Комбинационное рассеяние света реферат

Обновлено: 04.07.2024

Обзор

Автор

Редактор

Обратите внимание!

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Если спросить, чем занимаются биофизики, то в большинстве случаев ответ будет — спектрами. А если попробовать уточнить, какими именно спектрами, то варианты ответа будут самыми разнообразными: и спектрами поглощения, и спектрами флуоресценции, инфракрасными, и ультрафиолетовыми, и спектрами электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [1], и спектрами комбинационного рассеяния (КР), и т.д. и т.п. Но в любом случае спектроскопия позволяет исследовать переходы между энергетическими уровнями молекул: электронными, колебательными или вращательными в зависимости от выбранного метода (рис. 1).

При этом выбор метода зависит от конкретной исследовательской задачи. Исторически в нашей группе биофизики клетки (кафедра биофизики биологического ф-та МГУ) изучают конформационные состояния различных биомолекул, используя для этого метод комбинационного рассеяния света (КР, Raman spectroscopy, RS). Итак, что это за метод, и какую информацию можно из него извлечь?

Рисунок 1. Изменение энергии молекулы (ΔЕ) при взаимодействии с квантом света (hν). Каждый спектроскопический метод работает в своем энергетическом диапазоне. Энергии переходов: Е_эл — электронных, Е_кол — колебательных, Е_вр — вращательных, Е_спин — изменения спина. На основе лекций Ф.Ф. Литвина.

Эффект комбинационного рассеяния света

Явление КР основано на эффекте неупругого (рáмановского, или комбинационного*) рассеяния оптического излучения на молекулах вещества. При обычном (упругом, или рэлеевском) рассеянии свет после взаимодействия с веществом обладает той же энергией, что и возбуждающий луч, следовательно, и частота (и длина волны) излучения не меняется. А при неупругом рассеянии в результате взаимодействия света с молекулами вещества частота излучения меняется. В основном свет рассеивается на молекулах вещества без изменения частоты, но небольшая часть фотонов все же меняет свою частоту, что выражается в появлении дополнительных линий (линий КР) на спектре рассеяния. Схематично явление КР изображено на рис. 2.

Рисунок 2. Рассеяние света на молекуле (жёлтый круг), устройство спектров КР* и схема переходов между колебательными подуровнями и электронными уровнями молекулы. S₀ и S₁ — основной и первый возбужденный электронные уровни со структурой колебательных подуровней. Серой пунктирной линией обозначен виртуальный подуровень (в случае, если энергии кванта не хватает для перехода на существующий подуровень). 1 — Поглощение инфракрасного (ИК)-кванта приводит к переходу молекулы на новый колебательный подуровень**. 2 — Стоксово КР наблюдается в случае, если молекула находится в невозбужденном состоянии и при взаимодействии со светом переходит на более высокий колебательный подуровень. Энергия рассеянного света при этом меньше энергии возбуждающего света (зеленый → оранжевый). 3 — Рэлевское рассеяние, не приводящее к изменению энергии (и соответственно, длины волны) возбуждающего света. 4 — Антистоксово КР наблюдается в случае, если молекула находится в возбужденном состоянии и при взаимодействии со светом переходит на нижний колебательный подуровень. В этом случае энергия рассеянного света будет больше энергии возбуждающего света (зеленый → синий). Происходит гораздо реже стоксового из-за разности в заселённости уровней. 5 — Флуоресценция: квант света вызывает электронно-колебательный переход, после чего наблюдается релаксация (бордовая фигурная стрелка) и испускание света с меньшей энергией (синий → красный). Рисунок из [3].

* — Спектры КР представляют как зависимость интенсивности сигнала от частотного сдвига, Δν [см −1 ], а не длины волны. В этом случае спектры не зависят от выбора лазера и их можно сравнивать.

** — Стоит заметить, что колебательные состояния, исследуемые в КР спектроскопии, являются такими же, что и в ИК спектроскопии. Однако колебания, которые сильно проявляются в ИК спектре обычно слабо проявляются в КР спектре и наоборот. Таким образом, КР и ИК спектроскопия — это взаимно дополняющие методы, хотя ИК спектроскопия — это по сути спектроскопия поглощения, а КР — рассеяния света.

Видео о том, как увидеть КР своими глазами

Какую информацию несёт спектр КР?

Рисунок 3. Выявление различных веществ по ключевым пикам на спектре КР сложной смеси. Рисунок из [4] с изменениями.

КР в биологии

Первые биологические эксперименты с использованием метода КР провели еще в 1935-м году на аминокислотах [5]. Но, как известно, работы на изолированных молекулах не столь интересны, как на целых клетках. Давайте порассуждаем: если мы регистрируем спектр КР целой клетки, то какие колебания мы увидим?

Что касается эксклюзивной информации, то это, в первую очередь, информация о конформации (рис. 4) исследуемых молекул и микроокружении функциональных групп. А от этих параметров может зависеть и активность молекул в клетке, и взаимодействие с другими молекулами, т.е. то, что влияет на работу целой клетки. Исследовать конформацию молекул — это сложная экспериментальная задача. Для её решения можно использовать ИК-спектроскопию, но, опять же, только на высушенных образцах. Можно использовать более сложные и дорогие технологии, такие как рентгеноструктурный анализ и ЯМР. Эти методы позволяют получать целостную картину расположения атомов в молекуле, но очевидно, их пока нельзя использовать для изучения молекул в живой клетке. А спектроскопию КР можно — в зависимости от того, в какой конформации находится молекула, атомы будут колебаться по-разному, что отразится на спектрах [7].

In vitro

В настоящее время существует множество работ по исследованию клеток методом КР. Основные направления исследований — это изучение распределения веществ в целой клетке [2]; сравнение нормальных и патологических клеток [9]; изучение динамики некоторых клеточных процессов [3]. Например, КР использовали для выявления патологических или раковых клеток, изучения процессов апоптоза и дифференцировки, изучения распределения лекарств в клетке и т.д. [7, 11–13].

In situ

КР-спектроскопию применяют и для исследования целых органов и тканей, не изымая их из организма. Это возможно благодаря тому, что не нужно специальной подготовки образца, введения специфических меток и т.д. Так, в 2007-м году появился маленький эндоскоп на основе КР-спектрометра для исследования пищевода крыс [14]. А в нашей лаборатории даже удалось зарегистрировать КР от целого сердца [15].

Такая разная спектроскопия КР

Итак, спектроскопия КР позволяет неинвазивно получать уникальную информацию о конформации и микроокружении молекул внутри живых клеток. Однако, как и любой метод, КР имеет свои ограничения. И, в первую очередь, это низкая интенсивность сигнала. Именно эту проблему решают различными модификациями метода КР [9] (рис. 5).

Рисунок 6. Схема установки для изучения одиночных клеток методом RSOT с двумя лучами захвата. Рисунок из [16].

Первый и самый простой способ усилить сигнал КР — использовать резонансную частоту возбуждения. Т.е. когда частота возбуждения попадает в область поглощения вещества, то наблюдается резонансное комбинационное рассеяние (РКР, англ. resonance Raman spectroscopy, RR), интенсивность которого на несколько порядков превышает обычное КР [3].

Второй любопытный способ — это спектроскопия КР с оптическим пинцетом (RSOT — Raman Spectroscopy Optical Tweezers), которая позволяет увеличивать интенсивность КР за счет увеличения времени накопления сигнала от одиночных молекул или клеток в растворе, при этом не осаждая и не фиксируя их [16]. Оптический пинцет — это прибор, который позволяет манипулировать микроскопическими объектами с помощью лазерного света: частички попадают в фокус лазерного луча как в ловушку [17]. Для исследования клеток чаще всего используют два лазерных луча-ловушки, чтобы избежать флуктуаций и вращения объекта (рис. 6). Также с помощью двух лучей можно растягивать клетку. Например, для эритроцита было показано, что растяжение клетки приводит к деоксигенации гемоглобина [18].

Как было показано выше (рис. 2), стоксовые линии КР (ν₀−Δν) гораздо интенсивнее антистоксовых (ν₀+Δν). При этом антистоксовые линии представляют больший интерес, потому что в этой области отсутствует люминесценция образца (из-за Стоксова сдвига). Как же получить интенсивный спектр антистоксового КР? Оказывается, способ есть, и называется он КАРС — когерентное антистоксовое рассеяние света (Сoherent anti-stokes Raman scattering, CARS).

В КАРС-спектроскопии используется не один источник света, а три: первый источник называется волной накачки (pump) — ν₁, второй представляет собой излучение со стоксовой частотой ν₂, а третий — это пробный луч, частота которого плавно изменяется ν’. Эти лучи взаимодействуют друг с другом, а также с колебаниями молекул исследуемого вещества. Если разность частот ν₁−ν₂ входит в резонанс с собственными колебательными частотами молекулы, то возникает интенсивное когерентное (т.е. согласованное по фазе колебаний) антистоксово излучение (с частотой ν₃ = ν₁ − ν₂ + ν’) [19, 20].

Помимо большей интенсивности и отсутствия люминесценции, на спектрах КАРС легче различать близкорасположенные пики, благодаря когерентности рассеянного света, что особенно важно при изучении структурно схожих биомолекул [19]. Большинство современных приложений данного метода связано с изучением липидов. Так, методом КАРС визуализировали движение везикул внутри клеток; процесс дифференцировки жировой ткани; изучали метаболизм липидов, в т.ч. влияние небезызвестной омеги-3; по липидному составу попытались различить здоровую и раковую нервную ткань и т.д. [20].

SERS и TERS

И, наконец, самый мощный способом добиться усиления сигнала КР — поместить молекулу вблизи наночастиц благородных металлов. Для этого есть два способа: поместить наночастицу (НЧ) на поверхность иглы атомно-силового микроскопа [21] и зондировать исследуемые молекулы, регистрируя с них сигнал КР. В этом случае метод будет называться TERS (tip-enhanced Raman spectroscopy). Во втором случае исследуемые молекулы помещают на поверхность НЧ металла и регистрируют КР обычным способом. Этот метод называется гигантское комбинационное рассеяние (ГКР) или SERS (surface enhanced Raman spectroscopy) [9]. На мой взгляд, ГКР — самая удачная разновидность КР, позволяющая получать наибольшее усиление сигнала и обладающая множеством практических применений, поэтому о ней и пойдет речь.

Спектроскопия ГКР: от молекул к клеткам

Впервые явление усиления сигнала КР наблюдал Флейшманн с коллегами, которые опубликовали свое открытие в 1974 году. Они получили сигнал ГКР молекул пиридина, адсорбированного на шероховатом серебряном электроде [24]. Довольно долгое время существовала концепция усиления сигнала КР от молекул, адсорбированных на поверхности электродов и наноструктур. Но для биологии, очевидно, это не самый удачный подход.

В начале 90-х годов с развитием КР-микроскопии метод ГКР применили к живым клеткам. Для изучения живых клеток с помощью спектроскопии ГКР существовало несколько подходов, но все они предполагали введение в клетку НЧ. Одной из первых работ по введению НЧ в клетку путём эндоцитоза была работа нашего соотечественника И.Р. Набиева с соавт. по изучению взаимодействия антибиотика доксорубицина с ДНК на культуре клеток [25]. Позже появляются работы по помещению клеток на особые наноструктурированные поверхности [26, 27]. Однако все они были сопряжены с одной трудностью — расстояние между исследуемой молекулой и наноструктурой должно быть очень маленьким — до 10 нм. Поэтому в этих работах либо изучалось распределение в клетке некоторых веществ, которые сами по себе имели очень интенсивный сигнал КР, либо изучались строение и динамика плазматических мембран, которые как раз и адсорбировались на наноповерхностях. Это значительно ограничивало исследователей, и интерес к использованию ГКР-подложек временно угас.

Тем не менее работы по внутриклеточному ГКР продолжались и на эукариотических клетках, и на бактериях. Основные стратегии эксперимента ГКР на живых клетках показаны на рисунке 7 в хронологическом порядке.

* — Спектр ГКР данной молекулы-репортера известен, а также известно, как он меняется в зависимости от ближайшего окружения молекулы.

Новые концепты

Следует заметить, что большинство стратегий ГКР-измерений на живых клетках представляют собой либо изучение распределения внутри клеток определенной чужеродной молекулы (например, какого-то лекарства), к которой пришиты НЧ. Но то же самое можно сделать и другими более распространенными методами — например, флуоресцентной микроскопией. К тому же внедрённая в клетку металлическая НЧ вряд ли менее токсична, чем флуорофор. Другой подход применения ГКР на живых клетках — регистрация спектров от собственных молекул клетки, например, от всех липидов и всех белков (пептидных связей), находящихся в плазматической мембране или в эндосоме, что тоже сужает круг возможных практических применений метода.

Основная сложность при работе методом ГКР — это необходимость комплексного междисциплинарного подхода. Помимо того, что нужно хорошо разбираться в объекте исследования, для каждого объекта нужны свои уникальные параметры регистрации спектров и самое главное — специальные наноструктуры. Поэтому, чтобы поставить хороший эксперимент, нужно знать и химию, и биологию. И вполне естественно, что любая успешная попытка зарегистрировать какой-то сигнал от биомолекулы — уже большое достижение.

Однако для исследования фундаментальных биологических процессов этого мало. Новый концепт исследований клеток методом ГКР был предложен в 2009-ом году сотрудниками нашей лаборатории Н.А. Браже с соавт. Они показали, что есть сигнал от молекул (собственных молекул клетки), которые находятся непосредственно под мембраной клеток, смешанных с коллоидным раствором наночастиц серебра [36].

И произошло это из любопытства, когда вместо того, чтобы смешать с НЧ серебра раствор гемоглобина, исследователи использовали суспензию эритроцитов — и получили при этом сигнал ГКР гемоглобина. Поначалу это казалось странным, ведь толщина мембраны эритроцита около 10 нм — это как раз то предельное расстояние, на котором может возникать усиление сигнала. Однако такое открытие было связано как с выбором частоты излучения (вспомним резонансное КР), так и с удачной морфологией агрегатов наночастиц серебра на поверхности эритроцитов, ведь от этого зависит расстояние, на котором происходит усиление сигнала КР, и в данном случае оно было заведомо больше 10 нм. А сам сигнал соответствовал не всему гемоглобину в клетке, а только тем молекулам гемоглобина, которые были вблизи мембраны — примембранному гемоглобину (рис. 8).

Рисунок 8. Срез эритроцита в области контакта с НЧ. В эритроците есть два типа гемоглобина: цитоплазматический и примембранный (который составляет не более 0,5% от всего гемоглобина в клетке). Спектр КР эритроцитов — это спектр всего гемоглобина в клетке, точнее, того, которого больше (т.е. цитоплазматического). А спектр ГКР — это спектр того гемоглобина, который ближе к поверхности НЧ, т.е. примембранного гемоглобина. Этого гемоглобина так мало, что увидеть его конформацию другими методами in vivo невозможно. Рисунок из [36].

И в этом основная прелесть и новшество — теперь методом ГКР можно изучать молекулы, которые находятся непосредственно под мембраной живых клеток и мембранных органелл. При этом именно изучать их: исследовать изменения, которые с ними происходят в норме и при патологии.

Подводя итоги

Спектроскопия КР — это яркий пример метода, который обретает вторую жизнь с появлением новых технических возможностей. Благодаря различным модификациям КР, которые позволяют значительно усиливать сигнал, появилась возможность исследовать конформацию различных биомолекул в живых клетках и органах, что недоступно другим методам. А это значит, что с помощью КР мы каждый раз получаем принципиально новые знания о живой системе. Не в этом ли смысл науки?

Читайте также: