глутаминовой кислоты микробиологическим методом в Токио (1956). В России изыскания в области промышленного синтеза аминокислот были начаты в 50-х годах прошлого столетия по инициативе акад. А. А. Александрова.

Таблица 3.4 Микроорганизмы ― продуценты аминокислот (по Н. Б. Градовой и О. А. Решетник, 1987)


Перспективные штаммы продуцентов постоянно улучшают по­средством селекции мутантов с измененной генетической про­граммой и регуляторными свойствами. Распространенные объек­ты селекции продуцентов — микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Arthrobacter (табл. 3.4).

Разработка технологической схемы получения отдельной ами­нокислоты полностью базируется на знании путей и механизмов регуляции биосинтеза конкретной аминокислоты. Необходимого дисбаланса метаболизма, обеспечивающего сверхсинтез целевого продукта, добиваются путем строго контролируемых изменений состава и условий среды.

Микробиологические методы производства аминокислот

Производство лизина. По содержанию лизина наименее сбаланси­рованы белки злаковых культур, у которых его дефицит составляет от 20 до 50 %. На территории России недостаток лизина в кормах не может быть восполнен за счет сои, поэтому в нашей стране произ­водство этой аминокислоты было организовано первым. Для удовле­творения потребностей животноводства в лизине крупнотоннаж­ное производство налажено в Испании, Франции, Японии и США.

В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного ме­таболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот — лизина, метионина и треонина (рис. 3.3).

Таким образом, в процессе новообразования аминокислот из об­щего предшественника одновременно с лизином возникают две дру­гие аминокислоты — метионин и треонин. В этом случае эффекта накопления в среде всего одной целевой аминокислоты добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных амино­кислот, возникающих в связи с разветвлением метаболического пути.

Образование лизина в клетке бактерии находится под строгим метаболическим контролем. У типичных продуцентов L-лизина — Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum — фермент аспартаткиназа, открывающий метаболический путь, является аллостерическим белком, чувствительным к ингибированию по прин­ципу обратной связи при совместном и согласованном действие побочных продуктов L-треонина и L-лизина. При накоплении треонина и лизина в избыточной концентрации ингибируется аспартаткиназа и их синтез останавливается, при пониженной концен­трации любой из двух аминокислот процесс активизируется.


Чтобы добиться образования лизина в больших количества: получают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезруется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результа­те чего блокируется синтез метионина и треонина. Такие мутанты являются ауксотрофами по гомосерину или треонину (метионину); внутриклеточная концентрация треонина у них существенно сни­жена, что снимает блокаду с аспартаткиназы. Поэтому при выра­щивании мутантных штаммов в среде, где присутствуют лимити­рующие концентрации метионина и треонина, они способны об­разовывать избыточные количества лизина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминирующему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора — лизина.

Важный фактор, обеспечивающий в культуральной среде вы­сокие концентрации аминокислоты, синтезированной внутри клетки, — проницаемость клеточных мембран. Проницаемость кле­точной мембраны увеличивают либо с помощью мутаций, либо путем изменения состава питательной среды. В последнем случае в культуральной среде создают дефицит биотина (1 — 5 мкл/л), до­бавляют пенициллин (2 — 4 мкг/л), детергенты (твин-40 и твин- 60) или производные высших жирных кислот (пальмитаты, стеараты). Биотин контролирует содержание в клеточной мембране фосфолипидов, а пенициллин нарушает биосинтез клеточных сте­нок бактерий, что повышает выделение аминокислот в среду.

Для культивирования штаммов микроорганизмов при произ­водстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы — глюкоза, сахароза и реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторичное сырье: свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щело­ка. Технология этого процесса совершенствуется в направлении разработки дешевых синтетических питательных сред на основе уксусной кислоты (до 1,5%), пропионовой кислоты, метанола, этанола (до 1 %) и н-парафинов. В качестве источников азота при­меняют мочевину и соли аммония (сульфаты и фосфаты).

Для ус­пешного развития микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрож­жей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, вита­мины группы В. Кроме того, в питательную среду добавляют не­обходимые для жизнедеятельности макро- и микроэлементы (Р, Са, Mg, Мп, Feи др.). На процесс биосинтеза аминокислот суще­ственное влияние оказывает снабжение воздухом, при этом сте­пень аэрации индивидуальна для производства каждой конкрет­ной аминокислоты. Стерильный воздух подается специальными тур­бинными мешалками (рис. 3.4). Опыты показали, что лизин появ­ляется в культуральной среде начиная с середины экспоненци­альной фазы роста культуры клеток микроорганизма и достигает максимума к ее концу. Поэтому на первой стадии технологического процесса формируют биомассу продуцента, которую выращивают в специальных посевных аппаратах в течение суток (рН 7,0 — 7,2; температура 28 — 30 °С), а затем подают в производственный фер­ментер, заполненный питательной средой. Лизин начинает посту­пать в культуральную жидкость через 25 — 30 ч после начала фермен­тации. По завершении процесса ферментации (через 55 — 72 ч) жидкую фазу отделяют от культуры клеток микроорганизма филь­трованием и используют для выделения из нее лизина.

Высокоочищенные препараты лизина получают после фрак­ционирования фильтрата культуральной жидкости методом ионо­обменной хроматографии на катеоните. С этой целью лизин пере­водят в форму катиона:


Для данного процесса фильтрат обрабатывают соляной кисло­той до рН 1,6—2,0 (рН








Биотехнологические производства основаны на использовании жизнедеятельности микроорганизмов. Чтобы управлять микробиологическим процессом, необходимо знать физиологию применяемых культур микроорганизмов. Это позволит контролировать процессы, протекающие в клетке, условия культивирования и влияние основных факторов окружающей среды на направленный биосинтез.

Продуктами биотехнологических производств являются природные макромолекулы – белки, ферменты, полисахариды, полиэфиры, выделенные из клеток микроорганизмов, тканей и органов растений и животных.



где 1 – биомасса; 2 – продукт

Рисунок 2 – Динамика изменения биомассы и образования

первичных (А) и вторичных (Б) метаболитов в процессе роста

По отношению к процессам роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные метаболиты.

Первичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения (молекулярная масса менее 1500 Да), необходимые для роста микроорганизмов. Одни из них являются строительными блоками макромолекул, другие участвуют в синтезе коферментов. Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, растворители и витамины.

Вторичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре. Ко вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины.

4.2 Общая схема биотехнологического производства продуктов

микробного синтеза

Процессы биотехнологических производств разнообразны, но все они имеют пять основных стадий:

1) приготовление питательной среды;

2) подготовка посевного материала;

3) культивирование микроорганизмов;

4) выделение целевого продукта;

5) очистка целевого продукта.

Принципиальная биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза показана на рисунке 3.

Приготовление питательных сред. Среда должна отвечать двум основным требованиям. Во-первых, она должна быть полноценной для питания и недорогой. Углерод и азот в усвояемой форме требуются для биосинтеза белка; фосфор необходим для синтеза ДНК и АТФ; микроэлементы требуются для образования ферментов, также для нормальной жизнедеятельности нужны факторы роста и витамины. Во-вторых, среда должна быть стерильной, что достигается температурной, ультрафиолетовой, ультразвуковой и другими видами обработки.

П
олучение посевного материала (инокулята) проводится по следующей схеме:

Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.

Р
исунок 3 – Принципиальная биотехнологическая схема

производства продуктов микробного синтеза

Культивирование (ферментация) представляет собой совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную питательную среду посевного материала до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпания питательных веществ среды. Существует два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение метаболитов.

4.3 Биотехнология получения первичных метаболитов

4.3.1 Производство аминокислот

В промышленности аминокислоты получают:

1) гидролизом природного белоксодержащего сырья;

2) химическим синтезом;

3) микробиологическим синтезом;

4) биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

Для гидролиза могут быть использованы отходы мясоперерабатывающей промышленности (отходы обработки животного сырья, кровь и т.д.), яичный белок, казеин молока, клейковина пшеницы, соевый шрот и т.д. При гидролизе белоксодержащее сырье нагревают с растворами кислот и щелочей, при температуре от 100 до 105 ºС в течение 20…48 часов. При этом аминокислоты переходят в гидролизат, и для выделения отдельных аминокислот необходима сложная многостадийная очистка. Кроме того, само сырье считается дефицитным и дорогим, поэтому аминокислоты имеют высокую себестоимость. Кроме того, может разрушиться часть аминокислот, таких как триптофан, цистеин, метионин, тирозин, а также происходит рацемизация.

Химический синтез аминокислот достаточно эффективен, однако его недостатком является то, что в процессе синтеза образуется смесь из биологически активной L-формы и D-изомера аминокислоты. D-форма является балластом, так как не усваивается животными и человеком, а некоторые D-формы аминокислот обладают токсическими свойствами. Разделение изомеров – дорогая и трудоемкая процедура. Синтетически производится незаменимая аминокислота метионин.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот; 60 % высокоочищенных препаратов аминокислот получают именно этим способом. Преимущество его состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.

В последние годы широко используется биотрансформация предшественников аминокислот, полученных химическим синтезом с помощью клеток микроорганизмов или иммобилизированных ферментов.

Среди продуцентов аминокислот используются дрожжи (30 %), актиномицеты (30 %), бактерии (20 %).

Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum более трети сахаров превращают в лизин.

Для селекции продуцентов используются микроорганизмы, относящиеся к родам Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter.

Глутаминовая кислота – первая аминокислота, полученная микробным синтезом. Глутаминовая кислота относится к заменимым кислотам, обладает приятными органолептическими свойствами и находит самое широкое применение. Ее продуцентами являются бактерии Corinebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum и др.

Лизин образуют многие микроорганизмы: бактерии, актиномицеты, сине-зеленые водоросли, некоторые виды микроскопических грибов. В нашей стране в качестве продуцентов лизина используют бактерии родов Corinebacterium (С. glutamicum), Micrococcus, Brevibacterium.

Триптофан образуют микроорганизмы бактериального и грибного происхождения: родов Micrococcus sp., Candida utilis, Bacillus subtilis.

Основными потребителями аминокислот являются сельское хозяйство и пищевая промышленность. Аминокислоты, чаще всего лизин, используют в качестве обогатителей кормов и пищевых продуктов растительного происхождения для повышения их питательной ценности и для сбалансирования пищи по незаменимым аминокислотам. Использование 1 т лизина в комбикормовой промышленности позволяет экономить от 40 до 50 т фуражного зерна.

Некоторые аминокислоты используют в качестве приправ, так как они обладают определенными вкусовыми свойствами и могут сообщать продукту приятные аромат и вкус. Большое распространение имеет глутаминовая кислота и ее натриевая соль (глутамат натрия), которая является эффективным усилителем вкуса мясных и овощных блюд. Данную аминокислоту добавляют во многие продукты при консервировании, замораживании и длительном хранении.

Для улучшения органолептических показателей мясных продуктов, придания им специфического приятного вкуса и аромата используют цистин, лизин, гистидин. Цистеин и цистин с глутаматом натрия создают имитацию запаха и вкуса мяса, что используется при приготовлении приправ.

Многие аминокислоты: лизин, аланин, пролин, валин и другие могут снимать неприятные запахи и используются в качестве дезодорантов пищевых продуктов.

Особый интерес представляет подсластитель аспартам, молекулу которого образуют две аминокислоты – фенилаланин и аспарагиновая кислота. Эти аминокислоты синтезируются микробиологическим путем, а аспартам из этих мономеров – с помощью ферментов. Сладость аспартама в 200 раз превышает сладость сахарозы.

^ 4.3.2 Производство витаминов

Витамины представляют собой группу незаменимых органических соединений различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Витамины не образуются у гетеротрофов. Способностью к синтезу витаминов обладают лишь автотрофные организмы.

Микробиологическим способом можно получить практически все известные витамины. Однако экономически более целесообразно получать витамины выделением из природных источников или с помощью химического синтеза. С помощью микроорганизмов целесообразно получать сложные по строению витамины: β-каротин (провитамин А), В2, В12 и предшественники витамина D.

Витамин В12 (цианокобаламин). В тканях животных концентрация витамина очень низкая (в печени быка 1 мг/кг) для того, чтобы использовать этот источник для промышленных целей. Химический синтез очень сложен. Синтезировать витамин В12 способны уксуснокислые бактерии, грибы и пропионовокислые бактерии. Наибольшее промышленное значение имеют Рго-pionibacterium и Pseudomonas (P. denitrificans).

Концентрат витамина B12 предназначен для обогащения кормов животных. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином B12 используют пропионовокислые бактерии, как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке.

Витамин В2 (рибофлавин) можно в небольших количествах выделять из природного сырья. В наибольшем количестве он содержится в моркови и печени трески. Наиболее активными продуцентами витамина B2 являются дрожжеподобные грибы рода Eremothecium ashbyii, входящие в класс аскомицетов, а также бактерии Bacillus subtilis. Витамином В2 обогащают некоторые сорта белого хлеба, его используют для окраски пищевых продуктов в оранжево-желтый цвет.

Каротиноиды – это предшественники витамина А, среди которых наиболее активен β-каротин. В организме человека каротиноиды не синтезируются, поэтому должны поступать извне. В печени каротин превращается в витамин А. Продуцентами каротиноидов могут быть грибы и дрожжи. В промышленности β-каротин чаще всего получают с помощью микроскопического гриба рода Blakeslea trispora.

β-Каротин используют при изготовлении пищевых продуктов как краситель. Его применяют при изготовлении колбас с целью замены нитрита натрия и обеспечения высокой интенсивности и устойчивости цвета. Используют при производстве леденцов, пищевых паст, кексов и других кондитерских изделий. Во многих странах β-каротин применяют для подкрашивания сливочного масла. Кроме того, он обладает антиокислительными свойствами, которые используются для продления срока хранения продукта.

Витамин D2 промышленно синтезируют с помощью дрожжей Saccharomyces serevisiae. Витамин используется для лечения и профилактики рахита человека и животных.

^ 4.3.3 Производство органических кислот

В настоящее время биотехнологическими способами получают в промышленных масштабах ряд органических кислот. Из них лимонную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовую кислоты получают лишь микробиологическим способом, молочную, салициловую и уксусную – как химическим, так и микробиологическим, яблочную – химическим и энзиматическим путем. Уксусную кислоту продуцируют Aсеtobacter и Gluconobacter, лимонную – Aspergillus niger, Aspergillus wentii, молочную – Lactobacillus delbrueckii.

В качестве сырья для получения пищевого уксуса используют виноградное вино, пивное сусло, мед, соки различных фруктов и ягод после спиртового брожения или водный раствор этилового спирта для получения белого уксуса. Кроме спирта среда содержит уксусную кислоту и минеральные соли, в состав которых входят азот, фосфор, сера, марганец, калий. Иногда добавляют источники витаминов в виде различных экстрактов. Спирт служит источником углерода и энергии для бактерий.

Уксусная кислота стала первым микробиологическим продуктом, полученным с помощью иммобилизованных клеток. Этот способ может быть непрерывным и периодическим. В течение длительного времени применяется адсорбирование уксуснокислых бактерий на древесной стружке, древесном угле, коксе и других субстратах, Пропуская раствор этанола через генераторы с иммобилизованными бактериями, получают 10…15%-ный раствор уксусной кислоты. При этом из 100 л безводного спирта теоретически должно быть получено 103 л уксусной кислоты. На практике выход уксуса из 100 л этанола редко превышает 90 л, что связано с переокислением и неполным окислением этанола бактериями, а также с его испарением.

Уксус, полученный при брожении, имеет приятные аромат и вкус, которые обусловливают побочные продукты брожения: сложные эфиры (этилацетат и другие), высшие спирты, органические кислоты.

В столовом уксусе содержится от 5 до 9 % уксусной кислоты. Уксус с концентрацией кислоты от 20 до 30 % получают путем вымораживания исходного раствора. Путем перегонки получают 70…80%-ную уксусную кислоту, называемую уксусной эссенцией. Ледяная уксусная кислота содержит от 98,0 до 99,8 % кислоты.

Уксусную кислоту или уксус широко используют в пищевой промышленности. Уксус, полученный микробиологическим путем (пищевая уксусная кислота, столовый уксус), различается по сортам в зависимости от характера сбраживаемого субстрата. Известен яблочный, виноградный, грушевый и другие сорта уксуса. Уксус также применяют для растворения органических красителей, при получении медикаментов, пластмасс и т.д.

Лимонная кислота широко распространена в природе, относительно много ее содержится в некоторых ягодах, фруктах, особенно в цитрусовых (в лимоне от 5 до 10 %), в листьях и стеблях некоторых растений.

Ранее лимонную кислоту выделяли в виде лимоннокислого кальция из продуктов переработки листьев хлопчатника, стеблей махорки, хвои ели и в значительных количествах из плодов лимонов. Однако это производство является крайне дорогим и небольшим по объему. Поэтому лимонная кислота была дефицитным и дорогим продуктом.

В настоящее время лимонная кислота по объему производства является одним из главных продуктов микробного синтеза, ее общий выпуск в разных странах достигает 400 тыс. тонн в год.

Для получения лимонной кислоты используют микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Ustina и др. В настоящее время основными продуцентами лимонной кислоты являются различные штаммы гриба Aspergillus niger.

Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста грибов-продуцентов минеральными компонентами среды и одновременном избыточном содержании источника углерода. В условиях лимитирования роста гриба недостатком железа и марганца после полного поглощения из среды дефицитного элемента он прекращает расти, однако продолжает потреблять имеющийся в среде источник углерода. При этом в клетках гриба начинает накапливаться лимонная кислота, которая в дальнейшем выделяется в среду.

Посевной материал в виде спор (конидий) выращивают на мелассной среде поверхностным или глубинным способом.

Лимонную кислоту выделяют из культуральной жидкости в виде плохо растворимой соли – цитрата кальция, которая образуется при добавлении мела. Перевод лимонной кислоты в свободное состояние достигается при добавлении строго определенного количества серной кислоты:

Цитрат кальция + Н2SO4 = Цитрат + Гипс.

Гипс удаляют фильтрованием. Раствор лимонной кислоты осветляют активным углем, упаривают, кристаллизуют.

Лимонная кислота используется в кондитерской промышленности для подкисления карамели, пастилы, вафель, так как она хорошо подчеркивает фруктовый вкус. Данную органическую кислоту в целях подкисления добавляют в мороженое, пищевые концентраты, маргарин, некоторые сорта колбас и сыра.

Лимонную кислоту применяют для торможения образования меланоидинов в сгущенном молоке с сахаром, раствором ее промывают и дезодорируют жировое сырье, обрабатывают перед холодным хранением свежее мясо, рыбу, фрукты с целью стабилизации их цвета, вкуса и запаха. Соли лимонной кислоты используют для изготовления шампуней и других моющих средств, так как они стимулируют вспенивание и обеспечивают механическую устойчивость пен.

Молочная кислота с 1881 г. производится промышленным способом с помощью молочнокислых бактерий. Для промышленного изготовления молочной кислоты пригодны только гомоферментативные молочнокислые бактерии, образующие до 98 % молочной кислоты. Применяются штаммы Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus bulgaricus.

Молочнокислые бактерии преобразуют в молочную кислоту самые разные углеводы, поэтому для промышленного получения этой кислоты используют мелассу, молочную сыворотку, глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, осахаренный крахмал и пр.

Молочную кислоту в промышленных условиях получают методом анаэробной глубинной ферментации. Во время ферментации рН среды поддерживают, добавляя мел. Через 6…7 суток культивирования в среде остается от 0,5 до 0,1 % сахаров и от 11 до 14 % лактата кальция. Из 100 г сахаров получают от 80 до 90 г лактата кальция.

Осадок мела и коллоиды отделяют фильтрацией. Фильтрат упаривают, охлаждают и кристаллизуют. Кристаллы лактата отделяют центрифугированием. Молочную кислоту из лактата получают разложением серной кислотой. Реакция идет при температуре от 60 до 70 °С в соответствии с уравнением:

Молочную кислоту обрабатывают активированным углем, фильтруют и фасуют. Конечный продукт – в виде жидкого концентрата молочной кислоты.

Молочную кислоту применяют для приготовления джемов, в которых она способствует хорошей консистенции. Молочная кислота как регулятор рН, улучшитель вкуса применяется в производстве многих сыров, квашении капусты, в сухом концентрате кваса. В хлебобулочном производстве молочная кислота и лактаты увеличивают объем мякиша и улучшают корку хлеба при использовании муки низкого качества. Способность лактатов удерживать влагу применяют в производстве колбас, сыров, детского питания. Молочную кислоту также используют для ускорения получения молочно-белкового сгустка при производстве творога.

Многие первичные метаболиты представляют значительную ценность. Первичные метаболиты синтезируются природными микроорганизмами в количествах, необходимых лишь для удовлетворения их потребностей. Поэтому задача промышленных микробиологов состоит в создании мутантных форм микроорганизмов – сверхпродуцентов соответствующих веществ.
Производство витаминов

Биотехнологическими методами целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В2, В12, β-каротин и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.

Получение витамина В2 (рибофлавин). Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени – 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина – гриб Eremothecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В2. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2 – розеофлавину.

Технология получения. В состав среды для роста продуцентов витамина В2 входят соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфицированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стерилизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики.

В качестве посевного материала используют споры Е. ashbyii. Процесс ферментации грибов для получения кормового рибофлавина длится 3 суток при температуре 28 – 30 °С. Концентрация рибофлавина в культуральной жидкости может достигать 1,4 мг/мл. По завершении процесса ферментации культуральную жидкость концентрируют в вакууме, высушивают на распылительной сушилке (влажность 5 – 10 %) и смешивают с наполнителями.

Методами генной инженерии сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризующийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез рибофлавина и способный синтезировать втрое больше по сравнению с Е. ashbyii количество рибофлавина за 40 ч ферментации.

Получение витамина В12. Первоначально витамин В12 получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Учитывая важную функцию витамина в организме человека (он является противоанемическим фактором), его мировое производство достигло 10 т в год, из которых 6,5 т расходуют на медицинские нужды, а 3,5 т – в животноводстве.

Единственный способ получения витамина В12 в настоящее время – микробиологический синтез. Его продуцентами являются прокариоты и, прежде всего, пропионовые бактерии, которые и в естественных условиях образуют этот витамин. Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12. Мутанты Propionibacterium shermanii и Pseudomonas denitrificans продуцируют в жидкой среде до 58 – 59 мг/л цианкобаламина.

Технология получения. Для получения высокоочищенных препаратов витамина В12 пропионовокислые бактерии культивируют периодическим способом без доступа кислорода на средах, содержащих глюкозу, казеиновый гидролизат, витамины, неорганические соли, хлорид кобальта. Уровень рН ферментационной среды поддерживают около 7,0 добавлением NH4OH; продолжительность ферментации 6 суток; через 3 суток в среду добавляют 5,6-диметилбензимидазол. Добавление в среду предшественника 5,6-диметилбензимидазола по окончании первой ростовой фазы (5 – 6 суток) стимулирует быстрый (18 – 24 ч) синтез витамина с выходом последнего до 30 мг/л.

Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4,5 – 5,0 и температуре 85 – 90 о С, в присутствии стабилизатора (0,25 % раствор натрия нитрита), Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натрия, добавляют коагулянты белка – хлорид железа трехвалентного и алюминия сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3 – 4 о С из в одноацетонового раствора.

При реализации данного биотехнологического процесса не забывать о высокой светочувствительности витамина В12, поэтому все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или при красном свете).

Получение β-каротина. β-Каротин – это изопреноидные соединения, из одной молекулы β-каротина при гидролизе образуются две молекулы витамина A. Каротиноиды можно выделить из ряда растительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны, а также они синтезируются многими пигментными микроорганизмами из родов Aleuria, Blakeslea, Corynebacterium, Flexibacter, Fusarium, Halobacterium, Phycomyces, Pseudomonas, Rhodotorula, Sarcina, Sporobolomyces и др. Характерно, что содержание β-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora – 3 – 8 тыс. мкг.

Каротиноиды локализуются в виде сложных эфиров и гликозидов в клеточной мембране микроорганизмов, либо в гранулах цитоплазмы.

Технология получения. Питательные среды для производства β-каротина включают источники углерода, азота, витаминов, микроэлементов, специальных стимуляторов (кукурузно-соевая мука, растительные масла, керосин, -ионон или изопреновые димеры). В качестве продуцентов каротиноидов можно использовать бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Более часто применяют зигомицеты Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. При совместном культивировании штаммы этих видов могут образовать 3 – 4 г каротина на 1 л среды. Па первом этапе получения каротиноидов штаммы культивируют раздельно, а затем – совместно при 26 о С и усиленной аэрации с последующим переносом в основной ферментатор. Длительность ферментации – 6 – 7 дней. Каротиноиды извлекают ацетоном или другим неполярным растворителем. В целях очистки и более тонкого разделения используют методы хроматографии. Витамин A из β-каротина сравнительно легко можно получить при гидролизе.

Получение витамина D2. Витамин D – это группа родственных соединений, в основе которых находится эргостерин, который обнаружен в клеточных мембранах эукариот. Содержание эргостерина в дрожжевых клетках колеблется в пределах 0,2 – 11 %. Кроме дрожжей продуцентами эрогостерина могут быть мицелиальные грибы – аспергиллы и пенициллы, в которых содержится 1,2 – 2,2 % эргостерина. Трансформация эргостерина в витамин D2 (кальциферол) происходит под влиянием ультрафиолетового облучения. При этом разрывается связь в кольце (позиции 9,10) и образуется двойная связь в боковой цепочке (позиции 22, 23).

Технология получения. В качестве продуцентов эргостерина микробиологическим способом используют культуры дрожжей, которые получают на средах, обеспечивающих полноценное развитие клеток. Основная среда содержит источник углерода и пониженное количество азота (высокое значение C/N), обогащается ацетатом (активатором биосинтеза стеринов). Культивирование дрожжей проводят при температуре, близкой к оптимальной для конкретного штамма, и выраженной аэрации. Спустя 3 – 4 суток, в зависимости от ростовых характеристик и биосинтетической активности культуры, клетки сепарируют и подвергают вакуум-высушиванию. Затем сухие дрожжи облучают ультрафиолетовыми лучами – УФЛ (длина волны 280 – 300 нм) в течение оптимального по продолжительности времени. Облучение дрожжей можно проводить до сепарирования клеток в тонком слое 5 % суспензии, учитывая малую проникающую способность УФЛ.

Производствоорганических кислот

В настоящее время биотехнологическими способами в промышленных масштабах синтезируют ряд органических кислот. Из них лимонную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовую кислоты получают лишь микробиологическим способом, молочную, салициловую и уксусную – как химическим, так и микробиологическим способами, а яблочную – химическим и энзиматическим путем.

Получение лимонной кислоты. Лимонная кислота впервые была выделена из сока лимона и перекристаллизована Шееле. В лимонах содержится 7 – 9 % этой кислоты; в Италии и Испании до сих пор ее получают из лимонов, но на 99 % ее продукция основана на микробиологическом синтезе. Объем мирового производства цитрата составляет 400 тыс. т/год.

Способность грибов образовывать лимонную кислоту при росте на средах с углеводами впервые была установлена немецким ученым Вемером в 1893 г. Для промышленного производства лимонной кислоты используют главным образом культуру гриба Aspergillus niger, а также A. wentii.

Метаболический путь. Лимонная кислота – обычный метаболит цикла трикарбоновых кислот, в небольшом количестве присутствует в клетках разных микроорганизмов. Некоторые грибы (в первую очередь A. niger) способны синтезировать огромное количество этой кислоты. Накопление в культуральной среде существенных количеств цитрата – промежуточного соединения цикла Кребса – невыгодно для организма и является следствием дисбаланса метаболизма или нарушения его генетической природы. Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста грибов-продуцентов минеральными компонентами среды и одновременном избыточном содержании источника углерода. В условиях лимитирования роста гриба недостатком одного или нескольких минеральных компонентов (Fe, Mn, N, Р или S) после полного поглощения из среды дефицитного элемента он прекращает расти, однако продолжает потреблять имеющийся в среде источник углерода. При этом в клетках гриба начинает накапливаться лимонная кислота, которая в дальнейшем выделяется в среду.

Технология получения. В настоящее время получение лимонной кислоты биотехнологическими способами широко применяется в промышленности. Разработаны технологии получения лимонной кислоты как поверхностным, так и глубинным способами. Основной питательной средой в обоих случаях служит меласса – отход сахарного производства, она содержит 48 – 50 % сахара. Для хорошего роста и развития гриба среда должна содержать минеральные соли: NH4Cl, KH2PO4, ZnSO4. В мелассе содержатся соли тяжелых металлов, угнетающие рост гриба и образование лимонной кислоты. Для осаждения этих солей к мелассе добавляют желтую кровяную соль K4[Fe(CN)6].

Процесс ферментации, ведущий к образованию лимонной кислоты, проводят при низких значениях рН (3 – 4), что облегчает поддержание стерильных условий ферментации и уменьшает возможность образования побочных продуктов. Предполагают, что в кислой среде стимулируется гликолиз, что обеспечивает направление потока углерода в цикл Кребса. В щелочной среде происходит накопление щавелевой и глюконовой кислот. В процессе ферментации можно выделить две фазы: 1) активного роста гриба и 2) интенсивного кислотообразования, рост мицелия в этот период становится незначительным.

На первой стадии идет рост мицелия, а на второй, после выхода культуры в стационарную фазу – интенсивный синтез лимонной кислоты. В конце ферментации массу мицелия отделяют путем фильтрования и промывают. Затем при рН

Читайте также: